Go raibh maith agat as cuairt a thabhairt ar Nature.com.Tá tacaíocht teoranta ag an leagan brabhsálaí atá in úsáid agat do CSS. Chun an taithí is fearr a fháil, molaimid duit brabhsálaí nuashonraithe a úsáid (nó mód comhoiriúnachta a mhúchadh in Internet Explorer). Idir an dá linn, chun a chinntiú tacaíocht leanúnach, cuirfimid ar taispeáint ar an suíomh gan stíleanna agus JavaScript.
Tuigtear go mór an tábhacht a bhaineann le monatóireacht a dhéanamh ar shamplaí comhshaoil ó thús na paindéime COVID-19, agus tá roinnt iarrachtaí monatóireachta á ndéanamh ag baint úsáide as an gcaighdeán óir, cé go bhfuil teicnící bunaithe ar qPCR costasach. réiteach chun monatóireacht a dhéanamh ar shamplaí uisce comhshaoil i dtíortha ísealioncaim agus meánioncaim. San obair seo, léirímid braite leictriceimiceach na n-aimlicíní a fhaightear ó Phi6 phage scoite amach ó shamplaí uisce locha spiked (ionadaí coitianta le SARS-CoV-2), ag baint úsáide as ENIG chun leictreoidí PCB a chomhlánú gan mhodhnú dromchla.sex.Bhí an freagra braite leictriceimiceach go críochnúil le haghaidh dhá bhlúire DNA d’fhaid éagsúla (\({117}\,\hbox {bp}\) agus \({503}\,\hbox {bp}\)), agus an éifeacht na salainn i meascáin máistir PCR ar meitiléine gorm (MB)-idirghníomhaíochtaí DNA.Léiríonn ár dtorthaí go gcinnfidh fad na blúirí DNA go suntasach íogaireacht leictriceimiceach agus a léiriú san obair seo go bhfuil an cumas a bhrath amplicons fada gan íonú glóthach de tháirgí PCR. tábhachtach chun samplaí uisce a thomhas in situ.Tagann réiteach uathoibrithe go hiomlán le haghaidh ualach víreasach go maith.
Aithníodh tarchur víreas uisce-iompartha mar ghuais don tsláinte phoiblí ó na 1940idí, leis an gcéad fhianaise ar tharchur uisce-iompartha polaimiailítis agus heipitíteas E1. Tá roinnt pataiginí víreasacha uisce-iompartha rangaithe ag an Eagraíocht Dhomhanda Sláinte (WHO) a bhfuil tábhacht measartha go hard sláinte leo2.Víreas traidisiúnta Tá modhanna braite ag brath ar theicnící atá bunaithe ar chaighdeán óir qPCR, atá an-íogair agus sonrach, ach a éilíonn pearsanra oilte chun tástáil a dhéanamh sa tsaotharlann ag baint úsáide as ionstraimí daor. Mar sin féin, i dtíortha ísealioncaim agus meánioncaim (LMICanna) le hacmhainní teoranta, daonna. is dócha go mbeidh tosaíocht ag tástáil shamplach ar mhonatóireacht ar shamplaí uisce comhshaoil. Dá bhrí sin, tá gá le modhanna eile ar chostas íseal le haghaidh monatóireachta inbhuanaithe, fíor-ama ar shamplaí uisce agus fuíolluisce i dtíortha ísealioncaim agus meánioncaim mar rabhadh luath ar ráigeanna galair atá ag teacht chun cinn, ar an mbealach sin á gcosaint ó thionchair thromchúiseacha shocheacnamaíocha na paindéime víreasach.D'fhéadfadh bithbhraiteoirí leictriceimiceacha ar chostas íseal d'aigéid núicléacha réiteach ionchasach féideartha a sholáthar don riachtanas neamhchomhlíonta seo. Oibríonn go leor de na bithbhraiteoirí DNA seo tríd an bhfíric go bhfuil snáitheanna comhlántacha DNA díluailithe ar an leictreoid. dromchla agus hibridiú nuair a bhíonn seicheamh meaitseála i láthair sa sampla.Is féidir é seo a thiontú ina chomhartha trí theicnící leictriceimiceacha éagsúla ag baint úsáide as idirghabhálaithe redox mar iarann potaisiam / ferrocyanide. Is móilín redox-ghníomhach amháin den sórt sin é meitiléine gorm (MB), a bhfuil tuairiscítear go n-idirghaolann siad isteach i DNA dúbailte-shnáithe (dsDNA) sa bhreis ar a cheangal níos neamhshonraithe le DNA aon-shnáithe5,6. Mar gheall ar nádúr idirghaolmhar MBanna chun coimpléisc MB-DNA a fhoirmiú, is rogha coitianta iad mar idirghabhálaithe redox i roinnt DNA leictriceimiceach. cumraíochtaí braiteora5,6,7,8,9.Cé go bhfuil an t-idirmhalartú MB go DNA nonspecific, agus braitheann sainiúlacht an braiteora leictriceimiceach seo den chuid is mó ar íonacht na primers a úsáidtear le haghaidh PCR nó aimpliú isiteirmeach, tá sé oiriúnach go maith chun fíor-aimpliú a chur i bhfeidhm. -time leictriceimiceach-bhunaithe qPCR nó aimpliú isothermal fhluaraiseacht mar mhalairt ar thomhas tiúchan DNA 9 .I gcur i bhfeidhm amháin den sórt sin, modhnaíodh Won et al.The dromchla leictreoidí óir le 6-mercapto-1-hexanol (MCH) le haghaidh fíor-ama tomhas na n-aimplicons PCR le MB ag baint úsáide as voltaiméadracht chuisle difreálach (DPV)9.I gcásanna eile, aimsíodh Ramirez et al. SARS-CoV-2 i bhfuíolluisce trí imoibriú RT-LAMP ag baint úsáide as MB le leictreoidí scáileánphriontáilte. Leictreoidí platanam curtha freisin a úsáidtear mar leictreoidí in situ i ardán PCR micreasreabhach atá deartha chun aimpliáin a bhrath go leictreamaiceimiceach le linn imoibrithe 8 . Éilíonn na staidéir seo go léir modhnú dromchla na leictreoidí, rud a thugann le tuiscint costais táirgthe agus oibriúcháin méadaithe mar gheall ar riachtanais stórála speisialta do chobhsaíocht na leictreoidí feidhmiúla seo.
