آمپلیکون‌های طولانی‌تر حساسیت بهتری را برای سنجش الکتروشیمیایی اسیدهای نوکلئیک ویروسی در نمونه‌های آب با استفاده از الکترودهای PCB فراهم می‌کنند.

از اینکه از Nature.com بازدید کردید متشکریم. نسخه مرورگری که استفاده می کنید پشتیبانی محدودی از CSS دارد. برای بهترین تجربه، توصیه می کنیم از یک مرورگر به روز شده استفاده کنید (یا حالت سازگاری را در اینترنت اکسپلورر خاموش کنید). در این بین، برای اطمینان از در ادامه پشتیبانی، سایت را بدون استایل و جاوا اسکریپت نمایش خواهیم داد.
اهمیت نظارت بر نمونه‌های محیطی از ابتدای همه‌گیری COVID-19 بسیار مورد توجه قرار گرفته است، و برخی از تلاش‌های نظارتی با استفاده از استاندارد طلایی در حال انجام است، اگرچه تکنیک‌های مبتنی بر qPCR گران هستند. حسگرهای زیستی DNA الکتروشیمیایی می‌توانند بالقوه مقرون به صرفه باشند. راه حلی برای نظارت بر نمونه‌های آب محیطی در کشورهای با درآمد کم و متوسط. در این کار، ما تشخیص الکتروشیمیایی آمپلیکون‌های به‌دست‌آمده از فاژ Phi6 جدا شده از نمونه‌های آب دریاچه (یک جایگزین محبوب برای SARS-CoV-2) را با استفاده از ENIG نشان می‌دهیم. برای تکمیل الکترودهای PCB بدون تغییر سطح.جنسیت. پاسخ حسگر الکتروشیمیایی به طور کامل برای دو قطعه DNA با طول های مختلف (\({117}\,\hbox {bp}\) و \({503}\,\hbox {bp}\)) مشخص شد و اثر نمک ها در مخلوط های اصلی PCR بر برهمکنش متیلن بلو (MB)-DNA. نتایج ما نشان می دهد که طول قطعات DNA به طور قابل توجهی حساسیت الکتروشیمیایی را تعیین می کند و در این کار نشان می دهد که توانایی تشخیص آمپلیکون های طولانی بدون خالص سازی ژل محصولات PCR است. برای اندازه گیری درجا نمونه های آب مهم است.یک راه حل کاملاً خودکار برای بار ویروسی به خوبی خبر می دهد.
انتقال ویروس از طریق آب از دهه 1940 به عنوان یک خطر برای سلامت عمومی شناخته شده است، با اولین شواهد از انتقال فلج اطفال و هپاتیت E1 از طریق آب. روش‌های تشخیص مبتنی بر تکنیک‌های مبتنی بر qPCR با استاندارد طلا هستند، که بسیار حساس و خاص هستند، اما برای آزمایش در آزمایشگاه با استفاده از ابزارهای گران‌قیمت نیاز به پرسنل ماهر دارند. احتمالاً آزمایش نمونه بر پایش نمونه آب محیطی اولویت دارد. بنابراین، روش‌های کم‌هزینه جایگزین برای پایش پایدار و در زمان واقعی نمونه‌های آب و فاضلاب در کشورهای با درآمد کم و متوسط ​​به عنوان هشدارهای اولیه در مورد شیوع بیماری‌های نوظهور مورد نیاز است. در نتیجه آنها را در برابر اثرات شدید اجتماعی و اقتصادی ویروس همه گیر محافظت می کند. بیوسنسورهای الکتروشیمیایی کم هزینه برای اسیدهای نوکلئیک می توانند راه حل بالقوه امیدوار کننده ای برای این نیاز برآورده نشده ارائه دهند. بسیاری از این حسگرهای زیستی DNA با این واقعیت کار می کنند که رشته های DNA مکمل روی الکترود بی حرکت می شوند هنگامی که یک توالی منطبق در نمونه وجود دارد، سطح و هیبرید می شود. سپس این می تواند با تکنیک های