Grazas por visitar Nature.com. A versión do navegador que estás a usar ten compatibilidade limitada para CSS. Para unha mellor experiencia, recomendámosche que utilices un navegador actualizado (ou desactives o modo de compatibilidade en Internet Explorer). Mentres tanto, para garantir soporte continuo, mostraremos o sitio sen estilos e JavaScript.
A importancia do seguimento das mostras ambientais foi moi apreciada desde o inicio da pandemia de COVID-19, e algúns esforzos de vixilancia están a realizarse utilizando o patrón ouro, aínda que as técnicas baseadas en qPCR son caras. Os biosensores de ADN electroquímicos poderían proporcionar un custo rendible solución para o seguimento de mostras de auga ambientais en países de ingresos baixos e medios. Neste traballo, demostramos a detección electroquímica de amplicóns obtidos a partir do fago Phi6 illado de mostras de auga de lago con picos (un substituto popular do SARS-CoV-2), utilizando ENIG para completar electrodos de PCB sen modificación da superficie.sexo. A resposta do sensor electroquímico caracterizouse a fondo para dous fragmentos de ADN de diferentes lonxitudes (\({117}\,\hbox {bp}\) e \({503}\,\hbox {bp}\)), e o efecto dos sales nas mesturas mestras de PCR sobre as interaccións azul de metileno (MB)-ADN. Os nosos resultados mostran que a lonxitude dos fragmentos de ADN determina significativamente a sensibilidade electroquímica e demostran neste traballo que a capacidade de detectar amplicóns longos sen purificación de xel dos produtos da PCR é importante para a medición in situ de mostras de auga.Unha solución totalmente automatizada para a carga viral é un bo augurio.
A transmisión de virus transmitidos pola auga coñécese como un perigo para a saúde pública desde a década de 1940, coa primeira evidencia de transmisión da poliomielite e da hepatite E1 pola auga. A Organización Mundial da Saúde (OMS) clasificou varios patóxenos virais transmitidos pola auga de importancia para a saúde de moderada a alta2. Virus tradicional os métodos de detección dependen de técnicas baseadas en qPCR de estándar ouro, que son moi sensibles e específicas, pero requiren persoal cualificado para probar no laboratorio utilizando instrumentos caros. Non obstante, nos países de ingresos baixos e medios (LMIC) con recursos limitados, é probable que a proba de mostras teña prioridade sobre a vixilancia ambiental de mostras de auga. Polo tanto, son necesarios métodos alternativos de baixo custo para o seguimento sostible e en tempo real de mostras de auga e augas residuais en países de ingresos baixos e medios como alertas tempranas de brotes de enfermidades emerxentes. protexéndoos deste xeito dos graves impactos socioeconómicos da pandemia do virus. Os biosensores electroquímicos de baixo custo para ácidos nucleicos poderían proporcionar unha solución potencial prometedora a esta necesidade insatisfeita. Moitos destes biosensores de ADN funcionan polo feito de que as cadeas complementarias de ADN están inmobilizadas no electrodo. superficie e hibridan cando unha secuencia coincidente está presente na mostra. Isto pódese converter nun sinal mediante varias técnicas electroquímicas usando mediadores redox como o ferro/ferrocianuro de potasio. O azul de metileno (MB) é unha desas moléculas redox-activas, que ten informouse de que se intercalan no ADN de dobre cadea (ADNdc) ademais da súa unión máis inespecífica ao ADN monocatenario5,6. A natureza de intercalación dos MBs para formar complexos MB-ADN fai que sexan unha opción popular como mediadores redox en varios ADN electroquímico. configuracións do sensor5,6,7,8,9.Aínda que a intercalación de MB ao ADN é inespecífica e a especificidade deste sensor electroquímico depende en gran medida da pureza dos cebadores utilizados para a PCR ou amplificación isotérmica, é moi adecuado para implementar reais. QPCR baseada en electroquímicos en tempo ou amplificación isotérmica de fluorescencia como alternativa á medición da concentración de ADN 9. Nunha implementación deste tipo, Won et al. A superficie dos electrodos de ouro foi modificada con 6-mercapto-1-hexanol (MCH) para tempo real. medición de amplicóns de PCR con MB mediante voltametría de pulso diferencial (DPV)9. Noutros casos, Ramírez et al.Detección de SARS-CoV-2 en augas residuais mediante reacción RT-LAMP utilizando MB con electrodos serigrafiados. Tamén se realizaron electrodos de platino. usado como electrodos in situ nunha plataforma de PCR microfluídica deseñada para detectar electroquímicamente amplicóns durante as reaccións 8 .Todos estes estudos requiren a modificación da superficie dos electrodos, o que implica un aumento dos custos de produción e operación debido aos requisitos especiais de almacenamento para a estabilidade destes electrodos funcionalizados.
