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L'importance de la surveillance des échantillons environnementaux a été grandement appréciée depuis le début de la pandémie de COVID-19, et certains efforts de surveillance sont effectués à l'aide de l'étalon-or, bien que les techniques basées sur la qPCR soient coûteuses. Les biocapteurs d'ADN électrochimiques pourraient fournir une solution potentiellement rentable solution pour surveiller les échantillons d'eau environnementale dans les pays à revenu faible et intermédiaire. Dans ce travail, nous démontrons la détection électrochimique des amplicons obtenus à partir du phage Phi6 isolé à partir d'échantillons d'eau de lac dopés (un substitut populaire pour le SRAS-CoV-2), en utilisant ENIG pour compléter les électrodes PCB sans modification de surface.sexe. La réponse du capteur électrochimique a été minutieusement caractérisée pour deux fragments d'ADN de longueurs différentes (\({117}\,\hbox {bp}\) et \({503}\,\hbox {bp}\)), et le effet des sels dans les mélanges maîtres PCR sur les interactions bleu de méthylène (MB)-ADN.Nos résultats montrent que la longueur des fragments d'ADN détermine de manière significative la sensibilité électrochimique et démontrent dans ce travail que la capacité à détecter de longs amplicons sans purification sur gel des produits PCR est important pour la mesure in situ des échantillons d'eau.Une solution entièrement automatisée pour la charge virale est de bon augure.
La transmission de virus par l'eau est connue comme un danger pour la santé publique depuis les années 1940, avec les premières preuves de transmission par l'eau de la poliomyélite et de l'hépatite E1. L'Organisation mondiale de la santé (OMS) a classé plusieurs agents pathogènes viraux d'origine hydrique d'importance sanitaire modérée à élevée2. Virus traditionnel les méthodes de détection reposent sur des techniques de référence basées sur la qPCR, qui sont très sensibles et spécifiques, mais nécessitent un personnel qualifié pour effectuer les tests en laboratoire à l'aide d'instruments coûteux. les tests d'échantillons sont susceptibles de prendre le pas sur la surveillance des échantillons d'eau environnementale. Par conséquent, des méthodes alternatives à faible coût sont nécessaires pour une surveillance durable et en temps réel des échantillons d'eau et d'eaux usées dans les pays à revenu faible et intermédiaire en tant qu'alertes précoces des épidémies émergentes, les protégeant ainsi des graves impacts socio-économiques de la pandémie de virus. Des biocapteurs électrochimiques à faible coût pour les acides nucléiques pourraient fournir une solution potentielle prometteuse à ce besoin non satisfait. Beaucoup de ces biocapteurs à ADN fonctionnent grâce au fait que des brins d'ADN complémentaires sont immobilisés sur l'électrode surface et s'hybrident lorsqu'une séquence correspondante est présente dans l'échantillon. Celle-ci peut ensuite être convertie en un signal par diverses techniques électrochimiques utilisant des médiateurs redox tels que le fer/ferrocyanure de potassium. Le bleu de méthylène (MB) est l'une de ces molécules actives redox, qui a Il a été rapporté qu'ils s'intercalaient dans l'ADN double brin (ADNdb) en plus de sa liaison plus non spécifique à l'ADN simple brin5,6. La nature intercalante des MB pour former des complexes MB-ADN en fait un choix populaire en tant que médiateurs redox dans plusieurs ADN électrochimiques. configurations de capteur5,6,7,8,9.Bien que l'intercalation de MB à l'ADN soit non spécifique et que la spécificité de ce capteur électrochimique dépende largement de la pureté des amorces utilisées pour la PCR ou l'amplification isotherme, il est bien adapté à la mise en œuvre de véritables qPCR à base électrochimique de temps ou amplification isotherme de fluorescence comme alternative à la mesure de la concentration d'ADN 9. Dans une telle mise en œuvre, Won et al. mesure des amplicons PCR avec MB à l'aide de la voltampérométrie différentielle à impulsions (DPV)9. Dans d'autres cas, Ramirez et al. utilisés comme électrodes in situ dans une plate-forme PCR microfluidique conçue pour détecter électrochimiquement les amplicons lors des réactions 8. Toutes ces études nécessitent une modification de surface des électrodes, ce qui implique une augmentation des coûts de production et d'exploitation en raison des exigences de stockage particulières pour la stabilité de ces électrodes fonctionnalisées.
