પીસીબી ઇલેક્ટ્રોડ્સનો ઉપયોગ કરીને પાણીના નમૂનાઓમાં વાયરલ ન્યુક્લીક એસિડના ઇલેક્ટ્રોકેમિકલ સેન્સિંગ માટે લાંબા સમય સુધી એમ્પલિકોન્સ વધુ સારી સંવેદનશીલતા પ્રદાન કરે છે

Nature.com ની મુલાકાત લેવા બદલ આભાર. તમે જે બ્રાઉઝર સંસ્કરણનો ઉપયોગ કરી રહ્યાં છો તેમાં CSS માટે મર્યાદિત સમર્થન છે. શ્રેષ્ઠ અનુભવ માટે, અમે ભલામણ કરીએ છીએ કે તમે અપડેટ કરેલ બ્રાઉઝરનો ઉપયોગ કરો (અથવા Internet Explorer માં સુસંગતતા મોડ બંધ કરો). તે દરમિયાન, તેની ખાતરી કરવા માટે સતત સમર્થન, અમે શૈલીઓ અને જાવાસ્ક્રિપ્ટ વિના સાઇટ પ્રદર્શિત કરીશું.
કોવિડ-19 રોગચાળાની શરૂઆતથી પર્યાવરણીય નમૂનાઓનું નિરીક્ષણ કરવાના મહત્વની ખૂબ પ્રશંસા કરવામાં આવી છે, અને કેટલાક મોનિટરિંગ પ્રયાસો ગોલ્ડ સ્ટાન્ડર્ડનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવી રહ્યા છે, જોકે qPCR-આધારિત તકનીકો ખર્ચાળ છે. ઇલેક્ટ્રોકેમિકલ DNA બાયોસેન્સર્સ સંભવિત ખર્ચ-અસરકારક પ્રદાન કરી શકે છે. ઓછી અને મધ્યમ આવક ધરાવતા દેશોમાં પર્યાવરણીય પાણીના નમૂનાઓનું નિરીક્ષણ કરવા માટેનો ઉકેલ. આ કાર્યમાં, અમે ENIG નો ઉપયોગ કરીને સ્પાઇકવાળા તળાવના પાણીના નમૂનાઓ (SARS-CoV-2 માટે એક લોકપ્રિય સરોગેટ) માંથી અલગ કરાયેલા Phi6 ફેજમાંથી મેળવેલા એમ્પ્લીકોન્સની ઇલેક્ટ્રોકેમિકલ શોધનું નિદર્શન કરીએ છીએ. સપાટી ફેરફાર વિના PCB ઇલેક્ટ્રોડ્સ પૂર્ણ કરવા.સેક્સ. ઇલેક્ટ્રોકેમિકલ સેન્સર પ્રતિભાવ વિવિધ લંબાઈના બે DNA ટુકડાઓ (\({117}\,\hbox {bp}\) અને \({503}\,\hbox {bp}\)) માટે સંપૂર્ણ રીતે દર્શાવવામાં આવ્યો હતો, અને મિથાઈલીન બ્લુ (MB)-DNA ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ પર PCR માસ્ટર મિક્સમાં ક્ષારની અસર. અમારા પરિણામો દર્શાવે છે કે DNA ટુકડાઓની લંબાઈ નોંધપાત્ર રીતે ઈલેક્ટ્રોકેમિકલ સંવેદનશીલતાને નિર્ધારિત કરે છે અને આ કાર્યમાં દર્શાવે છે કે PCR ઉત્પાદનોના જેલ શુદ્ધિકરણ વિના લાંબા એમ્પ્લિકન્સ શોધવાની ક્ષમતા છે. પાણીના સેમ્પલના સિટુ માપન માટે મહત્વપૂર્ણ.વાયરલ લોડ માટે સંપૂર્ણ સ્વચાલિત ઉકેલ સારી રીતે બતાવે છે.
પોલિયો અને હેપેટાઇટિસ E1 ના પાણીજન્ય પ્રસારણના પ્રથમ પુરાવા સાથે, 1940 થી પાણીજન્ય વાઇરસ ટ્રાન્સમિશનને જાહેર આરોગ્યના જોખમ તરીકે ઓળખવામાં આવે છે. વર્લ્ડ હેલ્થ ઓર્ગેનાઇઝેશન (WHO) એ મધ્યમથી ઉચ્ચ આરોગ્યના મહત્વના કેટલાક પાણીજન્ય વાયરલ પેથોજેન્સનું વર્ગીકરણ કર્યું છે.2. પરંપરાગત વાયરસ તપાસ પદ્ધતિઓ સુવર્ણ-માનક qPCR-આધારિત તકનીકો પર આધાર રાખે છે, જે અત્યંત સંવેદનશીલ અને વિશિષ્ટ છે, પરંતુ ખર્ચાળ સાધનોનો ઉપયોગ કરીને પ્રયોગશાળામાં પરીક્ષણ કરવા માટે કુશળ કર્મચારીઓની જરૂર છે. જો કે, ઓછી અને મધ્યમ આવક ધરાવતા દેશોમાં (LMICs) મર્યાદિત સંસાધનો સાથે, માનવ પર્યાવરણીય પાણીના નમૂનાની દેખરેખ કરતાં નમૂનાનું પરીક્ષણ પ્રાધાન્ય લે તેવી શક્યતા છે. તેથી, ઓછી અને મધ્યમ આવક ધરાવતા દેશોમાં પાણી અને ગંદાપાણીના નમૂનાઓની ટકાઉ, વાસ્તવિક સમયની દેખરેખ માટે વૈકલ્પિક ઓછી કિંમતી પદ્ધતિઓ જરૂરી છે, કારણ કે ઉભરતા રોગના પ્રકોપની પ્રારંભિક ચેતવણીઓ, ત્યાં તેમને વાયરસ રોગચાળાની ગંભીર સામાજિક આર્થિક અસરોથી રક્ષણ આપે છે. ન્યુક્લીક એસિડ માટે ઓછા ખર્ચે ઇલેક્ટ્રોકેમિકલ બાયોસેન્સર આ અપૂર્ણ જરૂરિયાત માટે આશાસ્પદ સંભવિત ઉકેલ પૂરો પાડી શકે છે. આમાંના ઘણા ડીએનએ બાયોસેન્સર એ હકીકત દ્વારા કામ કરે છે કે પૂરક ડીએનએ સેર ઇલેક્ટ્રોડ પર સ્થિર છે. જ્યારે નમૂનામાં મેચિંગ સિક્વન્સ હાજર હોય ત્યારે સપાટી અને વર્ણસંકર થાય છે. આ પછી પોટેશિયમ આયર્ન/ફેરોસાયનાઇડ જેવા રેડોક્સ મધ્યસ્થીઓનો ઉપયોગ કરીને વિવિધ ઇલેક્ટ્રોકેમિકલ તકનીકો દ્વારા સિગ્નલમાં રૂપાંતરિત કરી શકાય છે. મેથિલિન બ્લુ (એમબી) એ આવા જ એક રેડોક્સ-સક્રિય પરમાણુ છે, જે સિંગલ-સ્ટ્રેન્ડેડ ડીએનએ 5,6 સાથે વધુ બિન-વિશિષ્ટ બંધન ઉપરાંત ડબલ-સ્ટ્રેન્ડેડ ડીએનએ (dsDNA) માં ઇન્ટરકેલેટ થવાના અહેવાલ છે. MB-DNA સંકુલ રચવા માટે MBs ની ઇન્ટરકેલેટીંગ પ્રકૃતિ તેમને કેટલાક ઇલેક્ટ્રોકેમિકલ ડીએનએમાં રેડોક્સ મધ્યસ્થી તરીકે લોકપ્રિય પસંદગી બનાવે છે. સેન્સર રૂપરેખાંકન5,6,7,8,9.જોકે MB થી DNA નું આંતરસંબંધ બિન-વિશિષ્ટ છે, અને આ ઇલેક્ટ્રોકેમિકલ સેન્સરની વિશિષ્ટતા મોટે ભાગે પીસીઆર અથવા આઇસોથર્મલ એમ્પ્લીફિકેશન માટે વપરાતા પ્રાઇમરની શુદ્ધતા પર આધારિત છે, તે વાસ્તવિક અમલીકરણ માટે યોગ્ય છે. ડીએનએ એકાગ્રતા માપનના વિકલ્પ તરીકે -સમય ઇલેક્ટ્રોકેમિકલ-આધારિત qPCR અથવા ફ્લોરોસેન્સ આઇસોથર્મલ એમ્પ્લીફિકેશન 9 .આવા એક અમલીકરણમાં, વોન એટ અલ. સોનાના ઇલેક્ટ્રોડ્સની સપાટીને વાસ્તવિક સમય માટે 6-મર્કેપ્ટો-1-હેક્સાનોલ (MCH) સાથે સંશોધિત કરવામાં આવી હતી. ડિફરન્શિયલ પલ્સ વોલ્ટમેટ્રી (DPV) નો ઉપયોગ કરીને MB સાથે PCR એમ્પ્લીકોન્સનું માપન 9. અન્ય કિસ્સાઓમાં, Ramirez et al. સ્ક્રીન-પ્રિન્ટેડ ઇલેક્ટ્રોડ્સ સાથે MB નો ઉપયોગ કરીને RT-LAMP પ્રતિક્રિયા દ્વારા ગંદા પાણીમાં SARS-CoV-2 ની તપાસ. પ્લેટિનમ ઇલેક્ટ્રોડ્સ પણ કરવામાં આવ્યા છે. પ્રતિક્રિયાઓ દરમિયાન ઇલેક્ટ્રોકેમિકલી એમ્પ્લિકોન્સને શોધવા માટે રચાયેલ માઇક્રોફ્લુઇડિક પીસીઆર પ્લેટફોર્મમાં સિટુ ઇલેક્ટ્રોડ્સની જેમ ઉપયોગમાં લેવાય છે 8 .આ તમામ અભ્યાસો માટે ઇલેક્ટ્રોડ્સની સપાટીમાં ફેરફારની જરૂર છે, જે આ કાર્યાત્મક ઇલેક્ટ્રોડ્સની સ્થિરતા માટે વિશેષ સંગ્રહ જરૂરિયાતોને કારણે ઉત્પાદન અને સંચાલન ખર્ચમાં વધારો દર્શાવે છે.