Esquema do fluxo de traballo para a detección electroquímica de amplicóns obtidos a partir de partículas virais concentradas en mostras de auga do lago.
Recentemente demostramos a detección electroquímica de amplicóns SARS-CoV-2 con electrodos de placa de circuíto impreso (PCB) de baixo custo baseados en DPV e voltametría cíclica (CV) inducida pola adsorción de complexos de ADN-MB na superficie de electrodos non modificados) cambios no pico. actual 11.Informamos de que os fragmentos de ADN máis longos (N1-N2, \({943}\, \hbox) formados usando os cebadores N1 directo e N2 inverso recomendados polos CDC en comparación cos fragmentos máis curtos {bp}\)) mostraron unha mellor linealidade na resposta do sensor. (N1, \(72\,\hbox {bp}\))) formado usando conxuntos de cebadores N1 directo e N1 inverso. Estes estudos infórmanse usando dilucións de ADN preparadas en auga sen nucleases. A plataforma tamén se utilizou para detectar SARS-CoV. -2 amplicóns en mostras simuladas de augas residuais (obtidos ao regar mostras de ARN total con ARN do SARS-CoV-2). Dado que o ARN é susceptible de cizallamento durante o illamento e o procesamento posterior,12,13 é difícil amplificar fragmentos máis longos con esta mostra heteroxénea. Polo tanto, a demostración da detección electroquímica do amplicón SARS-CoV-2 nas augas residuais limítase ao fragmento N1 máis curto \(72\,\hbox {bp}\).
Neste traballo, investigamos a viabilidade da detección electroquímica baseada en PCB ENIG do fago Phi6 concentrado e illado de mostras de auga do lago (Fig. 1). Os fagos Phi6 son comparables en tamaño (80-100 nm) ao SARS-CoV-2 e Tamén teñen unha membrana lipídica e unha proteína de espiga. Por estes motivos, o bacteriófago Phi6 é un substituto popular para SARS-CoV-2 e outros virus de ARN patóxeno con envoltura14,15.Usouse o ARN illado de partículas de fagos como molde para a síntese de ADNc seguido de PCR para obter dous fragmentos de ADN de 117 e 503 pares de bases de lonxitude. Dado o desafío de amplificar \(943\,\hbox {bp}\) fragmentos N1-N2 no noso traballo anterior, dirixímonos a fragmentos de lonxitude intermedia (\(117 \,\hbox {bp}\) e \(503 \,\hbox {bp}\)), baseados nos cebadores dispoñibles. A resposta do sensor electroquímico estudouse sistemáticamente nun amplo intervalo de concentración (\({10}\,{ \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) a \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) Para ambos fragmentos en a presenza de MB, o efecto do sal sobre a resposta do sensor foi caracterizado e validado cruzadamente mediante medicións espectrofotométricas. As principais contribucións deste traballo son as seguintes:
A lonxitude do fragmento de ADN e a presenza de sal na mostra afectan moito á sensibilidade.Os nosos resultados mostran que a actividade electroquímica depende de diferentes mecanismos de interacción de MB, ADN e sensor na resposta voltamétrica, dependendo da concentración e lonxitude do ADN, sendo os fragmentos máis longos unha maior sensibilidade, aínda que o sal ten un efecto negativo nas interaccións electrostáticas entre MB e ADN.
A concentración de ADN determina o mecanismo da interacción MB-ADN en electrodos non modificados Demostramos que diferentes mecanismos de interacción MB-ADN dependen da concentración de ADN. A concentracións de ADN por debaixo dunha pequena cantidade de \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox} {l}}}\), observamos que a resposta de corrente electroquímica estaba determinada principalmente pola adsorción de ADN-MB no eléctrodo, mentres que a concentracións máis baixas. En concentracións de ADN elevadas, a resposta da corrente electroquímica estaba determinada pola inhibición estérica do redox. actividade debida á inserción de MB entre pares de bases de ADN.
Detección electroquímica baseada en PCB ENIG de ácidos nucleicos virais en mostras de auga de lagos As observacións validáronse mediante a detección electroquímica de fragmentos de ADN \(503\,\hbox {bp}\) engadidos con Phi6 obtidos a partir de mostras de auga do lago Powai, campus do IIT Mumbai Fago de resultado.