الکتروشیمیایی مختلف با استفاده از واسطه های ردوکس مانند آهن پتاسیم/ فروسیانید به سیگنال تبدیل شود. متیلن بلو (MB) یکی از این مولکول های فعال ردوکس است که دارای گزارش شده است که به DNA دو رشته ای (dsDNA) علاوه بر اتصال غیر اختصاصی تر آن به DNA تک رشته ای 5،6 وارد می شود. ماهیت درهم آمیزی MB ها برای تشکیل کمپلکس های MB-DNA آنها را به عنوان میانجی های ردوکس در چندین DNA الکتروشیمیایی تبدیل می کند. پیکربندی سنسور 5،6،7،8،9.اگرچه ربط MB به DNA غیر اختصاصی است و ویژگی این حسگر الکتروشیمیایی تا حد زیادی به خلوص پرایمرهای مورد استفاده برای PCR یا تقویت همدما بستگی دارد، اما برای اجرای واقعی مناسب است. qPCR مبتنی بر الکتروشیمیایی زمان یا تقویت همدما فلورسانس به عنوان جایگزینی برای اندازه گیری غلظت DNA 9. در یکی از این پیاده سازی ها، Won و همکاران. سطح الکترودهای طلا با 6-mercapto-1-hexanol (MCH) برای زمان واقعی اصلاح شد. اندازه گیری آمپلیکون های PCR با MB با استفاده از ولتامتری پالس افتراقی (DPV)9. در موارد دیگر، رامیرز و همکاران. تشخیص SARS-CoV-2 در فاضلاب با واکنش RT-LAMP با استفاده از MB با الکترودهای چاپ شده با صفحه نمایش. الکترودهای پلاتین نیز انجام شده است. به عنوان الکترودهای درجا در یک پلت فرم PCR میکروسیالی که برای تشخیص الکتروشیمیایی آمپلیکن ها در طول واکنش ها طراحی شده است استفاده می شود. همه این مطالعات نیاز به اصلاح سطح الکترودها دارند که به دلیل نیازهای ذخیره سازی ویژه برای پایداری این الکترودهای عامل دار، افزایش هزینه های تولید و عملیات را نشان می دهد.
شماتیک جریان کار برای تشخیص الکتروشیمیایی آمپلیکون های به دست آمده از ذرات متمرکز ویروسی در نمونه های آب دریاچه.
ما اخیراً سنجش الکتروشیمیایی آمپلیکون‌های SARS-CoV-2 را با الکترودهای برد مدار چاپی ارزان‌قیمت (PCB) مبتنی بر DPV و ولتامتری چرخه‌ای (CV) نشان داده‌ایم که توسط جذب کمپلکس‌های MB-DNA روی سطح الکترودهای اصلاح‌نشده) در اوج تغییرات ایجاد شده‌اند. جاری 11.ما گزارش می‌کنیم که قطعات DNA طولانی‌تر (N1-N2، \({943}\، \hbox) که با استفاده از آغازگرهای N1 رو به جلو و N2 توصیه شده توسط CDC در مقایسه با قطعات کوتاه‌تر {bp}\) تشکیل شده‌اند) خطی بودن بهتری را در پاسخ سنسور نشان دادند. (N1, \(72\,\hbox {bp}\)) با استفاده از مجموعه پرایمرهای N1 رو به جلو و N1 تشکیل شده است. این مطالعات با استفاده از رقت های DNA تهیه شده در آب بدون هسته گزارش شده است. این پلت فرم همچنین برای شناسایی SARS-CoV استفاده شد. -2 آمپلیکون در نمونه‌های فاضلاب شبیه‌سازی‌شده (به‌دست‌آمده با اسپک کردن نمونه‌های RNA کل با RNA SARS-CoV-2). از آنجایی که RNA در طول جداسازی و پردازش پایین دست به برش حساس است، 12،13 تکثیر قطعات طولانی‌تر با این نمونه ناهمگن دشوار است. بنابراین، نشان دادن سنجش الکتروشیمیایی آمپلیکون SARS-CoV-2 در فاضلاب به قطعه N1 کوتاهتر \(72\,\hbox {bp}\) محدود می شود.