Scéimreach an tsreafa oibre chun amplicons a fhaightear ó cháithníní víreasacha tiubhaithe i samplaí uisce locha a bhrath leictriceimiceach.
Léirigh muid le déanaí braiteadh leictriceimiceach ar aimplicain SARS-CoV-2 le leictreoidí cláir chiorcaid phriontáilte (PCB) ar chostas íseal bunaithe ar DPV agus voltaiméadracht timthriallach (CV) a tharlódh de bharr asaithe coimpléisc MB-DNA ar dhromchla na leictreoidí neamhmhodhnaithe) athruithe sa bhuaic. reatha11.Tuairiscímid gur léirigh blúirí DNA níos faide (N1-N2, \({943}\, \hbox) a foirmíodh ag baint úsáide as na primers N1 ar aghaidh agus N2 droim ar ais a mholtar CDC i gcomparáid le blúirí níos giorra {bp}\)) líneacht níos fearr i bhfreagra an bhraiteora ( N1, \(72\,\hbox {bp}\)) foirmithe ag baint úsáide as tacair primer droim ar aghaidh N1 agus N1. Tuairiscítear na staidéir seo ag baint úsáide as caoluithe DNA a ullmhaíodh in uisce saor ó núicléas. Baineadh úsáid as an ardán freisin chun SARS-CoV a bhrath -2 aimplicain i samplaí fuíolluisce ionsamhlaithe (a fhaightear trí shamplaí RNA iomlána a spiking le SARS-CoV-2 RNA). Ós rud é go bhfuil RNA so-ghabhálach do lomadh le linn aonrú agus próiseála iartheachtacha,12,13 tá sé deacair blúirí níos faide a mhéadú leis an sampla ilchineálach seo. Dá bhrí sin, tá léiriú braite leictriceimiceach ar aimplicon SARS-CoV-2 i bhfuíolluisce teoranta don bhlúire N1 is giorra \(72\,\hbox {bp}\).
San obair seo, rinneamar imscrúdú ar fhéidearthacht braite leictriceimiceach ENIG PCB-bhunaithe de phage Phi6 comhchruinnithe agus scoite amach ó shamplaí uisce locha (Fíor 1). Tá phages Phi6 inchomparáide i méid (80-100 nm) le SARS-CoV-2 agus freisin membrane lipid agus próitéin spike.Ar na cúiseanna seo, tá bacteriophage Phi6 ionadaí tóir ar SARS-CoV-2 agus imchlúdach eile víris RNA pataigineach14,15.Úsáideadh RNA scoite ó cháithníní phage mar theimpléad do shintéis cDNA le leanúint ag PCR chun dhá bhlúire DNA de 117 agus 503 péire bonn a fháil ar fhad. Agus an dúshlán a bhaineann le \(943\,\hbox {bp}\) blúirí N1-N2 inár gcuid oibre roimhe seo a aimpliú, dírímid ar blúirí faid idirmheánacha (\(117) \, \hbox {bp}\) agus \(503 \,\hbox {bp}\)), bunaithe ar na primers atá ar fáil. Rinneadh staidéar córasach ar fhreagairt an bhraiteora leictriceimiceach thar raon comhchruinnithe leathan (\({10}\,{ \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) go \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) Don dá blúirí i láithreacht MB, tá éifeacht salainn ar fhreagra an bhraiteora tréithrithe agus tras-bhailíochtaithe ag tomhais speictrophotiméadracha. Seo a leanas príomhranníocaíochtaí na hoibre seo:
Cuireann fad blúirí DNA agus láithreacht salainn sa sampla isteach go mór ar íogaireacht.Léiríonn ár dtorthaí go mbraitheann gníomhaíocht leictriceimiceach ar mheicníochtaí éagsúla idirghníomhaíochta MB, DNA, agus an braiteoir sa fhreagra voltaiméadrach, ag brath ar thiúchan DNA agus fad, le Fragments níos faide léiríonn íogaireacht níos airde, cé go bhfuil tionchar diúltach ag salann ar idirghníomhaíochtaí leictreastatacha idir. MB agus DNA.
Cinneann tiúchan DNA meicníocht idirghníomhaíochta MB-DNA in leictreoidí neamhmhodhnaithe Léirímid go mbraitheann meicníochtaí éagsúla idirghníomhaíochta MB-DNA ar tiúchan DNA. {l}}}\), thugamar faoi deara go raibh an freagra sruth leictriceimiceach arna chinneadh go príomha ag asaithe MB-DNA ar an leictreoid, agus ag tiúchan níos ísle Ag tiúchan DNA arda, chinn an freagra reatha leictriceimiceach trí chosc steiriúil redox. gníomhaíocht mar gheall ar chur isteach MB idir péirí bonn DNA.
Braitheadh Leictriceimiceach ENIG PCB-Bhunaithe ar Aigéid Núicléacha Víreasacha i Samplaí Uisce Locha Rinneadh na breathnuithe a bhailíochtú trí bhrath leictriceimiceach ar blúirí DNA breisithe Phi6 \(503\,\hbox {bp}\) a fuarthas ó shamplaí uisce ó Powai Lake, Campas Mumbai IIT Phage Torthaí.