Schéma du flux de travail pour la détection électrochimique des amplicons obtenus à partir de particules virales concentrées dans des échantillons d'eau de lac.
Nous avons récemment démontré la détection électrochimique des amplicons du SRAS-CoV-2 avec des électrodes de carte de circuit imprimé (PCB) à faible coût basées sur la DPV et la voltamétrie cyclique (CV) induites par l'adsorption de complexes MB-ADN à la surface d'électrodes non modifiées) changements de pic courant11.Nous rapportons que des fragments d'ADN plus longs (N1-N2, \({943}\, \hbox) formés à l'aide des amorces N1 directe et inverse N2 recommandées par le CDC par rapport à des fragments plus courts {bp}\)) ont montré une meilleure linéarité dans la réponse du capteur ( N1, \(72\,\hbox {bp}\)) formé à l'aide d'ensembles d'amorces N1 sens et N1 sens inverse. Ces études sont rapportées à l'aide de dilutions d'ADN préparées dans de l'eau sans nucléase. La plate-forme a également été utilisée pour détecter le SRAS-CoV -2 amplicons dans des échantillons d'eaux usées simulés (obtenus en dopant des échantillons d'ARN total avec de l'ARN du SRAS-CoV-2). Étant donné que l'ARN est sensible au cisaillement pendant l'isolement et le traitement en aval,12,13 il est difficile d'amplifier des fragments plus longs avec cet échantillon hétérogène. Par conséquent, la démonstration de la détection électrochimique de l'amplicon du SRAS-CoV-2 dans les eaux usées est limitée au fragment N1 \(72\,\hbox {bp}\) plus court.
Dans ce travail, nous avons étudié la faisabilité de la détection électrochimique à base de PCB ENIG du phage Phi6 concentré et isolé à partir d'échantillons d'eau de lac (Fig. 1). Les phages Phi6 sont de taille comparable (80-100 nm) au SARS-CoV-2 et ont également une membrane lipidique et une protéine de pointe. Pour ces raisons, le bactériophage Phi6 est un substitut populaire du SRAS-CoV-2 et d'autres virus à ARN pathogènes enveloppés14,15. PCR pour obtenir deux fragments d'ADN de 117 et 503 paires de bases de longueur.Étant donné le défi d'amplifier les fragments \(943\,\hbox {bp}\) N1-N2 dans nos travaux précédents, nous ciblons les fragments de longueur intermédiaire (\(117 \,\hbox {bp}\) et \(503 \,\hbox {bp}\)), sur la base des amorces disponibles. La réponse électrochimique du capteur a été systématiquement étudiée sur une large plage de concentration (\({10}\,{ \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) à \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) Pour les deux fragments dans la présence de MB, l'effet du sel sur la réponse du capteur a été caractérisé et contre-validé par des mesures spectrophotométriques. Les principaux apports de ce travail sont les suivants :
La longueur des fragments d'ADN et la présence de sel dans l'échantillon affectent fortement la sensibilité.Nos résultats montrent que l'activité électrochimique dépend de différents mécanismes d'interaction du MB, de l'ADN et du capteur dans la réponse voltamétrique, en fonction de la concentration et de la longueur de l'ADN, les fragments plus longs présentant une sensibilité plus élevée, bien que le sel ait un effet négatif sur les interactions électrostatiques entre MB et ADN.
La concentration d'ADN détermine le mécanisme d'interaction MB-ADN dans les électrodes non modifiées Nous démontrons que différents mécanismes d'interaction MB-ADN dépendent de la concentration d'ADN. À des concentrations d'ADN inférieures à une petite quantité de \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), nous avons observé que la réponse du courant électrochimique était principalement déterminée par l'adsorption de MB-DNA sur l'électrode, tandis qu'à des concentrations plus faibles À des concentrations élevées d'ADN, la réponse du courant électrochimique était déterminée par l'inhibition stérique du redox activité due à l'insertion de MB entre les paires de bases d'ADN.