તળાવના પાણીના નમૂનાઓમાં કેન્દ્રિત વાયરલ કણોમાંથી મેળવેલા એમ્પ્લિકોન્સની ઇલેક્ટ્રોકેમિકલ શોધ માટેના કાર્યપ્રવાહની યોજનાકીય.
અમે તાજેતરમાં DPV પર આધારિત ઓછી કિંમતના પ્રિન્ટેડ સર્કિટ બોર્ડ (PCB) ઇલેક્ટ્રોડ્સ સાથે SARS-CoV-2 એમ્પ્લિકોન્સનું ઇલેક્ટ્રોકેમિકલ સેન્સિંગ અને અનમોડિફાઇડ ઇલેક્ટ્રોડ્સની સપાટી પર MB-DNA કોમ્પ્લેક્સના શોષણ દ્વારા પ્રેરિત ચક્રીય વોલ્ટમેટ્રી (CV)નું પ્રદર્શન કર્યું છે. વર્તમાન11.અમે જાણ કરીએ છીએ કે લાંબા DNA ટુકડાઓ (N1-N2, \({943}\, \hbox) સીડીસી-ભલામણ કરેલ N1 ફોરવર્ડ અને N2 રિવર્સ પ્રાઇમર્સનો ઉપયોગ કરીને બનેલા ટૂંકા ટુકડાઓ {bp}\)) સેન્સરના પ્રતિભાવમાં વધુ સારી રેખીયતા દર્શાવે છે. ( N1, \(72\,\hbox {bp}\)) N1 ફોરવર્ડ અને N1 રિવર્સ પ્રાઈમર સેટનો ઉપયોગ કરીને રચાયેલ છે. આ અભ્યાસો ન્યુક્લિઝ-ફ્રી પાણીમાં તૈયાર કરાયેલ ડીએનએ ડિલ્યુશનનો ઉપયોગ કરીને નોંધવામાં આવ્યા છે. પ્લેટફોર્મનો ઉપયોગ SARS-CoV શોધવા માટે પણ કરવામાં આવ્યો હતો. સિમ્યુલેટેડ ગંદાપાણીના નમૂનાઓમાં -2 એમ્પ્લિકોન્સ (સાર્સ-કોવી-2 આરએનએ સાથે કુલ આરએનએ સેમ્પલને સ્પાઇક કરીને મેળવવામાં આવે છે). આરએનએ આઇસોલેશન અને ડાઉનસ્ટ્રીમ પ્રોસેસિંગ દરમિયાન શીયરિંગ માટે સંવેદનશીલ હોવાથી, 12,13 આ વિજાતીય નમૂના સાથે લાંબા ટુકડાને વિસ્તૃત કરવું મુશ્કેલ છે. તેથી, ગંદાપાણીમાં SARS-CoV-2 એમ્પલીકોનના ઇલેક્ટ્રોકેમિકલ સેન્સિંગનું નિદર્શન ટૂંકા \(72\,\hbox {bp}\) N1 ટુકડા સુધી મર્યાદિત છે.
આ કાર્યમાં, અમે ENIG PCB-આધારિત ઇલેક્ટ્રોકેમિકલ સેન્સિંગની સંભવિતતાની તપાસ કરી જે Phi6 કેન્દ્રિત અને તળાવના પાણીના નમૂનાઓથી અલગ પડે છે. Phi6 ફેજ કદમાં (80-100 nm) SARS-CoV-2 સાથે તુલનાત્મક છે અને લિપિડ મેમ્બ્રેન અને સ્પાઇક પ્રોટીન પણ હોય છે. આ કારણોસર, બેક્ટેરિયોફેજ Phi6 એ SARS-CoV-2 અને અન્ય પરબિડીયું પેથોજેનિક આરએનએ વાયરસ 14,15 માટે લોકપ્રિય સરોગેટ છે. ફેજ કણોમાંથી અલગ કરાયેલ આરએનએનો ઉપયોગ cDNA સંશ્લેષણ માટે નમૂના તરીકે કરવામાં આવ્યો હતો. PCR લંબાઈમાં 117 અને 503 બેઝ જોડીના બે ડીએનએ ટુકડાઓ મેળવવા માટે. અમારા અગાઉના કાર્યમાં \(943\,\hbox {bp}\) N1-N2 ટુકડાઓને એમ્પ્લીફાઈંગ કરવાના પડકારને જોતાં, અમે મધ્યવર્તી લંબાઈના ટુકડાઓ (\(117) ને લક્ષ્ય બનાવીએ છીએ. \,\hbox {bp}\) અને \(503 \,\hbox {bp}\)), ઉપલબ્ધ પ્રાઇમર્સ પર આધારિત છે. ઇલેક્ટ્રોકેમિકલ સેન્સર પ્રતિભાવનો વ્યાપક સાંદ્રતા શ્રેણી (\({10}\,{) પર વ્યવસ્થિત રીતે અભ્યાસ કરવામાં આવ્યો હતો. \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) થી \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) માં બંને ટુકડાઓ માટે MB ની હાજરી, સેન્સર પ્રતિભાવ પર મીઠાની અસરને સ્પેક્ટ્રોફોટોમેટ્રિક માપન દ્વારા વર્ગીકૃત કરવામાં આવી છે અને ક્રોસ-વેલિડેટ કરવામાં આવી છે. આ કાર્યના મુખ્ય યોગદાન નીચે મુજબ છે:
ડીએનએ ટુકડાની લંબાઈ અને નમૂનામાં મીઠાની હાજરી સંવેદનશીલતાને ખૂબ અસર કરે છે.અમારા પરિણામો દર્શાવે છે કે ઇલેક્ટ્રોકેમિકલ પ્રવૃત્તિ MB, DNA અને વોલ્ટમેટ્રિક પ્રતિભાવમાં સેન્સરની ક્રિયાપ્રતિક્રિયાના વિવિધ મિકેનિઝમ્સ પર આધારિત છે, DNA સાંદ્રતા અને લંબાઈ પર આધાર રાખે છે, લાંબા ટુકડાઓ સાથે વધુ સંવેદનશીલતા દર્શાવે છે, જોકે મીઠું વચ્ચે ઇલેક્ટ્રોસ્ટેટિક ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ પર નકારાત્મક અસર કરે છે. MB અને DNA.
ડીએનએ એકાગ્રતા અસંશોધિત ઇલેક્ટ્રોડમાં એમબી-ડીએનએ ક્રિયાપ્રતિક્રિયાની પદ્ધતિ નક્કી કરે છે અમે દર્શાવીએ છીએ કે એમબી-ડીએનએ ક્રિયાપ્રતિક્રિયાની વિવિધ પદ્ધતિઓ ડીએનએ સાંદ્રતા પર આધાર રાખે છે. ડીએનએ સાંદ્રતામાં ઓછી માત્રામાં \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox) {l}}}\), અમે અવલોકન કર્યું કે ઇલેક્ટ્રોકેમિકલ વર્તમાન પ્રતિભાવ મુખ્યત્વે ઇલેક્ટ્રોડ પર MB-DNA ના શોષણ દ્વારા નિર્ધારિત કરવામાં આવ્યો હતો, જ્યારે ઓછી સાંદ્રતામાં ઉચ્ચ DNA સાંદ્રતા પર, ઇલેક્ટ્રોકેમિકલ વર્તમાન પ્રતિભાવ રેડોક્સના સ્ટીરિક અવરોધ દ્વારા નક્કી કરવામાં આવ્યો હતો. DNA બેઝ જોડીઓ વચ્ચે MB નિવેશને કારણે પ્રવૃત્તિ.