Costas íseal cur chun feidhme agus féidearthacht comhtháthú isteach i gcórais mhonatóireachta lán-uathoibrithe , oligonucleotides nó aptamers ar leictreoidí le seilfré níos faide.
Is víreas dsRNA clúdaithe den teaghlach Cytoviridae é Phage Phi6 a ionfhabhtaíonn Pseudomonas syringae.Tá genome Phi6 phage ann i bhfoirm 3 blúirí: S (\(2.95\,\hbox {Kb}\)), M ( \(4.07 \, \hbox {Kb} \)) agus L ( \ ( 6.37 \ , \ hbox{Kb} \ )) 16,17. Ós rud é go n-ionfhabhtaíonn an phage Phi6 brú Pseudomonas BSL-1 neamhphataigineach, tá sé sábháilte a úsáid agus is féidir é a fhás go héasca sa tsaotharlann.Phage Phi6 agus a óstach Pseudomonas syringae ceannaithe ó Ionad Tagartha Felix d'Herelle do Víris Baictéaracha, Ollscoil Laval, Ceanada (is iad HER-102 agus HER-1102 uimhreacha catalóg an ionaid tagartha, faoi seach) Rinneadh .Phi6 phage agus a óstach a athbheochan de réir mar a d'ordaigh an t-ionad tagartha. Rinneadh Phage Phi6 a íonú le pláta-lysis agus elution chun titers deiridh a fháil le \(\thart ar 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { ml}}\) (aonaid fhoirmithe plaic / millilítear). Rinneadh RNA a leithlisiú ó cháithníní phage íonaithe ag baint úsáide as an Trealamh um Íonú Iomlán RNA Iomlán GenElute™ (Sigma-Aldrich) de réir threoracha an déantóra. Go hachomair, fionraí Phi6 phage íonaithe\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) agus lódáladh an lysate ar cholún casadh chun ligean do RNA ceangal leis an gcolún roisín . Ansin fágtar an RNA sa tuaslagán elution \({ 50}\,{{\upmu\hbox {l}}}\) arna sholáthar ag an trealamh. Déan meastachán ar thiúchan RNA trí ionsúchán ag \(260\,\hbox {nm}\).Stóráladh RNA i slánchuid i \(260\,\hbox {nm}\). ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) go dtí go n-úsáidfear tuilleadh é.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) An iScript cDNA Sintéise Kit (Bio -Rad Laboratories) mar theimpléad do shintéis cDNA de réir threoracha an déantóra. Go hachomair, tá 3 chéim i gceist le imoibriú sintéise cDNA: é a thúsú ag \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min} }\) , tras-scríobh droim ar ais de \({20}\,{\hbox {min}}\) ag \({46}\,{^{\circ }\hbox {C}}\), agus droim ar ais Tá an taifeadán i \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) le haghaidh \({1}\,{\hbox {min }}\). Nuair a bhí sé á rith ar fhoirmiú agarose 1%, léirigh an cDNA trí bhanda a fhreagraíonn do na trí blúirí RNA a rabhthas ag súil leo (níl sonraí ar taispeáint). Baineadh úsáid as na primers seo a leanas chun dhá bhlúire DNA de 117 agus 503 bp ar fad a aimpliú, ag baint úsáide as cDNA mar theimpléad do PCR i timthriallta teirmeach miniPCR® mini8:
Freagraíonn na primers do \(117\,\hbox {bp}\) agus \(503\,\hbox {bp}\) do 1476-1575 núicléatídí den mhír M agus 458-943 núicléatídí den mhír L, faoi seach aigéad .Déanadh leictreafóiréis ar gach táirge PCR aimplithe ar glóthacha agarose 1%, agus íonaíodh sprioc-DNA aimplithe ag baint úsáide as Kit Eastóscadh Glóthach GeneJET (Thermo Fisher Scientific).
Baineadh úsáid as loch ag campas IIT Mumbai (Powai Lake, Powai, Mumbai) chun cáithníní phage a chur leis. Scagadh uisce an locha trí membrane \({5}\,{\upmu\hbox{m}}\) chun é a bhaint cáithníní ar fionraí, agus ansin cuireadh Phi6 phage leis. Cuir \({1}\,{\hbox {ml}}\) de \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} leis \) chuig \( {100} \ ,{\hbox {ml}}\) uisce locha scagtha, i \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\). in áirithe le haghaidh ualach víreasach a thomhas trí mheasúnacht plaic. Thástáil muid dhá mhodh dhifriúla chun cáithníní víreas Phi6 spiked a chomhchruinniú: (1) an modh asaithe-deasú hiodrocsaíd alúmanaim,19 atá bailíochtaithe le haghaidh roinnt víris RNA clúdaithe ó shamplaí comhshaoil a chomhchruinniú, agus (2) ) Rinneadh an modh comhchruinnithe víreas atá bunaithe ar poileitiléin glycol (PEG) a oiriúnú ó Flood et al.20 . Ós rud é go bhfuarthas go raibh éifeachtacht aisghabhála an mhodha PEG-bhunaithe níos fearr ná an modh hiodrocsaíd alúmanaim, baineadh úsáid as an modh PEG-bhunaithe chun cáithníní Phi6 a chomhchruinniú ó shamplaí uisce locha.