Baixo custo de implementación e potencial de integración en sistemas de monitorización totalmente automatizados, oligonucleótidos ou aptámeros en electrodos cunha vida útil máis longa.
O fago Phi6 é un virus dsRNA con envoltura da familia Cytoviridae que infecta a Pseudomonas syringae. O xenoma do fago Phi6 existe en forma de 3 fragmentos: S (\(2,95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4,07 \,\hbox {Kb}\)) e L (\ (6,37\ ,\hbox{Kb}\))16,17. Dado que o fago Phi6 infecta unha cepa de Pseudomonas BSL-1 non patóxena, é seguro de usar e pódese cultivar facilmente no laboratorio. O phage Phi6 e o seu hóspede Pseudomonas syringae foron adquiridos no Centro de referencia de virus bacterianos Felix d'Herelle, da Universidade de Laval, Canadá (os números de catálogo dos centros de referencia son HER-102 e HER-1102, respectivamente) O fago Phi6 e o seu hóspede reviviron segundo as indicacións do centro de referencia. O fago Phi6 purificouse mediante lise de placas e elución para obter títulos finais con \(\uns 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { ml}}\) (unidades formadoras de placa/ mililitros). Illouse o ARN das partículas de fagos purificadas usando o kit de purificación de ARN total universal GenElute™ (Sigma-Aldrich) segundo as instrucións do fabricante. Brevemente, unha suspensión Phi6 de fago purificada\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) foi lisado e o lisado cargouse nunha columna de rotación para permitir que o ARN se unira á columna de resina. Despois, o ARN elúese na solución de elución \({ 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) proporcionado polo kit. Estima a concentración de ARN por absorbancia en \(260\,\hbox {nm}\). O ARN almacenouse en alícuotas en \ ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) ata o seu uso posterior.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) O kit de síntese de cDNA iScript (Biografía -Rad Laboratories) utilizouse como modelo para a síntese de ADNc seguindo as instrucións do fabricante. Brevemente, unha reacción de síntese de ADNc consta de 3 pasos: cebado en \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min} }\), transcrición inversa de \({20}\,{\hbox {min}}\) en \({46}\,{^{\circ }\hbox {C}}\), e inversa A gravadora está en \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) durante \({1}\,{\hbox {min }}\). Cando se executou nun xel de agarosa ao 1 %, o ADNc mostrou tres bandas correspondentes aos tres fragmentos de ARN esperados (datos non mostrados).Usáronse os seguintes cebadores para amplificar dous fragmentos de ADN de 117 e 503 pb de lonxitude, usando cDNA como modelo para PCR nun termociclador miniPCR® mini8:
Os cebadores para \(117\,\hbox {bp}\) e \(503\,\hbox {bp}\) corresponden a 1476-1575 nucleótidos do segmento M e 458-943 nucleótidos do segmento L, respectivamente ácidos .Todos os produtos de PCR amplificados foron sometidos a electroforesis en xeles de agarosa ao 1 % e purificouse o ADN diana amplificado mediante o kit de extracción de xel GeneJET (Thermo Fisher Scientific).
Utilizouse un lago no campus do IIT Mumbai (Powai Lake, Powai, Mumbai) para engadir partículas de fagos. A auga do lago filtrouse a través dunha membrana \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) para eliminar partículas en suspensión, e despois engadiuse o fago Phi6. Engade \({1}\,{\hbox {ml}}\) de \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} \) a \( {100}\ ,{\hbox {ml}}\) auga filtrada do lago, en \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\).Unha pequena alícuota foi reservado para a medición da carga viral mediante ensaio de placas. Probamos dous métodos diferentes para concentrar partículas de virus Phi6 con picos: (1) o método de adsorción-precipitación de hidróxido de aluminio,19 que foi validado para a concentración de varios virus de ARN con envoltura de mostras ambientais, e (2) ) O método de concentración de virus baseado en polietilenglicol (PEG) foi adaptado de Flood et al.20 .Dado que se atopou que a eficiencia de recuperación do método baseado en PEG era mellor que a do método do hidróxido de aluminio, utilizouse o método baseado en PEG para concentrar partículas Phi6 das mostras de auga do lago.