ENIG PCB-આધારિત ઈલેક્ટ્રોકેમિકલ સેન્સિંગ ઓફ વાઈરલ ન્યુક્લીક એસિડ્સ ઓફ લેક વોટર સેમ્પલ પરિણામ તબક્કો.
અમલીકરણની ઓછી કિંમત અને લાંબા સમય સુધી શેલ્ફ લાઇફ સાથે ઇલેક્ટ્રોડ્સ પર સંપૂર્ણ સ્વચાલિત મોનિટરિંગ સિસ્ટમ્સ, ઓલિગોન્યુક્લિયોટાઇડ્સ અથવા એપ્ટેમર્સમાં એકીકરણની સંભાવના.
Phage Phi6 એ Cytoviridae કુટુંબનો એક પરબિડીયું dsRNA વાયરસ છે જે સ્યુડોમોનાસ સિરીંજને ચેપ લગાડે છે. Phi6 ફેજનો જીનોમ 3 ટુકડાઓના સ્વરૂપમાં અસ્તિત્વમાં છે: S (\(2.95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4.07) \,\hbox {Kb}\)) અને L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\))16,17. Phi6 ફેજ બિન-પેથોજેનિક BSL-1 સ્યુડોમોનાસ તાણને ચેપ લગાડે છે, તેથી તેનો ઉપયોગ કરવો સલામત છે. અને લેબોરેટરીમાં સરળતાથી ઉગાડી શકાય છે. Phage Phi6 અને તેના યજમાન સ્યુડોમોનાસ સિરીંજને ફેલિક્સ ડી'હેરેલે રેફરન્સ સેન્ટર ફોર બેક્ટેરિયલ વાઈરસ, લેવલ યુનિવર્સિટી, કેનેડામાંથી ખરીદવામાં આવ્યા હતા (સંદર્ભ કેન્દ્રના કેટેલોગ નંબરો અનુક્રમે HER-102 અને HER-1102 છે) .Phi6 ફેજ અને તેના યજમાનને સંદર્ભ કેન્દ્ર દ્વારા નિર્દેશન મુજબ પુનઃજીવિત કરવામાં આવ્યું હતું. Phi6 ને પ્લેટ લિસિસ અને એલ્યુશન દ્વારા \(\ લગભગ 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { સાથે અંતિમ ટાઇટર્સ મેળવવા માટે શુદ્ધ કરવામાં આવ્યું હતું. ml}}\) (પ્લેક બનાવતા એકમો/ મિલીલીટર). ઉત્પાદકની સૂચનાઓ અનુસાર GenElute™ યુનિવર્સલ ટોટલ RNA શુદ્ધિકરણ કિટ (સિગ્મા-એલ્ડ્રીચ) નો ઉપયોગ કરીને RNA ને શુદ્ધ કરેલા ફેજ કણોથી અલગ કરવામાં આવ્યું હતું. ટૂંકમાં, શુદ્ધિકરણ ફેજ Phi6 સસ્પેન્શન\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) lysed કરવામાં આવ્યું હતું અને RNA ને રેઝિન કૉલમ સાથે જોડવા દેવા માટે સ્પિન કૉલમ પર lysate લોડ કરવામાં આવ્યું હતું .ત્યારબાદ આરએનએને ઇલ્યુશન સોલ્યુશનમાં એલ્યુટ કરવામાં આવે છે \({ 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) કિટ દ્વારા પ્રદાન કરવામાં આવે છે. \(260\,\hbox {nm}\) પર શોષકતા દ્વારા RNA ની સાંદ્રતાનો અંદાજ કાઢો. RNA માં એલિકોટ્સમાં સંગ્રહિત કરવામાં આવ્યું હતું. ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) આગળનો ઉપયોગ થાય ત્યાં સુધી.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) iScript cDNA સિન્થેસિસ કીટ (બાયો) -રેડ લેબોરેટરીઝ)નો ઉપયોગ ઉત્પાદકની સૂચનાઓને અનુસરીને cDNA સંશ્લેષણ માટે નમૂના તરીકે કરવામાં આવ્યો હતો. ટૂંકમાં, cDNA સંશ્લેષણ પ્રતિક્રિયામાં 3 પગલાંઓ હોય છે: પ્રાઈમિંગ at \({25}\,{^{\circ}\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min} }\) , \({20}\,{\hbox {min}}\) નું રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રિપ્શન \({46}\,{^{\circ }\hbox {C}}\), અને રિવર્સ ધ રેકોર્ડર \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) માં \({1}\,{\hbox {મિનિટ) છે }}\).જ્યારે 1% એગેરોઝ જેલ પર ચલાવવામાં આવે છે, ત્યારે cDNA એ અપેક્ષિત ત્રણ આરએનએ ટુકડાઓને અનુરૂપ ત્રણ બેન્ડ્સ દર્શાવ્યા હતા (ડેટા બતાવ્યા નથી). નીચેના પ્રાઇમર્સનો ઉપયોગ 117 અને 503 bp લંબાઈના બે DNA ટુકડાઓને વિસ્તૃત કરવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો, miniPCR® mini8 થર્મલ સાયકલમાં PCR માટે નમૂના તરીકે cDNA નો ઉપયોગ કરવો:
\(117\,\hbox {bp}\) અને \(503\,\hbox {bp}\) માટેના પ્રાઈમર M સેગમેન્ટના 1476-1575 ન્યુક્લિયોટાઈડ અને L સેગમેન્ટના 458-943 ન્યુક્લિયોટાઈડ, અનુક્રમે એસિડને અનુરૂપ છે. .તમામ એમ્પ્લીફાઈડ પીસીઆર ઉત્પાદનો 1% એગેરોઝ જેલ્સ પર ઇલેક્ટ્રોફોરેસ કરવામાં આવ્યા હતા, અને જીનજેટ જેલ એક્સટ્રેક્શન કિટ (થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક) નો ઉપયોગ કરીને એમ્પ્લીફાઈડ લક્ષ્ય DNA શુદ્ધ કરવામાં આવ્યા હતા.
IIT મુંબઈ કેમ્પસ (પવઈ તળાવ, પવઈ, મુંબઈ) ખાતેના તળાવનો ઉપયોગ ફેજ કણો ઉમેરવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો. તળાવના પાણીને \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) પટલ દ્વારા ફિલ્ટર કરવામાં આવ્યું હતું. સસ્પેન્ડેડ કણો, અને પછી Phi6 ફેજ ઉમેરવામાં આવ્યું હતું. \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} માંથી \({1}\,{\hbox {ml}}\) ઉમેરો \) થી \({100}\ ,{\hbox {ml}}\) ફિલ્ટર કરેલ તળાવનું પાણી, \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\) માં).એક નાનું અલિક્વોટ હતું પ્લેક એસે દ્વારા વાયરલ લોડ માપન માટે આરક્ષિત. અમે સ્પાઇક્ડ Phi6 વાયરસ કણોને કેન્દ્રિત કરવા માટે બે અલગ અલગ પદ્ધતિઓનું પરીક્ષણ કર્યું: (1) એલ્યુમિનિયમ હાઇડ્રોક્સાઇડ શોષણ-વરસાદ પદ્ધતિ, 19 જે પર્યાવરણીય નમૂનાઓમાંથી ઘણા પરબિડીયું આરએનએ વાયરસની સાંદ્રતા માટે માન્ય કરવામાં આવી છે, અને (2) ) પોલિઇથિલિન ગ્લાયકોલ (PEG) આધારિત વાયરસ સાંદ્રતા પદ્ધતિ ફ્લડ એટ અલમાંથી સ્વીકારવામાં આવી હતી.20 .કારણ કે PEG-આધારિત પદ્ધતિની પુનઃપ્રાપ્તિ કાર્યક્ષમતા એલ્યુમિનિયમ હાઇડ્રોક્સાઇડ પદ્ધતિ કરતાં વધુ સારી હોવાનું જણાયું હતું, PEG-આધારિત પદ્ધતિનો ઉપયોગ તળાવના પાણીના નમૂનાઓમાંથી Phi6 કણોને કેન્દ્રિત કરવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો.