ENIG PCB-Based Electrochemical Sensing of Viral Nucleic Acids in Lake Water Samples Les observations ont été validées par la détection électrochimique de fragments d'ADN \(503\,\hbox {bp}\) ajoutés à Phi6 obtenus à partir d'échantillons d'eau du lac Powai, IIT Mumbai Campus Phage de résultat.
Faible coût de mise en œuvre et potentiel d'intégration dans des systèmes de surveillance entièrement automatisés, des oligonucléotides ou des aptamères sur des électrodes avec une durée de conservation plus longue.
Le phage Phi6 est un virus à ARNdb enveloppé de la famille des Cytoviridae qui infecte Pseudomonas syringae. Le génome du phage Phi6 existe sous forme de 3 fragments : S (\(2.95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4.07 \,\hbox {Kb}\)) et L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\))16,17. Étant donné que le phage Phi6 infecte une souche non pathogène de Pseudomonas BSL-1, son utilisation est sans danger et peut être facilement cultivé en laboratoire. Le phage Phi6 et son hôte Pseudomonas syringae ont été achetés au Centre de référence Félix d'Hérelle pour les virus bactériens, Université Laval, Canada (les numéros de catalogue du centre de référence sont HER-102 et HER-1102, respectivement) Le phage .Phi6 et son hôte ont été relancés selon les directives du centre de référence. Le phage Phi6 a été purifié par lyse sur plaque et élution pour obtenir les titres finaux avec \(\about 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { ml}}\) (unités de formation de plaque/millilitres). L'ARN a été isolé à partir de particules de phage purifiées à l'aide du kit universel de purification d'ARN total GenElute™ (Sigma-Aldrich) conformément aux instructions du fabricant. En bref, une suspension de phage Phi6 purifiée\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) a été lysé et le lysat a été chargé sur une colonne de centrifugation pour permettre à l'ARN de se lier à la colonne de résine. L'ARN est ensuite élué dans la solution d'élution \({ 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) fourni par le kit. Estimer la concentration d'ARN par absorbance à \(260\,\hbox {nm}\).L'ARN a été stocké en aliquotes dans \ ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) jusqu'à utilisation ultérieure.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) Le kit de synthèse d'ADNc iScript (Bio -Rad Laboratories) a été utilisé comme modèle pour la synthèse d'ADNc en suivant les instructions du fabricant. En bref, une réaction de synthèse d'ADNc se compose de 3 étapes : amorçage à \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min} }\) , transcription inverse de \({20}\,{\hbox {min}}\) à \({46}\,{^{\circ }\hbox {C}}\), et inverser L'enregistreur est dans \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) pour \({1}\,{\hbox {min }}\). Lorsqu'il est exécuté sur un gel d'agarose à 1 %, l'ADNc a montré trois bandes correspondant aux trois fragments d'ARN attendus (données non présentées). Les amorces suivantes ont été utilisées pour amplifier deux fragments d'ADN de 117 et 503 bp de longueur, en utilisant l'ADNc comme matrice pour la PCR dans un thermocycleur miniPCR® mini8 :
Les amorces pour \(117\,\hbox {bp}\) et \(503\,\hbox {bp}\) correspondent à 1476-1575 nucléotides du segment M et 458-943 nucléotides du segment L, respectivement acide Tous les produits de PCR amplifiés ont été soumis à une électrophorèse sur des gels d'agarose à 1 % et l'ADN cible amplifié a été purifié à l'aide du kit d'extraction de gel GeneJET (Thermo Fisher Scientific).