O método PEG utilizado foi o seguinte: engadíronse PEG 8000 e \(\hbox {NaCl}\) ás mostras de auga do lago con picos de Phi6 para obter un 8 % de PEG 8000 e \(0,2\,\hbox {M} \) \( \ hbox {NaCl}\). As mostras incubáronse nun agitador\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), despois centrifugado en \(4700 \,\hbox {g}\) é \({45}\,{\hbox {min}}\). Deseche o sobrenadante e resuspenda o sedimento en \({1}\, {\hbox {ml}}\) no mesmo sobrenadante. Todos os experimentos de reforzo e concentración de virus realizáronse por triplicado. Despois da concentración, reservouse unha pequena alícuota para medir a eficacia de recuperación mediante ensaio de placas. Illouse o ARN como se describiu anteriormente e eluíuse. no tampón de elución subministrado polo kit\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\). Dado que a concentración de ARN variará dunha mostra a outra por triplicado, o \({2}\,{\upmu \ hbox {l}}\) de ARN úsase para os tres, independentemente da súa concentración. Síntese de ADNc das mostras. A síntese de ADNc realizouse como se describiu anteriormente.\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) ADNc utilizouse como modelo para \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR durante 35 ciclos para amplificar \ (117\,\hbox {bp}\) e \(503\,\hbox { bp}\) fragmentos. Estas mostras represéntanse como "1:1", é dicir, sen dilución. Configurouse un control sen modelo (NTC) como control negativo, mentres que un ADNc sintetizado usando ARN illado do fago purificado. como modelo para un control positivo (PC). A PCR cuantitativa (qPCR) realizouse nun instrumento Stratagene Mx3000P RT-PCR utilizando Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies). As reaccións foron configuradas por triplicado como anteriormente. O limiar do ciclo (Ct) rexistrouse para todas as mostras. Ademais, as mostras diluídas foron \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) usando ADNc diluído 1:100 en auga filtrada do lago como \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR durante 35 ciclos. Estas mostras represéntanse como "1:100".
Os electrodos de PCB están fabricados mediante un proceso de baixo custo de ouro de inmersión de níquel electrolítico (ENIG) dispoñible comercialmente sen necesidade de chapado en ouro adicional. As especificacións dos electrodos de PCB de ENIG detállanse no noso traballo anterior11. Para os electrodos de PCB de ENIG, os métodos tradicionais de limpeza de electrodos, como Non se recomenda a solución de piraña ou a voltametría cíclica de ácido sulfúrico, xa que poden causar peladura da fina capa de ouro (espesor \(\aprox.\) \(100\,\hbox {nm }\)) e expor as capas de cobre subxacentes que son propensas. á corrosión 21, 22, 23, 24, 25. Polo tanto, limpar os electrodos cun pano sen pelusa humedecido con IPA. A mostra a probar foi incubada con \({50}\,{\upmu \hbox {M} }\) MB en \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) para facilitar a inserción. No noso traballo anterior , observamos que a sensibilidade e a linealidade do sensor melloraron ao aumentar a concentración de MB 11 .Basándonos nas optimizacións informadas no noso traballo anterior, usamos \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB concentracións para incorporar o ADN neste estudo. A detección electroquímica de ADN de dobre cadea (ds-DNA) pódese conseguir mediante intercaladores aniónicos ou catiónicos. Aínda que os intercaladores aniónicos detectan ADN cunha mellor selectividade, requiren incubación durante a noite, o que resulta en tempos de detección máis longos. por outra banda, os intercaladores catiónicos como o MB requiren tempos de incubación máis curtos, aproximadamente \({1}\,{\hbox {h}}\) para a detección electroquímica de ds-DNA6. Cada medición implica dispensar a mostra a probar no electrodo\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), despois limpa cun trapo humedecido con IPA, antes de continuar con outra mostra.unha medición. Cada mostra foi probada en 5 electrodos diferentes a menos que se indique o contrario. As medicións DPV e CV realizáronse utilizando un potenciostato PalmSens Sensit Smart e utilizouse o software PSTrace para a configuración do potenciostato e a adquisición de datos, incluídos os cálculos de corrente de pico. Utilízanse os seguintes axustes para medicións DPV e CV:
DPV: Tempo de equilibrio = \(8\,\hbox {s}\), Paso de tensión = \(3\,\hbox {mV}\), Tensión de pulso = \(25\,\hbox {mV}\), duración do pulso = \(50\,\hbox {ms}\), frecuencia de exploración = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: Tempo de equilibrio = \(8\,\hbox {s}\), Paso de voltaxe = \(3\,\hbox {mV}\), Velocidade de barrido = \({300}\,\hbox {mV/s }\)