ઉપયોગમાં લેવાતી PEG પદ્ધતિ નીચે મુજબ હતી: PEG 8000 અને \(\hbox {NaCl}\) 8% PEG 8000 અને \(0.2\,\hbox {M} \) મેળવવા માટે Phi6-સ્પાઇકવાળા તળાવના પાણીના નમૂનાઓમાં ઉમેરવામાં આવ્યા હતા. \ hbox {NaCl}\). નમૂનાઓ શેકર પર ઉકાળવામાં આવ્યા હતા\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), પછી \(4700 \,\hbox {g}\) પર સેન્ટ્રીફ્યુજ થાય છે \({45}\,{\hbox {min}}\). સુપરનેટન્ટને કાઢી નાખો અને પેલેટને \({1}\, {\hbox {ml}}\) એ જ સુપરનેટન્ટમાં. બધા સ્પાઇકિંગ અને વાયરસ સાંદ્રતા પ્રયોગો ત્રિપુટીમાં કરવામાં આવ્યા હતા. એકાગ્રતા પછી, પ્લેક એસે દ્વારા પુનઃપ્રાપ્તિ કાર્યક્ષમતા માપવા માટે એક નાનો અલિકોટ આરક્ષિત કરવામાં આવ્યો હતો. આરએનએ અગાઉ વર્ણવ્યા પ્રમાણે અલગ કરવામાં આવ્યું હતું અને એલ્યુટેડ હતું. કિટ-સપ્લાય કરેલ ઇલ્યુશન બફર\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\).કારણ કે આરએનએ સાંદ્રતા નમૂનાથી નમૂનામાં ટ્રિપ્લિકેટમાં બદલાશે, \({2}\,{\upmu \ RNA ના hbox {l}}\) નો ઉપયોગ ત્રણેય માટે થાય છે તેની સાંદ્રતા cDNA ના નમૂનાઓના સંશ્લેષણને ધ્યાનમાં લીધા વગર. cDNA સંશ્લેષણ અગાઉ વર્ણવ્યા પ્રમાણે કરવામાં આવ્યું હતું.\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNA \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) \(117\,\hbox {bp}\) અને \(503\,\hbox { ને વિસ્તૃત કરવા માટે 35 ચક્રો માટે PCR માટે નમૂના તરીકે ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો. bp}\) ટુકડાઓ. આ નમૂનાઓને "1:1″ તરીકે રજૂ કરવામાં આવે છે, એટલે કે મંદન વિના. એક નો-ટેમ્પલેટ કંટ્રોલ (NTC) નેગેટિવ કંટ્રોલ તરીકે સેટ કરવામાં આવ્યો હતો, જ્યારે RNA નો ઉપયોગ કરીને શુદ્ધ થયેલ ફેજથી અલગ કરાયેલા સીડીએનએનું સંશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું. પોઝિટિવ કંટ્રોલ (PC) માટેના નમૂના તરીકે. બ્રિલિયન્ટ III અલ્ટ્રા-ફાસ્ટ SYBR ગ્રીન ક્યુપીસીઆર માસ્ટર મિક્સ (એજિલેન્ટ ટેક્નોલોજીસ) નો ઉપયોગ કરીને સ્ટ્રેટેજિન Mx3000P RT-PCR સાધનમાં ક્વોન્ટિટેટિવ ​​PCR (qPCR) કરવામાં આવ્યું હતું. પ્રતિક્રિયાઓ અગાઉની જેમ ત્રિપુટીમાં સેટ કરવામાં આવી હતી. વર્ણવેલ છે. બધા નમૂનાઓ માટે ચક્ર થ્રેશોલ્ડ (Ct) રેકોર્ડ કરવામાં આવ્યો હતો. વધુમાં, પાતળું નમૂનાઓ \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNA નો ઉપયોગ કરીને ફિલ્ટર કરેલ તળાવના પાણીમાં 1:100 પાતળું કરવામાં આવ્યું હતું. \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) 35 ચક્ર માટે PCR. આ નમૂનાઓને “1:100″ તરીકે રજૂ કરવામાં આવે છે.
PCB ઇલેક્ટ્રોડને વધારાના ગોલ્ડ પ્લેટિંગની જરૂર વગર વ્યાપારી રીતે ઉપલબ્ધ ઓછી કિંમતની ઇલેક્ટ્રોલેસ નિકલ ઇમર્સન ગોલ્ડ (ENIG) પ્રક્રિયાનો ઉપયોગ કરીને બનાવટ કરવામાં આવે છે. ENIG PCB ઇલેક્ટ્રોડના સ્પષ્ટીકરણો અમારા અગાઉના કાર્યમાં વિગતવાર છે11. ENIG PCB ઇલેક્ટ્રોડ્સ માટે, પરંપરાગત ઇલેક્ટ્રોડ સફાઈ પદ્ધતિઓ જેમ કે પિરાન્હા સોલ્યુશન અથવા સલ્ફ્યુરિક એસિડ ચક્રીય વોલ્ટમેટ્રીની ભલામણ કરવામાં આવતી નથી કારણ કે તે પાતળા સોનાના પડને છાલનું કારણ બની શકે છે (જાડાઈ \(\અંદાજે\) \(100\,\hbox {nm }\)) અને અંતર્ગત તાંબાના સ્તરોને બહાર કાઢે છે જે સંભવિત છે. કાટ માટે 21, 22, 23, 24, 25. તેથી, IPA સાથે ભેજવાળા લિન્ટ-ફ્રી કાપડ વડે ઇલેક્ટ્રોડ્સ સાફ કરો. પરીક્ષણ કરવા માટેનો નમૂનો \({50}\,{\upmu \hbox {M}} સાથે ઉકાળવામાં આવ્યો હતો. }\) સરળ નિવેશ માટે \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) માં MB. અમારા અગાઉના કાર્યમાં , અમે અવલોકન કર્યું છે કે MB સાંદ્રતા 11 વધારીને સેન્સરની સંવેદનશીલતા અને રેખીયતામાં સુધારો થયો છે .અમારા અગાઉના કાર્યમાં નોંધાયેલા ઑપ્ટિમાઇઝેશનના આધારે, અમે \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB નો ઉપયોગ કર્યો છે. આ અભ્યાસમાં ડીએનએને એમ્બેડ કરવા માટે સાંદ્રતા. ડબલ-સ્ટ્રેન્ડેડ ડીએનએ (ડીએસ-ડીએનએ) ની ઇલેક્ટ્રોકેમિકલ શોધ એનિઓનિક અથવા કેશનિક ઇન્ટરકેલેટરનો ઉપયોગ કરીને પ્રાપ્ત કરી શકાય છે. જો કે એનિઓનિક ઇન્ટરકેલેટર વધુ સારી પસંદગી સાથે ડીએનએ શોધે છે, તેઓને રાતોરાત ઇન્ક્યુબેશનની જરૂર પડે છે, પરિણામે લાંબા સમય સુધી તપાસ કરવામાં આવે છે. બીજી તરફ, કેશનીક ઇન્ટરકેલેટર જેમ કે MB ને ds-DNA6 ની વિદ્યુતરાસાયણિક તપાસ માટે, આશરે \({1}\,{\hbox {h}}\) ટૂંકા ઇન્ક્યુબેશન સમયની જરૂર પડે છે. દરેક માપમાં પરીક્ષણ કરવા માટેના નમૂનાને વિતરિત કરવાનો સમાવેશ થાય છે. ઇલેક્ટ્રોડ\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), પછી બીજા નમૂના સાથે આગળ વધતા પહેલા, IPA- ભેજવાળા રાગથી સાફ કરો.એક માપ. દરેક નમૂનાનું પરીક્ષણ 5 જુદા જુદા ઇલેક્ટ્રોડ પર કરવામાં આવ્યું હતું સિવાય કે અન્યથા જણાવ્યું હોય. DPV અને CV માપન PalmSens Sensit Smart potentiostat નો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યું હતું, અને PSTrace સોફ્ટવેરનો ઉપયોગ potentiostat રૂપરેખાંકન અને ડેટા સંપાદન માટે કરવામાં આવ્યો હતો, જેમાં પીક વર્તમાન ગણતરીઓનો સમાવેશ થાય છે. નીચેની સેટિંગ્સનો ઉપયોગ કરવામાં આવે છે. DPV અને CV માપન માટે:
DPV: સંતુલન સમય = \(8\,\hbox {s}\), વોલ્ટેજ સ્ટેપ = \(3\,\hbox {mV}\), પલ્સ વોલ્ટેજ = \(25\,\hbox {mV}\) , પલ્સ અવધિ = \(50\,\hbox {ms}\), સ્કેન દર = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: સંતુલન સમય = \(8\,\hbox {s}\), વોલ્ટેજ પગલું = \(3\,\hbox {mV}\), સ્વીપ રેટ = \({300}\,\hbox {mV/s }\)
\({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ સાથે સંકુલિત DNA ના વોલ્ટામોગ્રામ્સમાંથી મેળવેલ પીક કરંટ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