Un lac sur le campus de l'IIT Mumbai (lac Powai, Powai, Mumbai) a été utilisé pour ajouter des particules de phage. L'eau du lac a été filtrée à travers une membrane \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) pour éliminer particules en suspension, puis le phage Phi6 a été ajouté.Ajouter \({1}\,{\hbox {ml}}\) de \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} \) à \( {100}\ ,{\hbox {ml}}\) eau de lac filtrée, dans \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\). Une petite aliquote a été réservé à la mesure de la charge virale par test de plaque. (2) ) La méthode de concentration virale à base de polyéthylène glycol (PEG) a été adaptée de Flood et al.Étant donné que l'efficacité de récupération de la méthode à base de PEG s'est avérée meilleure que celle de la méthode à l'hydroxyde d'aluminium, la méthode à base de PEG a été utilisée pour concentrer les particules Phi6 des échantillons d'eau du lac.
La méthode PEG utilisée était la suivante : PEG 8000 et \(\hbox {NaCl}\) ont été ajoutés à des échantillons d'eau de lac enrichis en Phi6 pour obtenir 8 % de PEG 8000 et \(0,2\,\hbox {M} \) \( \ hbox {NaCl}\).Les échantillons ont été incubés sur un agitateur\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), puis centrifugé à \(4700 \,\hbox {g}\) est \({45}\,{\hbox {min}}\). Jeter le surnageant et remettre le culot en suspension dans \({1}\, {\hbox {ml}}\) dans le même surnageant. Toutes les expériences de dopage et de concentration de virus ont été réalisées en triple. Après concentration, une petite aliquote a été réservée pour la mesure de l'efficacité de récupération par dosage de plaque. L'ARN a été isolé comme décrit précédemment et élué dans le tampon d'élution fourni par le kit\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\). Étant donné que la concentration d'ARN varie d'un échantillon à l'autre en trois exemplaires, le \({2}\,{\upmu \ hbox {l}}\) d'ARN est utilisé pour les trois, quelle que soit sa concentration Synthèse d'ADNc d'échantillons. La synthèse d'ADNc a été effectuée comme décrit précédemment. a été utilisé comme modèle pour \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR pendant 35 cycles pour amplifier \(117\,\hbox {bp}\) et \(503\,\hbox { bp}\) fragments. Ces échantillons sont représentés en "1:1", c'est-à-dire sans dilution. comme modèle pour un contrôle positif (PC). Une PCR quantitative (qPCR) a été réalisée dans un instrument Stratagene Mx3000P RT-PCR en utilisant Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies). Les réactions ont été configurées en triple comme précédemment décrit. Le seuil de cycle (Ct) a été enregistré pour tous les échantillons. \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR pendant 35 cycles. Ces échantillons sont représentés par "1:100".
Les électrodes PCB sont fabriquées à l'aide d'un procédé ENIG (Electroless Nickel Immersion Gold) à faible coût disponible dans le commerce sans nécessiter de placage à l'or supplémentaire. Les spécifications des électrodes PCB ENIG sont détaillées dans nos travaux précédents11. la solution de piranha ou la voltampérométrie cyclique à l'acide sulfurique ne sont pas recommandées car elles peuvent provoquer un décollement de la fine couche d'or (épaisseur \(\approx\) \(100\,\hbox {nm }\)) et exposer les couches de cuivre sous-jacentes sujettes à la corrosion 21, 22, 23, 24, 25. Par conséquent, nettoyez les électrodes avec un chiffon non pelucheux imbibé d'IPA. L'échantillon à tester a été incubé avec \({50}\,{\upmu \hbox {M} }\) Mo dans \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) pour une insertion facile. Dans nos travaux précédents , nous avons observé que la sensibilité et la linéarité du capteur étaient améliorées en augmentant la concentration en MB concentrations pour intégrer l'ADN dans cette étude.La détection électrochimique de l'ADN double brin (ADNdb) peut être réalisée à l'aide d'intercalateurs anioniques ou cationiques.Bien que les intercalaires anioniques détectent l'ADN avec une meilleure sélectivité, ils nécessitent une incubation d'une nuit, d'autre part, les intercalateurs cationiques tels que MB nécessitent des temps d'incubation plus courts, environ \({1}\,{\hbox {h}}\) pour la détection électrochimique de l'ADNdb6.Chaque mesure consiste à distribuer l'échantillon à tester sur le électrode\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), puis nettoyer avec un chiffon imbibé d'IPA, avant de procéder à un autre échantillon.une mesure. Chaque échantillon a été testé sur 5 électrodes différentes, sauf indication contraire. Les mesures DPV et CV ont été effectuées à l'aide d'un potentiostat PalmSens Sensit Smart, et le logiciel PSTrace a été utilisé pour la configuration du potentiostat et l'acquisition de données, y compris les calculs de courant de crête. Les paramètres suivants sont utilisés pour les mesures DPV et CV :