در این کار، امکان سنجش الکتروشیمیایی مبتنی بر PCB ENIG فاژ Phi6 متمرکز و جدا شده از نمونه‌های آب دریاچه (شکل 1) را بررسی کردیم. همچنین دارای یک غشای لیپیدی و یک پروتئین سنبله است. به این دلایل، باکتریوفاژ Phi6 یک جانشین محبوب برای SARS-CoV-2 و سایر ویروس‌های RNA بیماری زا است. RNA جدا شده از ذرات فاژ به عنوان الگویی برای سنتز cDNA مورد استفاده قرار گرفت. PCR برای به دست آوردن دو قطعه DNA با طول 117 و 503 جفت باز. با توجه به چالش تقویت قطعات \(943\,\hbox {bp}\) در کار قبلی خود، قطعات با طول متوسط ​​را هدف قرار می دهیم (\(117 \,\hbox {bp}\) و \(503 \,\hbox {bp}\))، بر اساس آغازگرهای موجود. \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) به \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) برای هر دو قطعه در وجود MB، اثر نمک بر پاسخ سنسور مشخص شده و توسط اندازه‌گیری‌های اسپکتروفتومتری تایید شده است. مشارکت‌های اصلی این کار به شرح زیر است:
طول قطعه DNA و وجود نمک در نمونه به شدت بر حساسیت تاثیر می گذارد.نتایج ما نشان می‌دهد که فعالیت الکتروشیمیایی به مکانیسم‌های مختلف برهمکنش MB، DNA و حسگر در پاسخ ولتامتری بستگی دارد، بسته به غلظت و طول DNA، با قطعات طولانی‌تر حساسیت بالاتری نشان می‌دهند، اگرچه نمک اثر منفی بر برهمکنش‌های الکترواستاتیکی بین MB و DNA.
غلظت DNA مکانیسم برهمکنش MB-DNA را در الکترودهای اصلاح نشده تعیین می کند ما نشان می دهیم که مکانیسم های مختلف برهمکنش MB-DNA به غلظت DNA بستگی دارد. در غلظت های DNA کمتر از مقدار کمی \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)، ما مشاهده کردیم که پاسخ جریان الکتروشیمیایی عمدتاً با جذب MB-DNA روی الکترود تعیین می‌شود، در حالی که در غلظت‌های پایین‌تر در غلظت‌های DNA بالا، پاسخ جریان الکتروشیمیایی با مهار فضایی ردوکس تعیین می‌شود. فعالیت ناشی از درج MB بین جفت های باز DNA.
سنجش الکتروشیمیایی اسیدهای نوکلئیک ویروسی مبتنی بر PCB ENIG در نمونه های آب دریاچه مشاهدات با تشخیص الکتروشیمیایی قطعات DNA \(503\,\hbox {bp}\) با Phi6 اضافه شده به دست آمده از نمونه های آب از دریاچه Powai، پردیس IIT Mumbai تأیید شد. فاژ نتیجه
هزینه پایین اجرا و پتانسیل ادغام در سیستم های نظارت کاملاً خودکار، الیگونوکلئوتیدها یا آپتامرهای روی الکترودهایی با ماندگاری طولانی تر.