DPV અને CV વોલ્ટમમોગ્રામ્સ ENIG PCB ઇલેક્ટ્રોડ્સ \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB ડીએનએ (10–\({20}\,{\ hbox {ng ની સાંદ્રતા પર) સાથે સંકુલિત પર મેળવવામાં આવ્યા હતા. }/{\upmu \hbox {l}}}\) એટલે કે 0.13–\({0.26}\,{\upmu \hbox {M}}\) \(117\,\hbox {bp}\ ) અને 0.03 માટે –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) \(503\,\hbox {bp}\) માટે).પ્રતિનિધિ વોલ્ટામોગ્રામ પૂરક માહિતીમાં આકૃતિ S1 માં દર્શાવવામાં આવ્યા છે. આકૃતિ 2 પરિણામો બતાવે છે. જેલ-પ્યુરિફાઇડ પીસીઆર ઉત્પાદનોનો ઉપયોગ કરીને DPV અને CV માપન (પીક કરંટ). બૉક્સપ્લૉટમાં દરેક બૉક્સ માટે 5 ઇલેક્ટ્રોડના માપનો સમાવેશ થાય છે. ઇલેક્ટ્રોડ-ટુ-ઇલેક્ટ્રોડ ભિન્નતાને કારણે માપન ભૂલોને ટાળવા માટે તમામ માપ ઇલેક્ટ્રોડ્સના સમાન સમૂહનો ઉપયોગ કરે છે. અમે ડીએનએની ઓછી સાંદ્રતા માટે DPV અને CV માપેલા પીક કરંટમાં વધતા વલણને અવલોકન કર્યું છે. , લાંબા સમય સુધી (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\\(117) ) ટુકડાની તુલનામાં. આ અમારા અગાઉના કાર્યમાં નોંધાયેલા ઇલેક્ટ્રોડ શોષણના અપેક્ષિત વલણ સાથે સુસંગત છે. MB-DNA કોમ્પ્લેક્સનું શોષણ ઇલેક્ટ્રોડ પર ચાર્જ ટ્રાન્સફરની સુવિધા આપે છે, જે પીક કરંટના વધારામાં ફાળો આપે છે. અન્ય અભ્યાસોએ MB-DNA ઇન્ટરકેલેશન પર ઓલિગોન્યુક્લિયોટાઇડ કદ અને ક્રમની અસર દર્શાવી છે. 27,28,29,30. ગ્વાનિન - બે એમ્પ્લિકોન્સ (\(117\,\hbox {bp}\) અને \(503\,\hbox {bp}\)) ની સામગ્રી લગભગ 50% હતી, જે દર્શાવે છે કે અવલોકન આ તફાવતને કારણે છે. જો કે, ઉચ્ચ ડીએનએ સાંદ્રતા માટે (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), \(503\,\hbox {bp}) માટે \) અને \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) \(117\,\hbox {bp}\) માટે), અમે બે એમ્પ્લીફિકેશન અવલોકન કરીએ છીએ DPV અને CV બંને માપમાં સબ્સનો પીક કરંટ ઓછો થાય છે. આનું કારણ એ છે કે MB સંતૃપ્ત થાય છે અને DNA ના બેઝ જોડી વચ્ચે ઇન્ટરકેલેટ થાય છે, પરિણામે MB31,32 માં રિડ્યુસિબલ ગ્રૂપની રેડોક્સ પ્રવૃત્તિને સ્ટીરિક અવરોધે છે.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
પીસીઆર માસ્ટર મિક્સમાં હાજર ક્ષાર એમબી અને ડીએનએ વચ્ચેના ઇલેક્ટ્રોસ્ટેટિક ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓમાં દખલ કરે છે, તેથી \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) સાથે \({50} \,{\) ઉમેરીને upmu \hbox {M}}\) MB-DNA ક્રિયાપ્રતિક્રિયા પર મીઠાની અસરનો અભ્યાસ કરવા માટે MB જેલ-શુદ્ધ ઉત્પાદન. આકૃતિ 3 માં બતાવ્યા પ્રમાણે, અમે અવલોકન કર્યું કે ઉચ્ચ DNA સાંદ્રતા (\(>{2}\,{\) hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) અને \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) માટે \(117\,\hbox {bp} \)), DPV અને CV માં મીઠું ઉમેરવાથી માપને નોંધપાત્ર રીતે અસર થઈ નથી (પ્રતિનિધિ વોલ્ટેમોગ્રામ માટે પૂરક માહિતીમાં આકૃતિ S2 જુઓ). જો કે, અહીં ઓછી ડીએનએ સાંદ્રતા, મીઠું ઉમેરવાથી સંવેદનશીલતામાં નોંધપાત્ર ઘટાડો થાય છે, પરિણામે ડીએનએ સાંદ્રતા સાથે વર્તમાનમાં કોઈ નોંધપાત્ર ફેરફાર થતો નથી. MB-DNA ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ અને આંતરસંવાદ પર મીઠાની સમાન નકારાત્મક અસરો અગાઉ અન્ય સંશોધકો દ્વારા નોંધવામાં આવી છે33,34.\(\hbox { Mg}^{2+}\) કેશન્સ ડીએનએના નેગેટિવ ફોસ્ફેટ બેકબોન સાથે જોડાય છે, જેનાથી એમબી અને ડીએનએ વચ્ચેની ઈલેક્ટ્રોસ્ટેટિક ક્રિયાપ્રતિક્રિયાને અવરોધે છે. ઉચ્ચ ડીએનએ સાંદ્રતા પર, રેડોક્સ-સક્રિય એમબીના સ્ટેરિક નિષેધ નીચા પીક કરંટમાં પરિણમે છે, તેથી ઈલેક્ટ્રોસ્ટેટિક ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ સેન્સરના પ્રતિભાવને નોંધપાત્ર રીતે અસર કરતા નથી. મુખ્ય મુદ્દો એ છે કે આ બાયોસેન્સર ઉચ્ચ ડીએનએ સાંદ્રતા શોધવા માટે વધુ યોગ્ય છે (ભાગ્યે જ \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) અથવા વધુ), પર્યાવરણીય પાણીના નમૂનાઓની સંપૂર્ણ સ્વચાલિત પ્રક્રિયા માટે, જ્યાં પીસીઆર ઉત્પાદનોનું જેલ શુદ્ધિકરણ શક્ય ન હોય.
\({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB સાથે સંકુલિત ડીએનએની વિવિધ સાંદ્રતા માટે તરંગલંબાઇ શ્રેણી 600–700 \(\hbox {nm}\) માટે શોષણ વળાંક હેઠળનો વિસ્તાર: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) મીઠું સાથે અને વગર (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) મીઠા સાથે અને વગર (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) DNA સાંદ્રતા \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB નમૂનાઓ કોઈ DNA નથી.
ઉપરોક્ત પરિણામોને વધુ ચકાસવા માટે, અમે UV/Vis સ્પેક્ટ્રોફોટોમીટર (થર્મો સાયન્ટિફિક મલ્ટિસ્કન GO) નો ઉપયોગ કરીને ઓપ્ટિકલ માપન કર્યું, દરેક માટે નમૂનાઓ \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) નો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો. માપન. DNA સાંદ્રતામાં વધારો સાથે શોષણ સહી ઘટે છે, જેમ કે તરંગલંબાઇ શ્રેણી \(600\,\hbox {nm}\) થી \(700\,\hbox {) માટે શોષણ વળાંક હેઠળના વિસ્તારના વલણ પરથી જોઈ શકાય છે. nm}\) , ફિગ. 4 માં બતાવ્યા પ્રમાણે (પૂરક માહિતીમાં ફિગ. S3 માં શોષણ સ્પેક્ટ્રમ દર્શાવેલ છે). \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox) કરતાં ઓછી ડીએનએ સાંદ્રતાવાળા નમૂનાઓ માટે {l}}}\), DNA-સમાવતી અને MB-માત્ર નમૂનાઓ (\(503\,\hbox {bp}\) અને \(117\,\hbox {bp}\ માટે) વચ્ચેના ઉપાડમાં કોઈ નોંધપાત્ર તફાવત નહોતો. ) લંબાઈના ટુકડા), જે રેડોક્સ-સક્રિય એમબીના સ્ટેરિક અવરોધની ગેરહાજરી દર્શાવે છે. ઉચ્ચ ડીએનએ સાંદ્રતા પર, અમે શોષક સંકેતમાં ધીમે ધીમે ઘટાડો જોયો અને મીઠાની હાજરીમાં શોષણમાં ઓછો ઘટાડો નોંધ્યો. આ પરિણામો પરમાણુને આભારી હતા. ડીએનએ હાઇબ્રિડ્સમાં બેઝ સ્ટેકીંગ સાથેની ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ અને સ્ટેરિક અવરોધ. અમારા પરિણામો MB-DNA ઇન્ટરકેલેશનના સ્પેક્ટ્રોસ્કોપિક અભ્યાસો પરના સાહિત્યમાં અહેવાલો સાથે સુસંગત છે જે \(\pi\)–\(\pi ^*\) માં ઘટેલા ઉર્જા સ્તરો સાથે હાઇપોક્રોમેટિકિટીને સાંકળે છે. ઇન્ટરકેલેશન સ્તરો 36, 37, 38ને કારણે ઇલેક્ટ્રોનિક સંક્રમણો.