Correntes de pico obtidas a partir de voltamogramas de ADN complexado con \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
Os voltamogramas DPV e CV obtivéronse en electrodos ENIG PCB \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB complexados con ADN (en concentracións de 10–\({20}\,{\ hbox {ng). }/{\upmu \hbox {l}}}\) é dicir, 0,13–\({0,26}\,{\upmu \hbox {M}}\) para \(117\,\hbox {bp}\ ) e 0,03 –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) para \(503\,\hbox {bp}\)).Os voltamogramas representativos móstranse na Figura S1 en Información complementaria. A Figura 2 mostra os resultados de medicións de DPV e CV (corrente de pico) usando produtos de PCR purificados con xel. En comparación coas medicións de CV, as medicións de DPV mostran unha maior sensibilidade (corrente en función da concentración de ADN) porque as correntes capacitivas de fondo nas medicións de CV ocultan correntes faradaicas 26 .Os datos para cada caixa do diagrama de caixas contén medicións de 5 electrodos. Todas as medicións usan o mesmo conxunto de electrodos para evitar erros de medición debido á variación de electrodo a electrodo. Observamos unha tendencia crecente nas correntes de pico medidas DPV e CV para concentracións máis baixas de ADN , máis longo (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ en comparación co \(117) ) fragmento. Isto é consistente coa tendencia esperada de adsorción de electrodos informada no noso traballo anterior. a adsorción do complexo MB-ADN facilita a transferencia de carga no electrodo, o que contribúe ao aumento da corrente de pico.Outros estudos demostraron o efecto do tamaño e secuencia dos oligonucleótidos na intercalación do MB-ADN27,28,29,30.A guanina O contido de -citosina (GC) dos dous amplicons (\(117\,\hbox {bp}\) e \(503\,\hbox {bp}\)) foi aproximadamente do 50%, o que indica que a observación A diferenza débese a lonxitude do amplicón. Non obstante, para concentracións de ADN máis altas (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), para \(503\,\hbox {bp} \) e \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) para \(117\,\hbox {bp}\)), observamos dúas amplificacións. as correntes máximas dos subs redúcense tanto nas medicións de DPV como de CV. Isto débese a que o MB satura e intercala entre pares de bases de ADN, o que resulta na inhibición estérica da actividade redox do grupo reducible en MB31,32.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
Os sales presentes nas mesturas mestras de PCR interfiren coas interaccións electrostáticas entre MB e ADN, polo que engadindo \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) con \({50} \,{\ upmu \hbox {M}}\) Produto purificado con xel de MB para estudar o efecto da sal na interacción MB-ADN. Como se mostra na Figura 3, observamos que para concentracións de ADN máis altas (\(>{2}\,{\ hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) e \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) para \(117\,\hbox {bp} \)), en DPV e CV A adición de sal non afectou significativamente ás medicións (ver Figura S2 na Información complementaria para voltamogramas representativos). concentracións máis baixas de ADN, a adición de sal reduce moito a sensibilidade, o que resulta en ningún cambio significativo na corrente coa concentración de ADN. Outros investigadores informaron previamente de efectos negativos similares do sal nas interaccións e intercalación do ADN MB33,34.\(\hbox { Os catións Mg}^{2+}\) únense ao esqueleto fosfato negativo do ADN, dificultando así a interacción electrostática entre MB e ADN. En concentracións máis altas de ADN, a inhibición estérica dos MBs activos redox resulta en correntes de pico máis baixas, polo que as interaccións electrostáticas non afectan significativamente a resposta do sensor. O punto clave é que este biosensor é máis adecuado para detectar concentracións de ADN máis altas (raramente \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) ou superior), para o procesamento totalmente automatizado de mostras de auga ambiental, onde a purificación en xel dos produtos de PCR pode non ser viable.
Área baixo a curva de absorción para o intervalo de lonxitudes de onda 600–700 \(\hbox {nm}\) para varias concentracións de ADN complexado con \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) con e sen sal (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) con e sen sal (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) Concentracións de ADN correspondentes a \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) mostras de MB Sen ADN.