Phage Phi6 یک ویروس dsRNA پوشیده از خانواده Cytoviridae است که سودوموناس syringae را آلوده می کند. ژنوم فاژ Phi6 به شکل 3 قطعه وجود دارد: S (\(2.95\,\hbox {Kb}\))، M (\(4.07). \,\hbox {Kb}\)) و L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\))16،17. از آنجایی که فاژ Phi6 یک سویه غیر بیماری زا BSL-1 سودوموناس را آلوده می کند، استفاده از آن بی خطر است. و به راحتی در آزمایشگاه رشد می کند. Phage Phi6 و میزبان آن Pseudomonas syringae از مرکز مرجع ویروس های باکتریایی Felix d'Herelle، دانشگاه لاوال، کانادا خریداری شد (شماره کاتالوگ مرکز مرجع به ترتیب HER-102 و HER-1102 است) فاژ Phi6 و میزبان آن طبق دستور مرکز مرجع احیا شدند. Phi6 با لیز پلیت و شستشو برای بدست آوردن تیتر نهایی با \(\حدود 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { خالص شد. ml}}\) (واحد تشکیل پلاک/ میلی لیتر). RNA از ذرات فاژ خالص شده با استفاده از کیت خالص سازی RNA یونیورسال GenElute™ (Sigma-Aldrich) طبق دستورالعمل سازنده جدا شد. به طور خلاصه، یک سوسپانسیون Phi6 فاژ خالص شده\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) لیز شد و لیزات روی یک ستون اسپین بارگذاری شد تا اجازه دهد RNA به ستون رزین متصل شود. سپس RNA در محلول شستشو شسته می‌شود \({ 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) ارائه شده توسط کیت. غلظت RNA را با جذب در \(260\,\hbox {nm}\) تخمین بزنید. RNA به مقدار کمی در \ ذخیره شد ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) تا استفاده بعدی.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) کیت سنتز cDNA iScript (بیو -Rad Laboratories) به عنوان یک الگو برای سنتز cDNA به دنبال دستورالعمل های سازنده استفاده شد. به طور خلاصه، یک واکنش سنتز cDNA شامل 3 مرحله است: پرایمینگ در \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min} }\) , رونویسی معکوس \({20}\,{\hbox {min}}\) در \({46}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)، و معکوس ضبط کننده در \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) برای \({1}\,{\hbox {دقیقه است }}\). وقتی روی ژل آگارز 1% اجرا شد، cDNA سه باند مربوط به سه قطعه RNA مورد انتظار را نشان داد (داده‌ها نشان داده نشده است). آغازگرهای زیر برای تکثیر دو قطعه DNA به طول 117 و 503 جفت باز استفاده شدند. استفاده از cDNA به عنوان الگوی PCR در یک سیکلر حرارتی miniPCR® mini8:
آغازگرهای \(117\,\hbox {bp}\) و \(503\,\hbox {bp}\) به ترتیب مربوط به 1476-1575 نوکلئوتید از بخش M و 458-943 نوکلئوتید از بخش L هستند. تمام محصولات PCR تکثیر شده بر روی ژل آگارز 1% الکتروفورز شدند و DNA هدف تکثیر شده با استفاده از کیت استخراج ژل GeneJET (Thermo Fisher Scientific) خالص شد.
از یک دریاچه در پردیس IIT بمبئی (Powai Lake، Powai، Mumbai) برای افزودن ذرات فاژ استفاده شد. آب دریاچه از طریق غشای \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) برای حذف فیلتر شد ذرات معلق، و سپس فاژ Phi6 اضافه شد. \({1}\,{\hbox {ml}}\) از \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} را اضافه کنید \) به \( {100}\ ,{\hbox {ml}}\) آب دریاچه فیلتر شده، در \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\). مقدار کمی بود برای اندازه‌گیری بار ویروسی با روش پلاک محفوظ است. ما دو روش مختلف را برای متمرکز کردن ذرات مشخصه‌ای ویروس Phi6 آزمایش کردیم: (1) روش جذب - رسوب هیدروکسید آلومینیوم، 19 که برای غلظت چندین ویروس RNA پوشش‌دار از نمونه‌های محیطی تایید شده است، و (2) روش غلظت ویروس مبتنی بر پلی اتیلن گلیکول (PEG) از Flood و همکاران اقتباس شده است.20. از آنجایی که بازده بازیابی روش مبتنی بر PEG بهتر از روش هیدروکسید آلومینیوم بود، از روش مبتنی بر PEG برای تغلیظ ذرات Phi6 از نمونه‌های آب دریاچه استفاده شد.