DPV : temps d'équilibre = \(8\,\hbox {s}\), pas de tension = \(3\,\hbox {mV}\), tension d'impulsion = \(25\,\hbox {mV}\) , durée d'impulsion = \(50\,\hbox {ms}\), fréquence de balayage = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV : temps d'équilibre = \(8\,\hbox {s}\), pas de tension = \(3\,\hbox {mV}\), vitesse de balayage = \({300}\,\hbox {mV/ s }\)
Courants de crête obtenus à partir de voltammogrammes d'ADN complexé avec \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB : (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
Des voltammogrammes DPV et CV ont été obtenus sur des électrodes ENIG PCB \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB complexé avec de l'ADN (à des concentrations de 10–\({20}\,{\ hbox {ng }/{\upmu \hbox {l}}}\) soit 0,13–\({0,26}\,{\upmu \hbox {M}}\) pour \(117\,\hbox {bp}\ ) et 0,03 –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) pour \(503\,\hbox {bp}\)). Des voltammogrammes représentatifs sont présentés à la figure S1 dans les informations supplémentaires. La figure 2 montre les résultats des mesures DPV et CV (courant de crête) à l'aide de produits PCR purifiés sur gel. Par rapport aux mesures CV, les mesures DPV montrent une sensibilité plus élevée (courant en fonction de la concentration d'ADN) car les courants capacitifs de fond dans les mesures CV masquent les courants faradiques 26. Les données pour chaque boîte de la boîte à moustaches contient des mesures de 5 électrodes. Toutes les mesures utilisent le même ensemble d'électrodes pour éviter les erreurs de mesure dues à la variation d'électrode à électrode. Nous avons observé une tendance à la hausse des courants de crête mesurés DPV et CV pour des concentrations plus faibles d'ADN , plus long (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ comparé à \(117) ) fragment. Ceci est cohérent avec la tendance attendue d'adsorption d'électrode rapportée dans nos travaux précédents. l'adsorption du complexe MB-ADN facilite le transfert de charge sur l'électrode, ce qui contribue à l'augmentation du courant de crête. D'autres études ont montré l'effet de la taille et de la séquence des oligonucléotides sur l'intercalation MB-ADN27,28,29,30.La guanine -la teneur en cytosine (GC) des deux amplicons (\(117\,\hbox {bp}\) et \(503\,\hbox {bp}\)) était d'environ 50 %, indiquant que l'observation La différence est due à la longueur de l'amplicon. Cependant, pour des concentrations d'ADN plus élevées (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), pour \(503\,\hbox {bp} \) et \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) pour \(117\,\hbox {bp}\)), on observe deux amplifications les courants de crête des sous-marins sont réduits dans les mesures DPV et CV. C'est parce que MB sature et s'intercale entre les paires de bases d'ADN, entraînant une inhibition stérique de l'activité redox du groupe réductible dans MB31,32.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV。
Les sels présents dans les mélanges maîtres PCR interfèrent avec les interactions électrostatiques entre MB et l'ADN, donc en ajoutant \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) avec \({50} \,{\ upmu \hbox {M}}\) Produit purifié sur gel MB pour étudier l'effet du sel sur l'interaction MB-ADN. Comme le montre la figure 3, nous avons observé que pour des concentrations d'ADN plus élevées (\(>{2}\,{\ hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) et \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) pour \(117\,\hbox {bp} \)), dans DPV et CV L'ajout de sel n'a pas affecté de manière significative les mesures (voir la figure S2 dans les informations supplémentaires pour les voltammogrammes représentatifs). des concentrations d'ADN plus faibles, l'ajout de sel réduit considérablement la sensibilité, ce qui n'entraîne aucun changement significatif du courant avec la concentration d'ADN. Des effets négatifs similaires du sel sur les interactions MB-ADN et l'intercalation ont déjà été signalés par d'autres chercheurs33,34.\(\hbox { Les cations Mg}^{2+}\) se lient au squelette phosphate négatif de l'ADN, entravant ainsi l'interaction électrostatique entre le MB et l'ADN. À des concentrations d'ADN plus élevées, l'inhibition stérique des MB redox-actifs entraîne des courants de crête plus faibles, donc des interactions électrostatiques n'affectent pas de manière significative la réponse du capteur. Le point clé est que ce biocapteur est mieux adapté pour détecter des concentrations d'ADN plus élevées (rarement \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) ou plus), pour le traitement entièrement automatisé des échantillons d'eau environnementale, où la purification sur gel des produits PCR peut ne pas être possible.