Para verificar aínda máis os resultados anteriores, realizamos medicións ópticas utilizando un espectrofotómetro UV/Vis (Thermo Scientific Multiskan GO), as mostras \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) utilizáronse para cada unha. Medición. A sinatura de absorción diminúe co aumento da concentración de ADN, como se pode ver na tendencia da área baixo a curva de absorción para o intervalo de lonxitudes de onda \(600\,\hbox {nm}\) ata \(700\,\hbox {). nm}\), como se mostra na Fig. 4 (espectro de absorción que se mostra na Fig. S3 en Información complementaria). Para mostras con concentracións de ADN inferiores a \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), non houbo diferenzas significativas na captación entre as mostras que conteñen ADN e só MB (para \(503\,\hbox {bp}\) e \(117\,\hbox {bp}\) ) de lonxitude), indicando a ausencia de inhibición estérica do MB redox-activo. A maiores concentracións de ADN, observamos unha diminución gradual do sinal de absorbancia e observamos unha menor diminución da absorbancia en presenza de sal. Estes resultados foron atribuídos ao factor molecular interaccións e inhibición estérica con apilado de bases en híbridos de ADN. ) transicións electrónicas debidas á intercalación Capas 36, 37, 38.
Electroforese en xel de agarosa do fago Phi6: produtos de PCR de lonxitude \(117\,\hbox {bp}\) e \(503\,\hbox {bp}\) a partir de mostras de auga do lago.Marcador de ADN-M;Control NTC sen plantilla, cebadores que conteñen amplicóns correspondentes;control positivo de PC;1, 2, 3 mostras de auga do lago con picos sen diluir (1:1) por triplicado. É visible unha banda en \(\uns 50\,\hbox {bp}\) debido aos oligonucleótidos non utilizados no \(503\,\). hbox {bp}\) carril.
Avaliamos a utilidade do sensor usando mostras de auga do lago Powai con picos de fago Phi6. As concentracións de ARN illadas de mostras de auga con picos de fagos variaron entre 15,8–\({19,4}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox { ml}}\), mentres que os illados de suspensións de fagos purificados estimouse que o ARN era \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) cunha eficiencia de recuperación de aproximadamente 1 O ARN transcribiuse inversamente a ADNc e utilizouse como modelo para PCR e qPCR. O tamaño do produto confirmouse mediante electroforese en xel de agarosa (Figura 5) antes da proba co sensor. Estas mostras non se purifican en xel e, polo tanto, conteñen todos os compoñentes da PCR como así como os amplicóns de interese. Os valores de Ct rexistrados durante a qPCR (táboa 1) se correlacionan coa concentración de ARN illado das correspondentes mostras de auga con picos. O valor de Ct revela o número de ciclos necesarios para que o sinal fluorescente superan o limiar ou o sinal de fondo. Os valores de Ct máis altos indican concentracións de modelo máis baixas e viceversa. Os valores de Ct das mostras de NTC foron tan altos como se esperaba. A diferenza de \(\aproximadamente 3\) valores de Ct entre o control positivo e a mostra de proba indican ademais que cada mostra de proba ten aproximadamente un 1% de plantilla en comparación co control positivo. Xa comentamos anteriormente que os amplicóns máis longos conducen a unha mellor sensibilidade. A amplificación de fragmentos máis longos illados de mostras ambientais heteroxéneas é un reto dadas as desvantaxes. de baixa concentración viral e degradación do ARN. Non obstante, co noso protocolo de enriquecemento de virus e amplificación por PCR, puidemos amplificar con éxito o fragmento \(503\,\hbox {bp}\) para a detección electroquímica.
A Figura 6 mostra os resultados do sensor electroquímico do amplicón do fragmento \(503\,\hbox {bp}\), ambos empregando ADNc sen diluir como modelo (1:1) e ADNc diluído 100 veces como modelo (1:100) realizado por PCR. , en comparación con NTC e PC (ver Figura S4 en Información complementaria para voltamogramas representativos). Cada caixa do diagrama de caixa da Figura 6 contén medidas de tres mostras en 5 electrodos. Os mesmos electrodos utilizáronse para medir todas as mostras para evitar erros debidos ao electrodo. variación -a-electrodo. En comparación coas medicións CV, as medicións DPV mostran unha mellor resolución para distinguir as mostras de proba e de PC das NTC porque, como se mencionou anteriormente, as correntes faradaicas están ocultas debido ás correntes capacitivas de fondo nestes últimos. Para amplicóns máis longos, observamos que o control negativo (NTC) deu lugar a correntes de pico CV e DPV máis altas en relación co control positivo, mentres que as mostras de proba positivas e sen diluir mostraron alturas de pico similares das correntes de pico DPV. Os valores medios e medianos medidos para cada un non diluído (1:1). ) a mostra de proba e o PC pódense resolver claramente a partir da saída do sensor para a mostra NTC, mentres que a resolución da mostra diluída 1:100 é menos pronunciada. Para unha dilución de 100 veces de ADNc, non observamos ningunha banda durante a electroforese en xel. (carrís non mostrados na Figura 5), e as correntes de pico DPV e CV correspondentes foron similares ás esperadas para NTC. Os resultados para o fragmento \(117\,\hbox {bp}\) móstranse en Información complementaria. O negativo o control induciu unha resposta electroquímica do sensor de PCB debido á adsorción de MB libre no electrodo e á interacción do MB co oligonucleótido cebador monocatenario. Polo tanto, cada vez que se proba unha mostra, debe realizarse un control negativo e corrente de pico da mostra de proba en comparación coa corrente de pico obtida polo control negativo para conseguir unha medición diferencial (relativa)39,40 para clasificar a mostra de proba como positiva ou negativa.