ફેજ Phi6 નું એગેરોઝ જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ: તળાવના પાણીના નમૂનાઓમાંથી \(117\,\hbox {bp}\) અને \(503\,\hbox {bp}\) લંબાઈના PCR ઉત્પાદનો.M-DNA માર્કર;NTC-નો-ટેમ્પલેટ કંટ્રોલ, અનુરૂપ amplicons ધરાવતા પ્રાઇમર્સ;પીસી હકારાત્મક નિયંત્રણ;1, 2, 3-અનડિલ્યુટેડ (1:1) સ્પાઇક્ડ તળાવના પાણીના નમૂનાઓ ત્રિપુટીમાં. \(503\,\) માં ન વપરાયેલ ઓલિગોન્યુક્લિયોટાઇડ્સને કારણે \(\લગભગ 50\,\hbox {bp}\) પર એક બેન્ડ દેખાય છે. hbox {bp}\) લેન.
અમે Phi6 ફેજ સાથે સ્પાઇક કરેલા પવઇ તળાવના પાણીના નમૂનાઓનો ઉપયોગ કરીને સેન્સરની ઉપયોગિતાનું મૂલ્યાંકન કર્યું. ફેજ-સ્પાઇકવાળા પાણીના નમૂનાઓથી અલગ કરાયેલ આરએનએ સાંદ્રતા 15.8–\({19.4}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox { ml}}\), જ્યારે પ્યુરિફાઇડ ફેજ સસ્પેન્શનથી અલગ હોય ત્યારે RNA અંદાજે 1 ની પુનઃપ્રાપ્તિ કાર્યક્ષમતા સાથે \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) હોવાનો અંદાજ હતો. %.RNA ને cDNA માં રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રાઇબ કરવામાં આવ્યું હતું અને PCR અને qPCR માટે ટેમ્પલેટ તરીકે ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો. સેન્સર સાથે પરીક્ષણ પહેલાં એગેરોઝ જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ (આકૃતિ 5) દ્વારા ઉત્પાદનના કદની પુષ્ટિ કરવામાં આવી હતી. આ નમૂનાઓ જેલ શુદ્ધ નથી અને તેથી PCR ના તમામ ઘટકો ધરાવે છે. તેમજ રસના એમ્પ્લીકોન્સ. qPCR (કોષ્ટક 1) દરમિયાન રેકોર્ડ કરાયેલા Ct મૂલ્યો સંબંધિત સ્પાઇક્ડ પાણીના નમૂનાઓમાંથી અલગ કરાયેલા RNA ની સાંદ્રતા સાથે સહસંબંધ દર્શાવવામાં આવ્યા હતા. Ct મૂલ્ય ફ્લોરોસન્ટ સિગ્નલ માટે જરૂરી ચક્રની સંખ્યા દર્શાવે છે. થ્રેશોલ્ડ અથવા બેકગ્રાઉન્ડ સિગ્નલને ઓળંગો. ઉચ્ચ Ct મૂલ્યો નીચા નમૂનાની સાંદ્રતા દર્શાવે છે અને ઊલટું. NTC નમૂનાઓના Ct મૂલ્યો અપેક્ષા મુજબ ઊંચા હતા. \(\અંદાજે 3\) Ct મૂલ્યો વચ્ચેનો તફાવત પોઝિટિવ કંટ્રોલ અને ટેસ્ટ સેમ્પલ વધુમાં દર્શાવે છે કે દરેક ટેસ્ટ સેમ્પલમાં પોઝિટિવ કંટ્રોલની સરખામણીમાં અંદાજે 1% ટેમ્પલેટ છે. અમે અગાઉ ચર્ચા કરી છે કે લાંબા એમ્પ્લિકન્સ વધુ સારી સંવેદનશીલતા તરફ દોરી જાય છે. ગેરફાયદાને જોતાં વિજાતીય પર્યાવરણીય નમૂનાઓથી અલગ કરાયેલા લાંબા ટુકડાઓનું એમ્પ્લીફિકેશન પડકારજનક છે. ઓછી વાયરલ સાંદ્રતા અને આરએનએ ડિગ્રેડેશન. જો કે, અમારા વાયરસ સંવર્ધન અને PCR એમ્પ્લીફિકેશન પ્રોટોકોલ સાથે, અમે ઇલેક્ટ્રોકેમિકલ સેન્સિંગ માટે \(503\,\hbox {bp}\) ટુકડાને સફળતાપૂર્વક વિસ્તૃત કરવામાં સક્ષમ હતા.
આકૃતિ 6 એ \(503\,\hbox {bp}\) ફ્રેગમેન્ટ એમ્પ્લીકોનના ઇલેક્ટ્રોકેમિકલ સેન્સર પરિણામો બતાવે છે, બંને ટેમ્પલેટ (1:1) તરીકે undiluted cDNA અને ટેમ્પલેટ તરીકે 100-fold diluted cDNA (1:100) PCR પરફોર્મ કરે છે. , NTC અને PC ની સરખામણીમાં (પ્રતિનિધિ વોલ્ટેમોગ્રામ માટે પૂરક માહિતીમાં આકૃતિ S4 જુઓ). આકૃતિ 6 માં બોક્સપ્લોટમાંના દરેક બોક્સમાં 5 ઇલેક્ટ્રોડ પરના ત્રણ નમૂનાઓનું માપન છે. ઇલેક્ટ્રોડને કારણે ભૂલો ટાળવા માટે સમાન ઇલેક્ટ્રોડનો ઉપયોગ તમામ નમૂનાઓને માપવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો. -થી-ઇલેક્ટ્રોડ ભિન્નતા.CV માપનની તુલનામાં, DPV માપન NTCs થી પરીક્ષણ અને PC નમૂનાઓને અલગ પાડવા માટે વધુ સારું રીઝોલ્યુશન દર્શાવે છે કારણ કે, અગાઉ ઉલ્લેખ કર્યો છે તેમ, ફેરાડેઇક પ્રવાહો પાછળના ભાગમાં પૃષ્ઠભૂમિ કેપેસિટીવ પ્રવાહોને કારણે છુપાયેલા છે. લાંબા સમય સુધી એમ્પ્લિકન્સ માટે, અમે અવલોકન કર્યું કે નેગેટિવ કંટ્રોલ (NTC) નું પરિણામ સકારાત્મક નિયંત્રણની તુલનામાં ઉચ્ચ CV અને DPV પીક કરંટમાં પરિણમ્યું, જ્યારે સકારાત્મક અને અનડિલ્યુટેડ ટેસ્ટ સેમ્પલ DPV પીક કરંટની સમાન ટોચની ઊંચાઈ દર્શાવે છે. દરેક અનડિલ્યુટેડ (1:1) માટે માપવામાં આવેલ સરેરાશ અને સરેરાશ મૂલ્યો NTC નમૂના માટે સેન્સર આઉટપુટમાંથી ) પરીક્ષણ નમૂના અને PC સ્પષ્ટ રીતે ઉકેલી શકાય છે, જ્યારે 1:100 પાતળું નમૂના માટેનું રીઝોલ્યુશન ઓછું ઉચ્ચારણ છે. cDNA ના 100-ગણા મંદન માટે, અમે જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ દરમિયાન કોઈપણ બેન્ડનું અવલોકન કર્યું નથી. (આકૃતિ 5 માં બતાવેલ લેન નથી), અને અનુરૂપ DPV અને CV પીક કરંટ NTC માટે અપેક્ષિત સમાન હતા. \(117\,\hbox {bp}\) ટુકડા માટેના પરિણામો પૂરક માહિતીમાં દર્શાવવામાં આવ્યા છે. નકારાત્મક ઇલેક્ટ્રોડ પર ફ્રી MB ના શોષણ અને સિંગલ-સ્ટ્રેન્ડ પ્રાઇમર ઓલિગોન્યુક્લિયોટાઇડ સાથે MB ની ક્રિયાપ્રતિક્રિયાને કારણે PCB સેન્સર તરફથી નિયંત્રણ ઇલેક્ટ્રોકેમિકલ પ્રતિભાવને પ્રેરિત કરે છે. તેથી, દરેક વખતે જ્યારે નમૂનાનું પરીક્ષણ કરવામાં આવે છે, ત્યારે નકારાત્મક નિયંત્રણ ચલાવવું આવશ્યક છે અને પરીક્ષણ નમૂનાને હકારાત્મક અથવા નકારાત્મક તરીકે વર્ગીકૃત કરવા માટે વિભેદક (સંબંધિત) માપન હાંસલ કરવા માટે નકારાત્મક નિયંત્રણ દ્વારા મેળવેલા પીક વર્તમાનની તુલનામાં પરીક્ષણ નમૂનાનો ટોચનો પ્રવાહ.