Aire sous la courbe d'absorption pour la gamme de longueurs d'onde 600–700 \(\hbox {nm}\) pour différentes concentrations d'ADN complexé avec \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB : ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) avec et sans sel (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) avec et sans sel (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) Concentrations d'ADN correspondant à \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) échantillons MB Pas d'ADN.
Pour vérifier davantage les résultats ci-dessus, nous avons effectué des mesures optiques à l'aide d'un spectrophotomètre UV/Vis (Thermo Scientific Multiskan GO), les échantillons \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) ont été utilisés pour chaque Mesure. La signature d'absorption diminue avec l'augmentation de la concentration d'ADN, comme le montre la tendance de l'aire sous la courbe d'absorption pour la plage de longueurs d'onde \(600\,\hbox {nm}\) à \(700\,\hbox { nm}\) , comme illustré à la Fig. 4 (spectre d'absorption illustré à la Fig. S3 dans les informations supplémentaires). Pour les échantillons avec des concentrations d'ADN inférieures à \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), il n'y avait pas de différence significative d'absorption entre les échantillons contenant de l'ADN et ceux contenant uniquement du MB (pour \(503\,\hbox {bp}\) et \(117\,\hbox {bp}\ ) fragments de longueur), indiquant l'absence d'inhibition stérique du MB redox-actif. À des concentrations d'ADN plus élevées, nous avons observé une diminution progressive du signal d'absorbance et noté une diminution moindre de l'absorbance en présence de sel. Ces résultats ont été attribués à interactions et inhibition stérique avec empilement de bases dans les hybrides d'ADN.Nos résultats sont cohérents avec les rapports de la littérature sur les études spectroscopiques de l'intercalation MB-ADN qui associent l'hypochromaticité à des niveaux d'énergie réduits dans \(\pi\)–\(\pi ^*\ ) transitions électroniques dues à l'intercalation des couches 36, 37, 38.
Électrophorèse sur gel d'agarose du phage Phi6 : produits de PCR de longueur \(117\,\hbox {bp}\) et \(503\,\hbox {bp}\) provenant d'échantillons d'eau de lac.Marqueur M-DNA ;Contrôle NTC-no-template, amorces contenant les amplicons correspondants ;contrôle positif CP ;1, 2, 3 échantillons d'eau de lac enrichis non dilués (1:1) en triple exemplaire. Une bande est visible à \(\environ 50\,\hbox {bp}\) en raison d'oligonucléotides inutilisés dans le \(503\,\ hbox {bp}\) voie.