Ba é seo a leanas an modh PEG a úsáideadh: Cuireadh PEG 8000 agus \(\hbox {NaCl}\) le samplaí uisce locha a bhfuil spíc orthu Phi6 chun 8 % PEG 8000 agus \(0.2\,\hbox {M} \) \( \hbox {NaCl}\).Goraíodh samplaí ar chroiteoir\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), ansin lártheifneoirithe ag \(4700 \,\hbox {g}\) is \({45}\,{\hbox {min}}\).Caith amach an comhshnáthán agus cuir an millín arís ar fionraí in \({1}\, {\hbox {ml}}\) san fhorshnáthán céanna.Rinneadh na turgnaimh spiking agus comhchruinnithe víreas ar fad i dtiúcháin faoi thrí. Tar éis tiúchana, cuireadh slánchuid bheag in áirithe chun éifeachtacht aisghabhála a thomhas trí mheasúnacht phlaic. i maolán elution arna sholáthar ag trealamh \({40}\,{\upmu \hbox {l}}\). Ós rud é go n-athróidh an tiúchan RNA ó shampla go sampla faoi thrí, beidh an \({2}\,{\upmu\) Úsáidtear hbox {l}}\) de RNA do na trí cinn beag beann ar a thiúchan cDNA shintéis de shamplaí.Rinneadh sintéis cDNA mar a thuairiscítear roimhe seo.\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNA Baineadh úsáid as mar theimpléad le haghaidh \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR ar feadh 35 thimthriall chun \(117\,\hbox {bp}\) agus \(503\,\hbox { a mhéadú bp}\) blúirí. Léirítear na samplaí seo mar “1:1″, .i. gan caolú. Socraíodh rialú gan teimpléad (NTC) mar rialú diúltach, agus socraíodh cDNA a shintéisiú ag baint úsáide as RNA scoite ó phage íonaithe mar theimpléad do rialú dearfach (PC).Rinneadh Cainníochtúil PCR (qPCR) in ionstraim Stratagene Mx3000P RT-PCR ag baint úsáide as Brilliant III Ultra-Gasta SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies). Socraíodh frithghníomhartha i dtrí chóip mar a bhí roimhe seo cur síos air.Taifeadadh an tairseach timthrialla (Ct) le haghaidh gach sampla. Chomh maith leis sin, baineadh úsáid as na samplaí caolaithe \({1}\,{\upmu\hbox {l}}\) ag úsáid cDNA caolaithe 1:100 in uisce locha scagtha mar \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR ar feadh 35 timthriall. Léirítear na samplaí seo mar “1:100″.
Déantar na leictreoidí PCB a mhonarú ag baint úsáide as próiseas ísealchostas Electroless Nickel Immersion Gold (ENIG) atá ar fáil go tráchtála gan gá le plating óir breise.Tá sonraíochtaí leictreoidí ENIG PCB mionsonraithe inár n-obair roimhe seo11.For ENIG leictreoidí PCB, modhanna glantacháin leictreoid traidisiúnta mar shampla ní mholtar tuaslagán piranha nó voltaiméadracht chiorclach d'aigéad sulfarach mar go bhféadfadh siad a bheith ina gcúis le feannadh na sraithe tanaí óir (tiús \(\ approx\) \(100\,\hbox {nm }\)) agus na sraitheanna copair bhunúsacha atá seans maith a nochtadh. le creimeadh 21, 22, 23, 24, 25.Mar sin, glan na leictreoidí le héadach gan lint arna thaisiú le IPA. Goradh an sampla a bhí le tástáil le \({50}\,{\upmu\hbox {M} }\) MB in \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) chun é a chur isteach go héasca.In ár gcuid oibre roimhe seo , thugamar faoi deara gur feabhsaíodh íogaireacht agus líneacht an bhraiteora tríd an tiúchan MB a mhéadú 11 . tiúchain chun DNA a leabú sa staidéar seo.Is féidir braite leictriceimiceach DNA dúbailte-shnáithe (ds-DNA) a bhaint amach trí úsáid a bhaint as intercalators anionic nó cationic.Cé go n-aimsíonn intercalators anionic DNA le roghnaíocht níos fearr, éilíonn siad goir thar oíche, agus mar thoradh ar amanna braite níos faide. ar an láimh eile, teastaíonn amanna goir níos giorra, tuairim is \({1}\,{\hbox {h}}\) le hidircalaitheoirí cationiceacha ar nós MB chun ds-DNA6 a bhrath leictriceimiceach. Baineann gach tomhas le dáileadh an tsampla atá le tástáil ar an leictreoid\({5}\,{{\upmu\hbox {l}}}\), ansin glanadh le ceirt taisithe IPA, sula lean tú ar aghaidh le sampla eile.Rinneadh tástáil ar thomhas amháin.Gach sampla ar 5 leictreoid dhifriúla mura sonraítear a mhalairt. Rinneadh DPV agus tomhais CV ag baint úsáide as potentiostat PalmSens Sensit Smart, agus úsáideadh bogearraí PSTrace le haghaidh cumraíochta potentiostat agus sonraí a fháil, lena n-áirítear ríomhanna reatha buaic. Úsáidtear na socruithe seo a leanas le haghaidh tomhais DPV agus CV:
DPV: Am Cothromaíochta = \(8\,\hbox {s}\), Voltage Step = \(3\,\hbox {mV}\), Pulse Voltage = \(25\,\hbox {mV}\), ré cuisle = \(50\,\hbox {ms}\), ráta scan = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: Am Cothromaíochta = \(8\,\hbox {s}\), Voltage Step = \(3\,\hbox {mV}\), Ráta Scuabtha = \({300}\,\hbox {mV/ s }\)
Buaicsruthanna a fhaightear ó bholtamagraim DNA arna gcoimpliú le \({50}\,{\upmu\hbox {M}}\) MB: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