(a) DPV, અને (b) તળાવના પાણીના નમૂનાઓમાં \(503\,\hbox {bp}\) ટુકડાઓની વિદ્યુત રાસાયણિક શોધ માટે CV પીક કરંટ. પરીક્ષણ નમૂનાઓ ત્રિપુટીમાં માપવામાં આવ્યા હતા અને કોઈ ટેમ્પલેટ નિયંત્રણો (NTC) અને તેની સરખામણીમાં નથી. હકારાત્મક નિયંત્રણો (PC).
અમારા તારણો યુવી/વિઝ સ્પેક્ટ્રોફોટોમીટરનો ઉપયોગ કરીને ઓપ્ટિકલ માપન દ્વારા ચકાસાયેલ સાંદ્રતા સાથે, વિવિધ ડીએનએ માટે વિવિધ લંબાઈના એમ્પ્લિકોન્સ માટે ઇલેક્ટ્રોકેમિકલ સેન્સર્સના પ્રભાવને અસર કરતી વિવિધ પદ્ધતિઓ દર્શાવે છે. અમારા અવલોકનો એ આંતરદૃષ્ટિને અન્ડરસ્કોર કરે છે કે લાંબા સમય સુધી DNA ટુકડાઓ \(\અંદાજે\) \(500\,\hbox {bp}\) ઉચ્ચ સંવેદનશીલતા સાથે શોધી શકાય છે અને નમૂનામાં મીઠાની હાજરી DNA સાંદ્રતાને સંવેદનશીલતા આપતી નથી જે ઉચ્ચ સંવેદનશીલતાને અસર કરે છે (ભાગ્યે જ \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) અને ઉપર). વધુમાં, અમે વિવિધ પ્રકારના નમૂનાઓની અસરની તપાસ કરી, જેમાં ઉમેરેલા મીઠા સાથે અને વગર જેલ-પ્યુરિફાઈડ એમ્પ્લીકોન્સ અને DPV અને CV માપમાં તળાવના પાણીના નમૂનાઓનો ઉમેરો.અમે અવલોકન કર્યું છે કે DPV વધુ સારું રિઝોલ્યુશન પ્રદાન કરે છે, કારણ કે પૃષ્ઠભૂમિ કેપેસિટીવ પ્રવાહ પણ CV માપનને અસર કરે છે, તેને ઓછું સંવેદનશીલ બનાવે છે.
લાંબા ટુકડાઓનું એમ્પ્લીફિકેશન વાયરલ જીનોમિક આરએનએની અખંડિતતા પર આધાર રાખે છે. કેટલાક અભ્યાસોએ દર્શાવ્યું છે કે પર્યાવરણમાં આરએનએના અધોગતિ અને અલગતા દરમિયાન વિભાજનની સંભાવનાને કારણે લાંબા ટુકડાઓનું એમ્પ્લીફિકેશન હંમેશા કાર્યક્ષમ હોતું નથી11,41,42,43,44 .અમે અવલોકન કર્યું કે એલ્યુમિનિયમ હાઇડ્રોક્સાઇડ-આધારિત વાયરસ સાંદ્રતા પદ્ધતિ કરતાં તળાવના પાણીના નમૂનાઓમાં PEG-આધારિત વાયરસ એકાગ્રતા પદ્ધતિ વધુ અસરકારક હતી. બહુવિધ ટૂંકી લંબાઈના નમૂનાઓને વિસ્તૃત કરવા અને ક્રોસ-વિશિષ્ટતાની શક્યતા ઘટાડવા માટે.
જૈવિક નમૂનાઓ દુર્લભ છે, તેથી બાયોસેન્સર ડિઝાઇન કરવાની જરૂર છે જેને પરીક્ષણ માટે ન્યૂનતમ નમૂનાઓની જરૂર છે. આ અભ્યાસમાં ઉપયોગમાં લેવાતા ENIG PCB ઇલેક્ટ્રોડની જ જરૂર છે \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ ) ઇલેક્ટ્રોડ્સના અસરકારક વિસ્તારને આવરી લેવા માટે પરીક્ષણ માટેના નમૂનાઓ. વધુમાં, તે જ ઇલેક્ટ્રોડનો આગલો નમૂનો આપતા પહેલા સફાઈ કર્યા પછી ફરીથી ઉપયોગ કરી શકાય છે. એમ્પ્લીફાઇડ નમૂનાઓમાં મેથાઈલીન બ્લુ સિવાયના કોઈપણ રસાયણો ઉમેરવાની જરૂર નથી, જે એક સસ્તું છે. અને સામાન્ય રીતે વપરાતું રસાયણ. દરેક ઇલેક્ટ્રોડના ઉત્પાદન માટે લગભગ $0.55 (અથવા INR 40)નો ખર્ચ થતો હોવાથી, આ બાયોસેન્સર હાલની ડિટેક્શન ટેક્નોલોજીઓ માટે ખર્ચ-અસરકારક વિકલ્પ બની શકે છે. કોષ્ટક 2 આ કાર્યની તુલના સાહિત્યમાં લાંબા સમય સુધી નોંધાયેલા અન્ય સેન્સર્સ સાથે દર્શાવે છે. વિજાતીય નમૂનાઓમાં ડીએનએ ટુકડાઓ.
એમબી-આધારિત ઇલેક્ટ્રોકેમિકલ ડિટેક્શન પ્રોટોકોલ પીસીઆરની વિશિષ્ટતા પર આધાર રાખે છે તે જોતાં, આ પદ્ધતિની મુખ્ય મર્યાદા એ ગંદાપાણી અને તળાવના પાણી જેવા વિજાતીય નમૂનાઓમાં બિન-વિશિષ્ટ એમ્પ્લીફિકેશનની સંભવિતતા છે અથવા ઓછી શુદ્ધતાવાળા પ્રાઇમર્સનો ઉપયોગ કરે છે. સંવેદનશીલતા સુધારવા માટે. બિનસંશોધિત ENIG PCB ઇલેક્ટ્રોડ્સનો ઉપયોગ કરીને અશુદ્ધ PCR ઉત્પાદનોના DNA શોધ માટેની ઇલેક્ટ્રોકેમિકલ શોધ પદ્ધતિઓ, બિનઉપયોગી dNTPs અને પ્રાઇમર્સ દ્વારા રજૂ કરવામાં આવેલી ભૂલોને વધુ સારી રીતે સમજવા અને પ્રતિક્રિયાની સ્થિતિ અને એસે પ્રોટોકોલને ઑપ્ટિમાઇઝ કરવા માટે જરૂરી છે. વધારાના ભૌતિક રાસાયણિક પરિમાણો જેમ કે pH, તાપમાન અને બાયોલોજીકલ પરિમાણો. માપની ચોકસાઈને સુધારવા માટે પાણીના નમૂનાની ઓક્સિજન માંગ (BOD) પણ માપવાની જરૂર પડી શકે છે.