(a) DPV e (b) corrente de pico CV para a detección electroquímica de fragmentos \(503\,\hbox {bp}\) en mostras de auga do lago. As mostras de proba medironse por triplicado e comparáronse con controis sen modelo (NTC) e controis positivos (PC).
Os nosos descubrimentos ilustran diferentes mecanismos que afectan o rendemento dos sensores electroquímicos para amplicóns de diferentes lonxitudes para diferentes ADN, con concentracións verificadas mediante medicións ópticas mediante un espectrofotómetro UV/Vis. As nosas observacións subliñan a idea de que fragmentos de ADN máis longos ata \(\aprox\) \(500\,\hbox {bp}\) pódese detectar con maior sensibilidade e que a presenza de sal na mostra non afecta Sensibilidade Concentración de ADN que afecta a maior sensibilidade (raramente \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) e superior). Ademais, investigamos o efecto de diferentes tipos de mostras, incluíndo amplicóns purificados en xel con e sen sal engadido, e a adición de mostras de auga do lago nas medicións de DPV e CV.Observamos que o DPV proporcionaba unha mellor resolución, xa que a corrente capacitiva de fondo tamén afecta á medición do CV, facéndoa menos sensible.
A amplificación de fragmentos máis longos depende da integridade do ARN xenómico viral. Varios estudos demostraron que a amplificación de fragmentos máis longos non sempre é eficiente debido á degradación do ARN no medio e ao potencial de empalme durante o illamento11,41,42,43,44. .Observamos que o método de concentración de virus baseado en PEG foi máis efectivo para concentrar o fago Phi-6 enriquecido nas mostras de auga do lago que o método de concentración de virus baseado en hidróxido de aluminio. para amplificar varios modelos de lonxitude máis curta e reducir a posibilidade de especificidade cruzada.
As mostras biolóxicas son escasas, polo que é necesario deseñar un biosensor que requira mostras mínimas para a proba. Os electrodos de PCB ENIG utilizados neste estudo só precisaban \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ ) mostras para probar para cubrir a área efectiva dos electrodos. Ademais, o mesmo electrodo pódese reutilizar despois da limpeza antes de dispensar a seguinte mostra. As mostras amplificadas non requiren a adición de ningún produto químico que non sexa o azul de metileno, que é un produto barato. e produtos químicos de uso común. Dado que cada electrodo custa uns 0,55 USD (ou 40 INR) de fabricar, este biosensor pode ser unha alternativa rendible ás tecnoloxías de detección existentes. A táboa 2 mostra unha comparación deste traballo con outros sensores informados na literatura durante moito tempo. Fragmentos de ADN en mostras heteroxéneas.
Dado que os protocolos de detección electroquímica baseados en MB dependen da especificidade da PCR, unha das principais limitacións deste método é o potencial de amplificación inespecífica en mostras heteroxéneas como augas residuais e augas de lagos ou o uso de cebadores de pouca pureza. Para mellorar a sensibilidade de métodos de detección electroquímica para a detección de ADN de produtos de PCR non purificados utilizando electrodos de PCB ENIG non modificados, é necesario comprender mellor os erros introducidos polos dNTP e cebadores non utilizados, e optimizar as condicións de reacción e os protocolos de ensaio. Parámetros fisicoquímicos adicionais como pH, temperatura e biolóxicos. Tamén pode ser necesario medir a demanda de osíxeno (DBO) da mostra de auga para mellorar a precisión da medición.