Fuarthas voltamagraim DPV agus CV ar leictreoidí ENIG PCB \({50}\,{\upmu\hbox {M}}\) MB coimpléascach le DNA (ag tiúchan 10–\({20}\,{\hbox {ng }/{\upmu \hbox {l}}}\) ie 0.13–\({0.26}\,{\upmu\hbox {M}}\) le haghaidh \(117\,\hbox {bp}\ ) agus 0.03 –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) le haghaidh \(503\,\hbox {bp}\)).Taispeántar voltamagramanna ionadaíocha i bhFíor S1 san Fhaisnéis Fhorlíontach. Taispeánann Fíor 2 na torthaí de thomhais DPV agus CV (buaicsrutha) ag baint úsáide as táirgí PCR glóthach-íonaithe. I gcomparáid le tomhais CV, léiríonn tomhais DPV íogaireacht níos airde (reatha mar fheidhm de thiúchan DNA) toisc go folaíonn na sruthanna capacitive cúlra i dtomhais CV sruthanna Faradaic 26 .Na sonraí i gcás gach bosca sa bhosca tá tomhais ó 5 leictreoid. Úsáideann gach tomhas an tsraith chéanna leictreoidí chun earráidí tomhais a sheachaint mar gheall ar éagsúlacht leictreoid-go-leictreoid. Thugamar faoi deara treocht mhéadaitheach i mbuaicsruthanna tomhaiste DPV agus CV do thiúchan níos ísle DNA. , níos faide (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ i gcomparáid le \(117) ) fragment.Tá sé seo comhsheasmhach leis an treocht asaithe leictreoid a bhfuiltear ag súil leis a tuairiscíodh inár gcuid oibre roimhe seo. Éascaíonn asaithe an choimpléasc MB-DNA an t-aistriú muirear ar an leictreoid, rud a chuireann le méadú ar an buaic reatha.Tá staidéir eile tar éis a thaispeáint ar an éifeacht méid oligonucleotide agus seicheamh ar MB-DNA intercalation27,28,29,30.The guanine -cytosine (GC) bhí thart ar 50% ar ábhar an dá aimplicain (\(117\,\hbox {bp}\) agus \(503\,\hbox {bp}\)), rud a thugann le fios go bhfuil an bhreathnóireacht dlite don difríocht chun fad amplicon. Mar sin féin, le haghaidh tiúchan DNA níos airde (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu\hbox {l}}}\), le haghaidh \(503\,\hbox {bp} \) agus \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu\hbox {l}}}\) le haghaidh \(117\,\hbox {bp}\)), breathnaimid ar dhá aimpliú an laghdaítear buaicsruthanna na bhfostaithe i dtomhais DPV agus CV araon. Tá sé seo amhlaidh toisc go sáithíonn MB agus go n-idirlíonann sé idir bunphéirí DNA, rud a fhágann go mbíonn cosc steiriúil ar ghníomhaíocht ocsaí an ghrúpa in-aistrithe i MB31,32.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \, \hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV。
Cuireann salainn atá i meascáin máistir PCR isteach ar idirghníomhaíochtaí leictreastatacha idir MB agus DNA, mar sin trí \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) a chur leis \({50} \,{\). upmu \hbox {M}}\) Táirge glóthach-íonaithe MB chun staidéar a dhéanamh ar éifeacht an tsalainn ar idirghníomhú MB-DNA. Mar a léirítear i bhFíor 3, thugamar faoi deara le haghaidh tiúchan DNA níos airde (\(>{2}\,{\) hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) agus \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu\hbox { l}}}\) do \(117\,\hbox {bp} \)), i DPV agus CV Ní raibh tionchar suntasach ag an gcur leis salainn ar na tomhais (féach Fíor S2 san Fhaisnéis Fhorlíontach le haghaidh voltamagraim ionadaíocha). Mar sin féin, ag tiúchan DNA níos ísle, laghdaíonn an Chomh maith salainn íogaireacht go mór, rud a fhágann nach bhfuil aon athrú suntasach ar an sruth le tiúchan DNA. Éifeachtaí diúltacha den chineál céanna salainn ar MB-DNA idirghníomhaíochtaí agus intercalation a tuairiscíodh roimhe seo ag taighdeoirí eile33,34.\(\hbox { Mg}^{2+}\) ceanglaíonn caitiúcháin le cnámh droma fosfáite diúltach DNA, rud a chuireann bac ar an idirghníomhaíocht leictreastatach idir MB agus DNA. Ag tiúchan DNA níos airde, bíonn buaicsruthanna níos ísle mar thoradh ar chosc steiriúil ar MBanna redox-ghníomhacha, agus mar sin bíonn buaicsruthanna níos ísle ann. Ní chuireann siad isteach go mór ar fhreagairt an bhraiteora. Is é an príomhphointe ná go bhfuil an bithbhraiteoir seo níos oiriúnaí chun tiúchan DNA níos airde a bhrath (is annamh \({\hbox {ng}/{\upmu\hbox {l}}}\) nó níos airde), chun samplaí uisce comhshaoil a phróiseáil go hiomlán uathoibrithe, i gcás nach mbeadh sé indéanta táirgí PCR a íonú glóthach.
Achar faoin gcuar ionsúcháin don raon tonnfhaid 600–700 \(\hbox {nm}\) do thiúchan éagsúla DNA arna gcoimpliú le \({50}\,{\upmu\hbox {M}}\) MB: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) le agus gan salann (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) le agus gan salann (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) Tiúchan DNA a fhreagraíonn do \({50}\,{\upmu\hbox {M}}\) Samplaí MB Níl DNA ann.