Nous avons évalué l'utilité du capteur à l'aide d'échantillons d'eau du lac Powai dopés avec le phage Phi6. ml}}\), tandis que ceux isolés à partir de suspensions de phages purifiés L'ARN a été estimé à \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) avec une efficacité de récupération d'environ 1 %. L'ARN a été transcrit en ADNc et utilisé comme modèle pour la PCR et la qPCR. La taille du produit a été confirmée par électrophorèse sur gel d'agarose (Figure 5) avant le test avec le capteur. Ces échantillons ne sont pas purifiés sur gel et contiennent donc tous les composants de la PCR comme ainsi que les amplicons d'intérêt. Les valeurs Ct enregistrées pendant la qPCR (tableau 1) se sont avérées corrélées avec la concentration d'ARN isolé des échantillons d'eau dopés correspondants. La valeur Ct révèle le nombre de cycles nécessaires pour que le signal fluorescent dépasser le seuil ou le signal de fond. Des valeurs Ct plus élevées indiquent des concentrations de matrice plus faibles et vice versa. Les valeurs Ct des échantillons NTC étaient aussi élevées que prévu. La différence de valeurs Ct \ (\ environ 3 \) entre le contrôle positif et l'échantillon de test indiquent en outre que chaque échantillon de test contient environ 1 % de matrice par rapport au contrôle positif. Nous avons précédemment discuté du fait que des amplicons plus longs conduisent à une meilleure sensibilité. de faible concentration virale et de dégradation de l'ARN. Cependant, avec notre protocole d'enrichissement de virus et d'amplification par PCR, nous avons pu amplifier avec succès le fragment \(503\,\hbox {bp}\) pour la détection électrochimique.
La figure 6 montre les résultats du capteur électrochimique de l'amplicon de fragment \(503\,\hbox {bp}\), à la fois en utilisant de l'ADNc non dilué comme matrice (1:1) et de l'ADNc dilué 100 fois comme matrice (1:100) réalisé par PCR , par rapport à NTC et PC (voir la figure S4 dans les informations supplémentaires pour les voltammogrammes représentatifs). Chaque boîte de la boîte à moustaches de la figure 6 contient des mesures de trois échantillons à 5 électrodes. Les mêmes électrodes ont été utilisées pour mesurer tous les échantillons afin d'éviter les erreurs dues à l'électrode. - à l'électrode. Par rapport aux mesures CV, les mesures DPV montrent une meilleure résolution pour distinguer les échantillons de test et de PC des NTC car, comme mentionné précédemment, les courants faradiques sont cachés en raison des courants capacitifs de fond dans ces derniers. Pour les amplicons plus longs, nous avons observé que le contrôle négatif (NTC) a entraîné des courants de crête CV et DPV plus élevés par rapport au contrôle positif, tandis que les échantillons de test positifs et non dilués ont montré des hauteurs de pic similaires de courants de crête DPV. Les valeurs moyennes et médianes mesurées pour chaque non dilué (1: 1 ) l'échantillon de test et le PC peuvent être clairement résolus à partir de la sortie du capteur pour l'échantillon NTC, tandis que la résolution de l'échantillon dilué au 1:100 est moins prononcée. Pour une dilution de 100 fois de l'ADNc, nous n'avons observé aucune bande pendant l'électrophorèse sur gel (voies non représentées sur la figure 5), et les courants de crête DPV et CV correspondants étaient similaires à ceux attendus pour NTC. Les résultats pour le fragment \ (117 \, \ hbox {bp} \) sont présentés dans les informations supplémentaires. Le négatif le contrôle induit une réponse électrochimique du capteur PCB en raison de l'adsorption de MB libre sur l'électrode et de l'interaction du MB avec l'oligonucléotide d'amorce simple brin. Par conséquent, chaque fois qu'un échantillon est testé, un contrôle négatif doit être exécuté et le courant de crête de l'échantillon de test par rapport au courant de crête obtenu par le contrôle négatif pour obtenir une mesure différentielle (relative)39,40 pour classer l'échantillon de test comme positif ou négatif.
( a ) DPV et ( b ) courant de crête CV pour la détection électrochimique de fragments \ (503 \, \ hbox {bp} \) dans des échantillons d'eau de lac. Les échantillons de test ont été mesurés en triple et comparés à aucun contrôle de modèle (NTC) et contrôles positifs (PC).