નિષ્કર્ષમાં, અમે પર્યાવરણીય (તળાવના પાણી) નમૂનાઓમાં વાયરસની શોધ માટે ઓછા ખર્ચે ઇલેક્ટ્રોકેમિકલ ENIG PCB સેન્સરની દરખાસ્ત કરીએ છીએ. DNA સેન્સિંગ માટે સ્થિર ઓલિગોન્યુક્લિયોટાઇડ ઇલેક્ટ્રોડ્સ અથવા કસ્ટમ સબસ્ટ્રેટથી વિપરીત કે જેને સંવેદનશીલતા જાળવવા માટે ક્રાયોજેનિક સ્ટોરેજની જરૂર હોય છે, 53,54 અમારી ટેકનિક અનમોડિફાઇડ PCB નો ઉપયોગ કરે છે. લાંબા સમય સુધી શેલ્ફ લાઇફ સાથેના ઇલેક્ટ્રોડ્સ અને કોઈ ચોક્કસ સ્ટોરેજ આવશ્યકતાઓ નથી અને તેથી LMICs માં જમાવવામાં આવેલા સ્વચાલિત નમૂના પ્રક્રિયા સાથે માપન ઉકેલોના વિકાસ માટે યોગ્ય છે. બાયોસેન્સર લક્ષ્ય એમ્પ્લિકન્સની ઝડપી શોધ માટે સસ્તા ડીએનએ-ઇન્ટરકેલેટિંગ રેડોક્સ ડાયઝ (એમબી) નો ઉપયોગ કરે છે. બિન-વિશિષ્ટ એમ્પ્લીફિકેશન. પર્યાવરણીય નમૂનાઓમાં સામાન્ય, MBs ના સિંગલ- અને ડબલ-સ્ટ્રેન્ડેડ ઓલિગોન્યુક્લિયોટાઇડ્સ સાથે બિન-વિશિષ્ટ બંધનને કારણે આ સંવેદના પદ્ધતિની વિશિષ્ટતા ઘટાડે છે. તેથી, આ પરીક્ષણની વિશિષ્ટતા પ્રાઇમર્સ અને પીસીઆર પ્રતિક્રિયાની સ્થિતિના ઑપ્ટિમાઇઝેશન પર આધાર રાખે છે. વધુમાં, સી.વી. અને પરીક્ષણ કરાયેલા નમૂનાઓમાંથી મેળવેલા DPV પીક કરંટને પ્રત્યેક પરીક્ષણ માટે નકારાત્મક નિયંત્રણ (NTC) માંથી મેળવેલા પ્રતિસાદોની તુલનામાં અર્થઘટન કરવું જોઈએ. આ કાર્યમાં પ્રસ્તુત ઇલેક્ટ્રોકેમિકલ સેન્સર ડિઝાઇન અને પદ્ધતિઓ સંપૂર્ણ સ્વચાલિત અને નીચા વિકાસ માટે ઓટોસેમ્પલર્સ સાથે સંકલિત કરી શકાય છે. -કોસ્ટ સોલ્યુશન કે જે નમૂનાઓ એકત્રિત અને વિશ્લેષણ કરી શકે છે અને પરિણામોને વાયરલેસ રીતે લેબોરેટરીમાં ટ્રાન્સમિટ કરી શકે છે.
કેશડોલર, જે. એન્ડ વાયમર, એલ. પાણીના નમૂનાઓમાંથી વાયરસની પ્રારંભિક સાંદ્રતા માટેની પદ્ધતિઓ: તાજેતરના અભ્યાસોની સમીક્ષા અને મેટા-વિશ્લેષણ.જે.Application.microorganism.115, pp. 1-11 (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL વોટરબોર્ન વાયરસ: પીવાના સલામત પાણીમાં અવરોધો. PLoS પેથોજેન્સ.11, E1004867 (2015).
શ્રેષ્ઠ, એસ. એટ અલ. ઓછી અને મધ્યમ આવક ધરાવતા દેશોમાં કોવિડ-19ના ખર્ચ-અસરકારક મોટા પાયે દેખરેખ માટે વેસ્ટવોટર એપિડેમિઓલોજી: પડકારો અને તકો. વોટર 13, 2897 (2021).
પેલેસેક, ઇ. અને બાર્ટોસિક, એમ. ન્યુક્લીક એસિડ ઇલેક્ટ્રોકેમિસ્ટ્રી.કેમિકલ.રેવ.112, 3427–3481 (2012).
Tani, A., Thomson, AJ & Butt, JN Methylene બ્લુ એક ઇલેક્ટ્રોકેમિકલ ભેદભાવ તરીકે સિંગલ- અને ડબલ-સ્ટ્રેન્ડેડ ઓલિગોન્યુક્લિયોટાઇડ્સ સોનાના સબસ્ટ્રેટ પર સ્થિર થાય છે. વિશ્લેષક 126, 1756–1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ કમ્પેરિઝન ઓફ Cation and Anion Intercalators for DNA હાઇબ્રિડાઇઝેશન ઓફ ઇલેક્ટ્રોકેમિકલ ટ્રાન્સડક્શન બાય લોંગ-રેન્જ ઇલેક્ટ્રોન ટ્રાન્સફર.Electrochemistry.comminicate.6, 648–654 (2004).
વોંગ, EL અને ગુડિંગ, જેજે ચાર્જ ટ્રાન્સફર ડીએનએ દ્વારા: એક પસંદગીયુક્ત ઇલેક્ટ્રોકેમિકલ ડીએનએ બાયોસેન્સર.અનુસ.કેમિકલ.78, 2138–2144 (2006).
ફેંગ, TH એટ અલ. સમવર્તી ઇલેક્ટ્રોકેમિકલ ડિટેક્શન. બાયોલોજિકલ સેન્સર સાથે રીઅલ-ટાઇમ પીસીઆર માઇક્રોફ્લુઇડિક ઉપકરણ. બાયોઇલેક્ટ્રોનિક્સ.24, 2131–2136 (2009).
Win, BY et al. સિગ્નલિંગ મિકેનિઝમ અભ્યાસ અને ડીએનએ સાથે મેથિલિન બ્લુની ક્રિયાપ્રતિક્રિયા પર આધારિત ઇલેક્ટ્રોકેમિકલ રીઅલ-ટાઇમ પીસીઆર સિસ્ટમની કામગીરીની ચકાસણી. વિશ્લેષક 136, 1573–1579 (2011).
રામીરેઝ-ચવેરિયા, આરજી એટ અલ. લૂપ-મીડિયેટેડ આઇસોથર્મલ એમ્પ્લીફિકેશન-આધારિત ઇલેક્ટ્રોકેમિકલ સેન્સર ગંદાપાણીના નમૂનાઓમાં સાર્સ-કોવ-2ની શોધ માટે.જે.પર્યાવરણ.કેમિકલ.બ્રિટન.10, 107488 (2022).
કુમાર, એમ. એટ અલ. PCB ઇલેક્ટ્રોડ્સ સાથે SARS-CoV-2 એમ્પ્લીકોન્સનું ઇલેક્ટ્રોકેમિકલ સેન્સિંગ. સેન્સર સક્રિય છે.B રસાયણશાસ્ત્ર.343, 130169 (2021).
કિતામુરા, કે., સદામાસુ, કે., મુરામાત્સુ, એમ. અને યોશિદા, એચ. ગંદાપાણીના ઘન અપૂર્ણાંકમાં SARS-CoV-2 RNAની કાર્યક્ષમ શોધ. science.general environment.763, 144587 (2021).
Alygizakis, N. et al. ગંદાપાણીમાં SARS-CoV-2 શોધ માટે વિશ્લેષણાત્મક પદ્ધતિઓ: પ્રોટોકોલ અને ભાવિ પરિપ્રેક્ષ્ય.TraC ટ્રેન્ડિંગ anal.Chemical.134, 116125 (2020).
ફેડોરેન્કો, એ., ગ્રિનબર્ગ, એમ., ઓરેવી, ટી. અને કશ્તાન, એન. સર્વાઈવલ ઓફ ધ એન્વેલોપ્ડ બેક્ટેરિયોફેજ Phi6 (SARS-CoV-2 માટે સરોગેટ) કાચની સપાટી પર જમા થયેલ બાષ્પીભવન કરાયેલ લાળના ટીપાંમાં.science.Rep.10, 1–10 (2020).
ડે, આર., ડલુસ્કાયા, ઇ. અને એશબોલ્ટ, એનજે એન્વાયર્નમેન્ટલ પર્સિસ્ટન્સ ઓફ એ SARS-CoV-2 સરોગેટ (Phi6) ઇન ફ્રી-લિવિંગ અમીબા.જે.જળ આરોગ્ય 20, 83 (2021).
Mindich, L. ડબલ-સ્ટ્રેન્ડેડ RNA બેક્ટેરિયોફેજ\(\varphi\)6.માઈક્રોઓર્ગેનિઝમ.મૂર.બાયોલોજી.રેવ.ના ત્રણ જીનોમિક ટુકડાઓનું ચોક્કસ પેકેજિંગ.63, 149–160 (1999).
પિર્ટિમા, એમજે અને બેમફોર્ડ, DH RNA ફેજ\(\varphi\)6 પેકેજિંગ ક્ષેત્રનું ગૌણ માળખું.RNA 6, 880–889 (2000).
બોનિલા, એન. એટ અલ. ફેજેસ ઓન ધ ટેપ – બેક્ટેરિયોફેજીસના લેબોરેટરી સ્ટોક તૈયાર કરવા માટે ઝડપી અને કાર્યક્ષમ પ્રોટોકોલ. પીઅરજે 4, ઇ2261 (2016).