Chun na torthaí thuas a fhíorú tuilleadh, rinneamar tomhais optúla ag úsáid speictreafótaiméadar UV/Vis (Thermo Scientific Multiskan GO), baineadh úsáid as na samplaí \({50}\,{{\upmu\hbox {l}}}\) do gach ceann díobh. Tomhas. Laghdaíonn an síniú ionsúcháin le méadú ar an tiúchan DNA, mar is léir ó threocht an limistéir faoin gcuar ionsúcháin don raon tonnfhad \(600\,\hbox {nm}\) go \(700\,\hbox { nm}\ ), mar a thaispeántar i bhFíor 4 (speictream ionsúcháin léirithe i bhFíor. S3 san Fhaisnéis Bhreise). {l}}}\), ní raibh aon difríocht shuntasach i nglacadh idir samplaí DNA iontu agus MB-amháin (do \(503\,\hbox {bp}\) agus \(117\,\hbox {bp}\). ) blúirí faid), rud a thugann le fios nach raibh cosc steiriúil ar MB.Ag redox-ghníomhach i dtiúchan DNA níos airde, thugamar faoi deara laghdú de réir a chéile ar an comhartha ionsúcháin agus thugamar faoi deara laghdú níos lú ar ionsúiteacht i láthair salainn. Cuireadh na torthaí seo i leith móilíneach idirghníomhaíochtaí agus cosc steiriceach le cruachta bonn i hibridí DNA.Tá ár dtorthaí comhsheasmhach le tuairiscí sa litríocht ar staidéir speictreascópacha ar idirghaolú MB-DNA a nascann hipochromaticity le leibhéil laghdaithe fuinnimh i \(\pi\)–\(\pi^*\ ) trasdulta leictreonacha de bharr idirghéilleadh Sraitheanna 36, 37, 38.
Leictreafóiréis glóthach agarose de phage Phi6: táirgí PCR ar fad \(117\,\hbox {bp}\) agus \(503\,\hbox {bp}\) ó shamplaí uisce locha.M-DNA marcóir;Rialú NTC-gan-teimpléad, primers ina bhfuil amplicons comhfhreagracha;rialú dearfach PC;Samplaí uisce locha spiked 1, 2, 3-neamhchaolaithe (1:1) i dtrí-bhanda. Tá banda le feiceáil ag \(\thart ar 50\,\hbox {bp}\) mar gheall ar oligonucleotides neamhúsáidte sa \(503\,\ hbox {bp}\) lána.
Rinneamar measúnú ar áirgiúlacht an bhraiteora ag baint úsáide as samplaí uisce Powai Lake a spíosadh le Phi6 phage. Bhí na tiúchain RNA scoite ó shamplaí uisce phage-spiked sa raon ó 15.8–\({19.4}\,{\upmu\hbox {g}/\hbox { ml}}\), agus iad siúd scoite amach ó fhionraí phage íonaithe Measadh gurb é \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) an RNA le héifeachtacht aisghabhála thart ar 1 % Trascríobhadh RNA droim ar ais go cDNA agus úsáideadh é mar theimpléad le haghaidh PCR agus qPCR.Deimhnigh leictreafóiréis glóthach agarose (Fíor 5) roimh thástáil leis an braiteoir.Ní dhéantar glóthacha íonaithe sna samplaí seo agus mar sin tá gach comhpháirt PCR iontu mar chomh maith leis na aimplitiúid spéise. Taispeánadh go bhfuil comhghaol idir na luachanna Ct a taifeadadh le linn qPCR (Tábla 1) le tiúchan RNA scoite ó na samplaí uisce spíceacha comhfhreagracha. Nochtann luach Ct líon na dtimthriallta a theastaíonn chun an comhartha fluaraiseacha a níos mó ná an tairseach nó cúlra signal.Higher Ct luachanna le fios tiúchain teimpléad níos ísle agus vice versa.The Ct luachanna na samplaí NTC a bhí chomh hard le expect.The difríocht i \(\thart ar 3\) Ct luachanna idir léiríonn an rialú dearfach agus an sampla tástála a thuilleadh go bhfuil thart ar 1% teimpléad ag gach sampla tástála i gcomparáid leis an rialú dearfach. Táimid tar éis a phlé roimhe seo go bhfuil íogaireacht níos fearr mar thoradh ar aimpliáin níos faide. le tiúchan víreasach íseal agus díghrádú RNA. Mar sin féin, lenár saibhriú víreas agus prótacal aimplithe PCR, bhíomar in ann an blúire \(503\,\hbox {bp}\) a mhéadú go rathúil le haghaidh braite leictriceimiceach.
Taispeánann Fíor 6 torthaí braite leictriceimiceach an aimplicon blúire \(503\,\hbox {bp}\), ag baint úsáide as cDNA neamhchaolaithe mar theimpléad (1:1) agus cDNA caolaithe 100-huaire mar theimpléad (1:100 ) a dhéantar PCR , i gcomparáid le NTC agus PC (féach Fíor S4 i bhFaisnéis Fhorlíontach le haghaidh voltamogramanna ionadaíocha).Tá tomhais ó thrí shampla ag 5 leictreoid i ngach bosca sa bhoscaphlota i bhFíor 6. Baineadh úsáid as na leictreoidí céanna chun gach sampla a thomhas chun earráidí de bharr leictreoid a sheachaint -go-leictreoid variation.Compared le tomhais CV, léiríonn tomhais DPV réiteach níos fearr chun idirdhealú a dhéanamh ar shamplaí tástála agus PC ó NTCs mar, mar a luadh cheana, sruthanna Faradaic i bhfolach mar gheall ar chúlra sruthanna capacitive sa dara. mar thoradh ar an rialú diúltach (NTC) bhí buaicsruthanna CV agus DPV níos airde i gcoibhneas leis an rialú dearfach, ach léirigh samplaí tástála dearfacha agus neamhchaolaithe buaicairde comhchosúla de bhuaicsruthanna DPV.The tomhaiste meán agus meánluachanna do gach neamhchaolaithe (1:1 ) Is féidir sampla tástála agus PC a réiteach go soiléir ón aschur braiteoir don sampla NTC, cé go bhfuil an réiteach don sampla caolaithe 1:100 níos lú pronounced.For caolú 100-huaire de cDNA, ní raibh muid faoi deara aon bannaí le linn leictreafóiréis glóthach (lánaí nach dtaispeántar i bhFíor 5), agus bhí na buaicsruthanna comhfhreagracha DPV agus CV cosúil leis na cinn a rabhthas ag súil leo do NTC.Tá na torthaí don bhlúire \(117\,\hbox {bp}\) léirithe san Fhaisnéis Fhorlíontach.An diúltach rialú spreagtha freagra leictriceimiceach ón braiteoir PCB mar gheall ar asaithe MB saor in aisce ar an leictreoid agus idirghníomhú an MB leis an oligonucleotide primer aon-snáithe. buaicsruth an tsampla tástála i gcomparáid leis an mbuaicsruth a fhaightear ón rialú diúltach chun tomhas difreálach (coibhneasta)39,40 a bhaint amach chun an sampla tástála a rangú mar dheimhneach nó diúltach.