Nos résultats illustrent différents mécanismes affectant les performances des capteurs électrochimiques pour des amplicons de différentes longueurs pour différents ADN, avec des concentrations vérifiées par des mesures optiques à l'aide d'un spectrophotomètre UV/Vis. Nos observations soulignent l'idée que des fragments d'ADN plus longs jusqu'à \(\approx\) \(500\,\hbox {bp}\) peut être détecté avec une sensibilité plus élevée et que la présence de sel dans l'échantillon ne le fait pas Sensibilité Concentration d'ADN qui affecte une sensibilité plus élevée (rarement \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) et ci-dessus). En outre, nous avons étudié l'effet de différents types d'échantillons, y compris les amplicons purifiés sur gel avec et sans sel ajouté, et l'ajout d'échantillons d'eau de lac dans les mesures DPV et CV.Nous avons observé que DPV offrait une meilleure résolution, car le courant capacitif de fond affecte également la mesure CV, la rendant moins sensible.
L'amplification de fragments plus longs dépend de l'intégrité de l'ARN génomique viral. Plusieurs études ont montré que l'amplification de fragments plus longs n'est pas toujours efficace en raison de la dégradation de l'ARN dans l'environnement et du potentiel d'épissage lors de l'isolement11,41,42,43,44 .Nous avons observé que la méthode de concentration virale à base de PEG était plus efficace pour concentrer le phage Phi-6 dopé dans des échantillons d'eau de lac que la méthode de concentration virale à base d'hydroxyde d'aluminium. pour amplifier plusieurs modèles de longueur plus courte et réduire la possibilité de spécificité croisée.
Les échantillons biologiques sont rares, il est donc nécessaire de concevoir un biocapteur qui nécessite un minimum d'échantillons pour les tests. Les électrodes PCB ENIG utilisées dans cette étude ne nécessitaient que \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ ) échantillons à tester pour couvrir la surface effective des électrodes. De plus, la même électrode peut être réutilisée après le nettoyage avant de distribuer l'échantillon suivant. Les échantillons amplifiés ne nécessitent pas l'ajout de produits chimiques autres que le bleu de méthylène, qui est un produit peu coûteux. et chimique couramment utilisé. Puisque chaque électrode coûte environ 0,55 $ (ou 40 INR) à fabriquer, ce biocapteur peut être une alternative rentable aux technologies de détection existantes. Le tableau 2 montre une comparaison de ce travail avec d'autres capteurs rapportés dans la littérature depuis longtemps Fragments d'ADN dans des échantillons hétérogènes.
Étant donné que les protocoles de détection électrochimique basés sur MB reposent sur la spécificité de la PCR, une limitation majeure de cette méthode est le potentiel d'amplification non spécifique dans des échantillons hétérogènes tels que les eaux usées et l'eau de lac ou l'utilisation d'amorces de faible pureté. Pour améliorer la sensibilité de méthodes de détection électrochimiques pour la détection d'ADN de produits de PCR non purifiés à l'aide d'électrodes PCB ENIG non modifiées, il est nécessaire de mieux comprendre les erreurs introduites par les dNTP et les amorces inutilisés, et d'optimiser les conditions de réaction et les protocoles d'analyse.Paramètres physicochimiques supplémentaires tels que le pH, la température et les paramètres biologiques la demande en oxygène (DBO) de l'échantillon d'eau peut également devoir être mesurée afin d'améliorer la précision de la mesure.
En conclusion, nous proposons un capteur électrochimique ENIG PCB à faible coût pour la détection de virus dans des échantillons environnementaux (eau de lac). des électrodes avec une durée de conservation plus longue et aucune exigence de stockage spécifique et donc adaptées au développement de solutions de mesure avec traitement automatisé des échantillons déployés dans les LMIC. commun dans les échantillons environnementaux réduit la spécificité de cette méthode de détection en raison de la liaison non spécifique des MB aux oligonucléotides simple et double brin. Par conséquent, la spécificité de ce test dépend de l'optimisation des amorces et des conditions de réaction PCR. De plus, le CV et les courants de crête DPV obtenus à partir des échantillons testés doivent être interprétés par rapport aux réponses obtenues à partir du contrôle négatif (NTC) pour chaque test. Les conceptions et méthodes de capteurs électrochimiques présentées dans ce travail peuvent être intégrées à des échantillonneurs automatiques pour développer solution peu coûteuse qui peut collecter et analyser des échantillons et transmettre sans fil les résultats au laboratoire .
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Heure de publication : 27 mai 2022