En conclusión, propoñemos un sensor electroquímico ENIG PCB de baixo custo para a detección de virus en mostras ambientais (auga do lago). A diferenza dos electrodos de oligonucleótidos inmobilizados ou dos substratos personalizados para a detección de ADN que requiren almacenamento crioxénico para manter a sensibilidade53,54, a nosa técnica usa PCB non modificado. electrodos cunha vida útil máis longa e sen requisitos de almacenamento específicos e, polo tanto, axeitados para o desenvolvemento de solucións de medición con procesamento automatizado de mostras implantado en LMICs. O biosensor utiliza colorantes redox (MB) de intercalación de ADN económicos para a detección rápida de amplicóns obxectivo. A amplificación inespecífica común en mostras ambientais reduce a especificidade deste método de detección debido á unión inespecífica de MB a oligonucleótidos monocatenarios e bicatenarios. Polo tanto, a especificidade desta proba depende da optimización dos cebadores e das condicións de reacción da PCR. Ademais, o CV e as correntes de pico DPV obtidas das mostras ensaiadas deben interpretarse en relación ás respostas obtidas do control negativo (NTC) para cada proba. Os deseños e métodos de sensores electroquímicos presentados neste traballo pódense integrar con mostradores automáticos para desenvolver un sistema totalmente automatizado e baixo. - Solución de custo que pode recoller e analizar mostras e transmitir os resultados sen fíos ao laboratorio.
Cashdollar, J. & Wymer, L. Métodos para a concentración inicial de virus a partir de mostras de auga: unha revisión e meta-análise de estudos recentes.J.Aplicación.microorganismo.115, pp 1-11 (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL Waterborne viruses: Barriers to safe drinking water.PLoS Pathogens.11, E1004867 (2015).
Shrestha, S. et al.Epidemioloxía das augas residuais para unha vixilancia rendible a grande escala da COVID-19 en países de ingresos baixos e medios: desafíos e oportunidades. Water 13, 2897 (2021).
Palecek, E. & Bartosik, M. Nucleic acid electrochemistry.Chemical.Rev.112, 3427–3481 (2012).
Tani, A., Thomson, AJ & Butt, JN O azul de metileno como discriminador electroquímico de oligonucleótidos monocatenarios e bicatenarios inmobilizados en substratos de ouro.Analyst 126, 1756–1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ Comparación de intercaladores de cationes e anións para a transdución electroquímica da hibridación do ADN mediante transferencia electrónica de longo alcance.Electrochemistry.comminicate.6, 648–654 (2004).
Wong, EL & Gooding, JJ Transferencia de carga a través do ADN: un biosensor de ADN electroquímico selectivo.anus.Chemical.78, 2138–2144 (2006).
Fang, TH et al.Dispositivo microfluídico de PCR en tempo real con detección electroquímica concurrente.sensor biolóxico.Bioelectronics.24, 2131–2136 (2009).
Win, BY et al.Estudo do mecanismo de sinalización e verificación do rendemento dun sistema electroquímico de PCR en tempo real baseado na interacción do azul de metileno co ADN.Analyst 136, 1573–1579 (2011).
Ramirez-Chavarria, RG et al.Sensor electroquímico baseado en amplificación isotérmica mediada por bucle para a detección de sars-cov-2 en mostras de augas residuais.J.Environment.Chemical.Gran Bretaña.10, 107488 (2022).
Kumar, M. et al.Detección electroquímica de amplicóns SARS-CoV-2 con electrodos de PCB.O sensor está activado.B Chemistry.343, 130169 (2021).
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. & Yoshida, H. Detección eficiente do ARN SARS-CoV-2 na fracción sólida de augas residuais.ciencia.ambiente xeral.763, 144587 (2021).
Alygizakis, N. et al.Analytical Methods for SARS-CoV-2 Detection in Wastewater: Protocol and Future Perspectives.TraC trending anal.Chemical.134, 116125 (2020).
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. & Kashtan, N. Supervivencia do bacteriófago envolto Phi6 (un substituto do SARS-CoV-2) en gotas de saliva evaporadas depositadas en superficies de vidro.ciencia.Rep.10, 1–10 (2020).
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ Persistencia ambiental dun substituto SARS-CoV-2 (Phi6) en ameba de vida libre.J.Saúde da auga 20, 83 (2021).
Mindich, L. Empaquetado preciso de tres fragmentos xenómicos de bacteriófago de ARN bicatenario\(\varphi\)6.microorganism.Moore.biology.Rev.63, 149–160 (1999).
Pirttimaa, MJ & Bamford, Secondary structure of the DH RNA phage\(\varphi\)6 package region.RNA 6, 880–889 (2000).
Bonilla, N. et al.Phages on the Tap - Un protocolo rápido e eficiente para preparar stocks de laboratorio de bacteriófagos.PeerJ 4, e2261 (2016).
Hora de publicación: 27-maio-2022