روش PEG مورد استفاده به شرح زیر بود: PEG 8000 و \(\hbox {NaCl}\) به نمونه‌های آب دریاچه با سنبله Phi6 اضافه شدند تا 8٪ PEG 8000 و \(0.2\,\hbox {M} \) \( \ hbox {NaCl}\).نمونه‌ها روی یک شیکر انکوبه شدند\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ، سپس در \(4700 \,\hbox {g}\) سانتریفیوژ می شود \({45}\,{\hbox {min}}\). مایع رویی را دور بیندازید و گلوله را مجدداً در \({1}\, {\hbox {ml}}\) در همان مایع رویی. تمام آزمایش‌های اسپایکینگ و غلظت ویروس در سه تکرار انجام شد. در بافر شستشوی ارائه شده توسط کیت\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\). از آنجایی که غلظت RNA از نمونه ای به نمونه دیگر در سه تکرار متفاوت است، \({2}\,{\upmu \ hbox {l}}\) RNA برای هر سه بدون توجه به غلظت آن استفاده می شود. سنتز cDNA نمونه ها. سنتز cDNA همانطور که قبلاً توضیح داده شد انجام شد.\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNA به عنوان الگو برای \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR برای 35 چرخه برای تقویت \ (117\,\hbox {bp}\) و \(503\,\hbox {) استفاده شد. bp}\) قطعات. این نمونه ها به صورت "1:1"، یعنی بدون رقت نمایش داده می شوند. یک کنترل بدون الگو (NTC) به عنوان یک کنترل منفی راه اندازی شد، در حالی که یک cDNA سنتز شده با استفاده از RNA جدا شده از فاژ خالص ساخته شد. به عنوان یک الگو برای کنترل مثبت (PC). PCR کمی (qPCR) در دستگاه Stratagene Mx3000P RT-PCR با استفاده از Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (تکنولوژی های چابک) انجام شد. واکنش ها مانند گذشته در سه تکرار تنظیم شدند. شرح داده شد. آستانه چرخه (Ct) برای همه نمونه ها ثبت شد. علاوه بر این، نمونه های رقیق شده با استفاده از cDNA رقیق شده 1:100 در آب دریاچه فیلتر شده، \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) بودند. \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR برای 35 سیکل. این نمونه ها به صورت "1:100" نمایش داده می شوند.
الکترودهای PCB با استفاده از یک فرآیند ارزان قیمت در دسترس تجاری و بدون نیاز به آبکاری طلای اضافی ساخته می شوند. مشخصات الکترود PCB ENIG در کار قبلی ما شرح داده شده است. محلول پیرانا یا ولتامتری حلقوی اسید سولفوریک توصیه نمی شود زیرا ممکن است باعث کنده شدن لایه نازک طلا (ضخامت \(\تقریبا\) \(100\,\hbox {nm }\)) شده و لایه های مسی زیرین مستعد را در معرض دید قرار دهند. به خوردگی 21، 22، 23، 24، 25. بنابراین، الکترودها را با یک پارچه بدون پرز مرطوب شده با IPA تمیز کنید. نمونه مورد آزمایش با \({50}\,{\upmu \hbox {M} انکوبه شد. }\) مگابایت در \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) برای درج آسان. در کار قبلی ما مشاهده کردیم که حساسیت و خطی بودن حسگر با افزایش غلظت مگابایت بهبود یافته است. تشخیص الکتروشیمیایی DNA دو رشته ای (ds-DNA) را می توان با استفاده از اینترکالاتورهای آنیونی یا کاتیونی به دست آورد. گرچه اینترکالاتورهای آنیونی DNA را با گزینش پذیری بهتر تشخیص می دهند، اما نیاز به انکوباسیون یک شبه دارند و در نتیجه زمان تشخیص طولانی تری دارند. از سوی دیگر، اینترکالاتورهای کاتیونی مانند MB به زمان‌های انکوباسیون کوتاه‌تر، تقریباً \({1}\,{\hbox {h}}\) برای تشخیص الکتروشیمیایی ds-DNA6 نیاز دارند. هر اندازه‌گیری شامل توزیع نمونه برای آزمایش روی الکترود\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\)، سپس با یک پارچه مرطوب شده با IPA تمیز کنید، قبل از اینکه نمونه دیگری را ادامه دهید.یک اندازه گیری. هر نمونه بر روی 5 الکترود مختلف آزمایش شد، مگر اینکه خلاف آن ذکر شده باشد. اندازه گیری DPV و CV با استفاده از پتانسیوستات هوشمند PalmSens Sensit انجام شد و نرم افزار PSTrace برای پیکربندی پتانسیواستات و جمع آوری داده ها، از جمله محاسبات پیک جریان استفاده شد. تنظیمات زیر استفاده می شود. برای اندازه گیری DPV و CV:
DPV: زمان تعادل = \(8\،\hbox {s}\)، مرحله ولتاژ = \(3\,\hbox {mV}\)، ولتاژ پالس = \(25\,\hbox {mV}\) , مدت زمان پالس = \(50\،\hbox {ms}\)، سرعت اسکن = \({20}\،\hbox {mV/s}\)
CV: زمان تعادل = \(8\,\hbox {s}\), مرحله ولتاژ = \(3\,\hbox {mV}\), نرخ جابجایی = \({300}\,\hbox {mV/s }\)
حداکثر جریان به دست آمده از ولتاموگرام های DNA کمپلکس شده با \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) مگابایت: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
ولتاموگرام های DPV و CV روی الکترودهای PCB ENIG \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB کمپلکس شده با DNA (در غلظت های 10–\({20}\,{\ hbox {ng) به دست آمد. }/{\upmu \hbox {l}}}\) یعنی 0.13–\({0.26}\,{\upmu \hbox {M}}\) برای \(117\,\hbox {bp}\ ) و 0.03 –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) برای \(503\,\hbox {bp}\)). ولتاموگرام های نماینده در شکل S1 در اطلاعات تکمیلی نشان داده شده است. شکل 2 نتایج را نشان می دهد. اندازه‌گیری‌های DPV و CV (پیک جریان) با استفاده از محصولات PCR خالص‌شده با ژل. در مقایسه با اندازه‌گیری‌های CV، اندازه‌گیری‌های DPV حساسیت بالاتری را نشان می‌دهند (جریان به عنوان تابعی از غلظت DNA) زیرا جریان‌های خازنی پس‌زمینه در اندازه‌گیری‌های CV جریان‌های فارادی را پنهان می‌کنند. برای هر جعبه در باکس پلات حاوی اندازه‌گیری‌هایی از 5 الکترود است. همه اندازه‌گیری‌ها از مجموعه الکترودهای یکسانی استفاده می‌کنند تا از خطاهای اندازه‌گیری به دلیل تغییرات الکترود به الکترود جلوگیری شود. ما یک روند افزایشی در جریان‌های پیک اندازه‌گیری شده DPV و CV برای غلظت‌های کمتر DNA مشاهده کردیم. , طولانی تر (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ در مقایسه با \(117)) قطعه. این با روند مورد انتظار جذب الکترود گزارش شده در کار قبلی ما مطابقت دارد. جذب کمپلکس MB-DNA انتقال بار روی الکترود را تسهیل می کند، که به افزایش پیک جریان کمک می کند. مطالعات دیگر اثر اندازه و توالی الیگونوکلئوتیدها را بر روی همبستگی MB-DNA نشان داده اند. 27،28،29،30. گوانین محتوای سیتوزین (GC) دو آمپلیکون (\(117\,\hbox {bp}\) و \(503\,\hbox {bp}\)) تقریباً 50% بود که نشان می‌دهد مشاهده تفاوت به دلیل به طول آمپلیکون. با این حال، برای غلظت‌های DNA بالاتر (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)، برای \(503\,\hbox {bp} \) و \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) برای \(117\,\hbox {bp}\))، دو تقویت را مشاهده می‌کنیم جریان اوج زیربناها در هر دو اندازه‌گیری DPV و CV کاهش می‌یابد. این به این دلیل است که MB بین جفت‌های باز DNA اشباع می‌شود و بین جفت‌های باز DNA قرار می‌گیرد و در نتیجه فعالیت ردوکس گروه کاهش‌پذیر در MB31،32 را مهار می‌کند.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