(a) DPV, agus (b) buaicsruth CV chun blúirí \(503\,\hbox {bp}\) a bhrath i samplaí uisce locha leictriceimiceach. rialuithe dearfacha (PC).
Léiríonn ár dtorthaí meicníochtaí éagsúla a théann i bhfeidhm ar fheidhmíocht braiteoirí leictriceimiceacha d'aimpíní faid éagsúla do DNAanna éagsúla, le tiúchain arna bhfíorú ag tomhais optúla ag baint úsáide as speictreafótaiméadar UV/Vis. Leagann ár dtuairimí béim ar an léargas go blúirí DNA níos faide suas go dtí \(\approx\) Is féidir \(500\,\hbox {bp}\) a bhrath le híogaireacht níos airde agus nach ndéanann láithreacht salainn sa sampla Íogaireacht tiúchan DNA a chuireann isteach ar íogaireacht níos airde (go hannamh \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) agus os a chionn). Chomh maith leis sin, rinneamar imscrúdú ar éifeacht cineálacha éagsúla samplaí, lena n-áirítear amplicons glóthach-íonaithe le agus gan salann breise, agus samplaí uisce locha i dtomhais DPV agus CV.Thugamar faoi deara gur sholáthair DPV réiteach níos fearr, ós rud é go mbíonn tionchar ag an sruth capacitive cúlra freisin ar thomhas CV, rud a fhágann nach bhfuil sé chomh híogair.
Braitheann aimpliú blúirí níos faide ar shláine an RNA ghéanómach víreasach.Tá sé léirithe ag roinnt staidéir nach mbíonn aimpliú blúirí níos faide éifeachtach i gcónaí mar gheall ar dhíghrádú RNA sa chomhshaol agus an fhéidearthacht splicing le linn aonraithe11,41,42,43,44 . Thugamar faoi deara go raibh an modh tiúchan víreas PEG-bhunaithe níos éifeachtaí chun phage Phi-6 spiked a dhíriú i samplaí uisce locha ná an modh tiúchan víreas hiodrocsaíd-bhunaithe alúmanaim. chun teimpléid iolracha faid níos giorra a mhéadú agus an fhéidearthacht tras-sainiúlacht a laghdú.
Tá samplaí bitheolaíocha gann, mar sin tá gá le bithbhraiteoir a dhearadh a éilíonn samplaí íosta le haghaidh tástála. Ní raibh de dhíth ar na leictreoidí PCB ENIG a úsáideadh sa staidéar seo ach \({5}\,{{\upmu\hbox {l}}}\ ) samplaí le haghaidh tástála chun limistéar éifeachtach na leictreoidí a chlúdach.Additionally, is féidir an leictreoid chéanna a athúsáid tar éis a ghlanadh roimh dháileadh an chéad sampla eile.Ní gá samplaí aimplithe aon cheimiceáin seachas gorm meitiléine a chur leis, rud atá saor agus ceimiceach a úsáidtear go coitianta. Ós rud é go gcosnaíonn gach leictreoid thart ar $0.55 (nó INR 40) le monarú, is féidir leis an bithbhraiteoir seo a bheith ina rogha malartach cost-éifeachtach ar theicneolaíochtaí braite atá ann cheana féin. Léiríonn Tábla 2 comparáid idir an obair seo agus braiteoirí eile a thuairiscítear sa litríocht le fada blúirí DNA i samplaí ilchineálach.
Ós rud é go bhfuil prótacail braite leictriceimiceach MB-bhunaithe ag brath ar shainiúlacht PCR, teorannú mór ar an modh seo is ea an acmhainneacht le haghaidh aimpliú neamhshonrach i samplaí ilchineálacha amhail fuíolluisce agus uisce locha nó úsáid a bhaint as primers íseal-íonachta. modhanna braite leictriceimiceach chun DNA a bhrath ar tháirgí PCR neamhíonaithe ag baint úsáide as leictreoidí ENIG PCB neamh-athraithe, is gá tuiscint níos fearr a fháil ar earráidí a tugadh isteach ag dNTPanna agus primers neamhúsáidte, agus chun coinníollacha imoibrithe agus prótacail measúnachta a bharrfheabhsú. d'fhéadfadh go mbeadh gá le héileamh ocsaigine (BOD) den sampla uisce a thomhas freisin chun cruinneas an tomhais a fheabhsú.
Mar fhocal scoir, molaimid braiteoir ENIG PCB leictriceimiceach ar chostas íseal le haghaidh víreas a bhrath i samplaí comhshaoil (uisce locha). Murab ionann agus leictreoidí oligonucleotide díluailithe nó foshraitheanna saincheaptha le haghaidh braite DNA a éilíonn stóráil chrióigineach chun íogaireacht a choinneáil,53,54 úsáideann ár dteicníc PCB neamhmhodhnaithe. leictreoidí a bhfuil seilfré níos faide acu agus gan aon riachtanais shonracha stórála acu agus dá bhrí sin atá oiriúnach chun réitigh tomhais a fhorbairt le próiseáil samplach uathoibrithe arna n-imscaradh i LMICs.Úsáideann an bithbhraiteoir ruaimeanna ocsaí DNA-idirghaolaithe (MB) neamhchostasach chun sprioc-amplicons a bhrath go tapa. An aimpliú neamhshonrach coitianta i samplaí comhshaoil laghdaítear sainiúlacht an mhodha braite seo mar gheall ar cheangal nonspecific MBanna le oligonucleotides singil agus dhá shnáithe. Mar sin, braitheann sainiúlacht na tástála seo ar bharrfheabhsú primers agus coinníollacha imoibrithe PCR. Ina theannta sin, an CV agus ba cheart buaicsruthanna DPV a fhaightear ó na samplaí tástála a léirmhíniú i gcoibhneas leis na freagairtí a fhaightear ón rialú diúltach (NTC) do gach tástáil.Is féidir na dearaí agus na modhanna braite leictriceimiceach a chuirtear i láthair san obair seo a chomhtháthú le huathshamplóirí chun leibhéal iomlán uathoibrithe agus íseal a fhorbairt. - réiteach costais ar féidir samplaí a bhailiú agus a anailísiú agus torthaí a tharchur ar ais chuig an tsaotharlann gan sreang .
Cashdollar, J. & Wymer, L. Modhanna le haghaidh tiúchan tosaigh víris ó shamplaí uisce: athbhreithniú agus meitea-anailís ar staidéir le déanaí.J.Feidhm.micro-orgánach.115, lgh 1-11 (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL Víris uisce-iompartha: Bacainní ar uisce óil sábháilte.PLoS Pathogens.11, E1004867 (2015).
Shrestha, S. et al.Eipidéimeolaíocht dramhuisce le haghaidh faireachas cost-éifeachtach ar mhórscála ar COVID-19 i dtíortha ísealioncaim agus meánioncaim: dúshláin agus deiseanna.Uisce 13, 2897 (2021).
Palecek, E. & Bartosik, M. Aigéad núicléach electrochemistry.Chemical.Rev.112, 3427–3481 (2012).
Tani, A., Thomson, AJ & Butt, JN Meitiléine gorm mar idirdhealú leictriceimiceach ar oligonucleotides aonshnáithe agus dúbailte díluailithe ar fhoshraitheanna óir.Anailísí 126, 1756–1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ Comparáid idir Cation and Anion Intercalators for Transduction Leictriceimiceach Hibridiú DNA trí Long-Raoin Aistriú Leictreon.Electrochemistry.comminicate.6, 648-654 (2004).
Wong, EL & Gooding, JJ Aistriú muirear trí DNA: biosensor.anus.Chemical DNA leictriceimiceach roghnaíoch.78, 2138–2144 (2006).
Fang, TH et al.Fíor-am gléas PCR micreashreabhach le braite leictriceimiceach comhthráthach.Bioelectronics.24, 2131-2136 (2009).
Staidéar meicníochta Win, BY et al.Signaling agus fíorú feidhmíochta ar chóras PCR leictriceimiceach fíor-ama bunaithe ar idirghníomhú gorm meitiléine le DNA.Analyst 136, 1573-1579 (2011).
Ramirez-Chavarria, RG et al.Loop-mediated Braiteoir leictriceimiceach bunaithe ar aimpliú isothermal chun sars-cov-2 a bhrath i samplaí fuíolluisce.J.Comhshaol.Ceimiceach.Britain.10, 107488 (2022).
Kumar, M. et al.Electrochemical braite de SARS-CoV-2 amplicons le leictreoidí PCB.Tá an braiteoir ngníomh.B Chemistry.343, 130169 (2021).
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. & Yoshida, H. Brath éifeachtach SARS-CoV-2 RNA sa chodán soladach de wastewater.science.general environment.763, 144587 (2021).
Alygizakis, N. et al.Modhanna Anailíseacha chun SARS-CoV-2 a Bhrath i bhFuíolluisce: Prótacal agus Peirspictíochtaí sa Todhchaí.TraC trending anal.Chemical.134, 116125 (2020).
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. & Kashtan, N. Marthanais an bhaictéarophage clúdaithe Phi6 (ionadaí do SARS-CoV-2) i braoiníní seile galaithe a thaisceadh ar dhromchlaí gloine.science.Rep.10, 1–10 (2020).
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ Marthanacht comhshaoil surrogate SARS-CoV-2 (Phi6) in amoeba.J.Sláinte Uisce 20, 83 (2021).
Mindich, L. Pacáistiú beacht de thrí blúirí géanómacha de bhaictéarophage RNA dháshnáithe \(\varphi\)6.microorganism.Moore.biology.Rev.63, 149–160 (1999).
Pirttimaa, MJ & Bamford, Struchtúr tánaisteach an DH RNA phage \ (\varphi\)6 pacáistiú réigiún.RNA 6, 880-889 (2000).
Bonilla, N. et al.Phages on the Tap – Prótacal tapa agus éifeachtach chun stoic saotharlainne baictéarophages a ullmhú.PeerJ 4, e2261 (2016).
Am postála: Bealtaine-27-2022