نمک های موجود در مخلوط های اصلی PCR با برهمکنش های الکترواستاتیکی بین MB و DNA تداخل دارند، بنابراین با افزودن \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) با \({50} \,{\) upmu \hbox {M}}\) مگابایت محصول خالص شده با ژل برای مطالعه اثر نمک بر تعامل MB-DNA. همانطور که در شکل 3 نشان داده شده است، مشاهده کردیم که برای غلظت های بالاتر DNA (\(>{2}\,{\ hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) و \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) برای \(117\,\hbox {bp} \))، در DPV و CV افزودن نمک تأثیر قابل‌توجهی بر اندازه‌گیری‌ها نداشت (شکل S2 را در اطلاعات تکمیلی برای ولتاموگرام‌های نماینده ببینید). با این حال، در غلظت‌های کمتر DNA، افزودن نمک حساسیت را تا حد زیادی کاهش می‌دهد و در نتیجه تغییر قابل‌توجهی در جریان با غلظت DNA ایجاد نمی‌شود. اثرات منفی مشابهی از نمک بر روی برهمکنش‌های MB-DNA و تداخل آن قبلاً توسط محققان دیگر گزارش شده بود.\(\hbox { کاتیون‌های Mg}^{2+}\) به ستون فقرات فسفات منفی DNA متصل می‌شوند، در نتیجه برهمکنش الکترواستاتیکی بین MB و DNA را متوقف می‌کنند. در غلظت‌های بالاتر DNA، مهار فضایی MBs فعال ردوکس منجر به جریان‌های اوج کمتری می‌شود، بنابراین برهمکنش‌های الکترواستاتیکی به طور قابل توجهی بر پاسخ سنسور تأثیر نمی گذارد. نکته کلیدی این است که این حسگر زیستی برای تشخیص غلظت DNA بالاتر مناسب تر است (به ندرت \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) یا بالاتر)، برای پردازش کاملاً خودکار نمونه‌های آب محیطی، جایی که تصفیه ژل محصولات PCR ممکن است امکان‌پذیر نباشد.
ناحیه زیر منحنی جذب برای محدوده طول موج 600-700 \(\hbox {nm}\) برای غلظت‌های مختلف DNA کمپلکس شده با \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) مگابایت: (a ) \(503\،\hbox {bp}\) با و بدون نمک (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\))، (b) \( 117\, \hbox {bp}\) با و بدون نمک (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) غلظت DNA مربوط به \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) نمونه مگابایت بدون DNA.
برای تأیید بیشتر نتایج فوق، ما اندازه‌گیری‌های نوری را با استفاده از طیف‌سنج UV/Vis (Thermo Scientific Multiskan GO) انجام دادیم، از نمونه‌های \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) برای هر کدام استفاده شد. اندازه‌گیری. امضای جذب با افزایش غلظت DNA کاهش می‌یابد، همانطور که از روند ناحیه زیر منحنی جذب برای محدوده طول موج \(600\,\hbox {nm}\) تا \(700\,\hbox { مشاهده می‌شود. nm}\)، همانطور که در شکل 4 نشان داده شده است (طیف جذب نشان داده شده در شکل S3 در اطلاعات تکمیلی). برای نمونه هایی با غلظت DNA کمتر از \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)، تفاوت معنی‌داری در جذب بین نمونه‌های حاوی DNA و نمونه‌های فقط MB (برای \(503\,\hbox {bp}\) و \(117\,\hbox {bp}\) وجود نداشت. ) قطعات طولی)، که نشان دهنده عدم مهار فضایی MB فعال ردوکس است. در غلظت های بالاتر DNA، کاهش تدریجی سیگنال جذب و کاهش کمتری در جذب در حضور نمک مشاهده شد. این نتایج به مولکولی نسبت داده شد. برهمکنش‌ها و مهار فضایی با انباشته شدن پایه در هیبریدهای DNA. نتایج ما با گزارش‌های موجود در مقالات مربوط به مطالعات طیف‌سنجی MB-DNA که هیپوکروماتیک بودن را با سطوح انرژی کاهش یافته در \(\pi\)-\(\pi ^*\ مرتبط می‌سازد مطابقت دارد. ) انتقال های الکترونیکی به دلیل لایه های درونی 36، 37، 38.
الکتروفورز ژل آگارز فاژ Phi6: محصولات PCR با طول \(117\,\hbox {bp}\) و \(503\,\hbox {bp}\) از نمونه‌های آب دریاچه. نشانگر M-DNA.کنترل NTC-بدون الگو، پرایمرهای حاوی آمپلیکون های مربوطه.کنترل مثبت کامپیوتر؛نمونه های آب دریاچه 1، 2، 3 رقیق نشده (1:1) در سه تکرار. به دلیل الیگونوکلئوتیدهای استفاده نشده در \(503\,\) یک نوار در \(\حدود 50\,\hbox {bp}\) قابل مشاهده است. خط hbox {bp}\).
ما کاربرد حسگر را با استفاده از نمونه‌های آب دریاچه Powai با فاژ Phi6 ارزیابی کردیم. غلظت‌های RNA جدا شده از نمونه‌های آب با میخه فاژ در محدوده 15.8-\({19.4}\،{\upmu \hbox {g}/\hbox { بود. ml}}\)، در حالی که آنهایی که از سوسپانسیون‌های فاژ خالص جدا شده بودند، RNA \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) با بازده بازیابی تقریباً 1 برآورد شد. %RNA به طور معکوس به cDNA رونویسی شد و به عنوان الگوی PCR و qPCR مورد استفاده قرار گرفت. اندازه محصول قبل از آزمایش با سنسور توسط الکتروفورز ژل آگارز (شکل 5) تأیید شد. مقادیر Ct ثبت شده در طول qPCR (جدول 1) نشان داده شده است که با غلظت RNA جدا شده از نمونه های آب مشخص شده مربوطه مرتبط است. مقدار Ct تعداد چرخه های مورد نیاز برای سیگنال فلورسنت را نشان می دهد. از آستانه یا سیگنال پس‌زمینه فراتر رود. مقادیر بالاتر Ct نشان‌دهنده غلظت کمتر الگو است و بالعکس. مقادیر Ct نمونه‌های NTC به اندازه‌ای که انتظار می‌رفت بالا بود. تفاوت در مقادیر \(\تقریباً 3\) Ct بین کنترل مثبت و نمونه آزمایشی بیشتر نشان می‌دهد که هر نمونه آزمایشی در مقایسه با کنترل مثبت تقریباً 1٪ قالب دارد. ما قبلاً بحث کرده‌ایم که آمپلیکون‌های طولانی‌تر منجر به حساسیت بهتر می‌شود. تقویت قطعات طولانی‌تر جدا شده از نمونه‌های محیطی ناهمگن با توجه به معایب چالش برانگیز است. با غلظت کم ویروس و تخریب RNA. با این حال، با غنی سازی ویروس و پروتکل تقویت PCR، ما توانستیم قطعه \(503\,\hbox {bp}\) را با موفقیت برای سنجش الکتروشیمیایی تقویت کنیم.
شکل 6 نتایج حسگر الکتروشیمیایی آمپلیکون قطعه \(503\,\hbox {bp}\) را نشان می دهد که هر دو از cDNA رقیق نشده به عنوان الگو (1:1) و 100 برابر cDNA رقیق شده به عنوان الگو (1:100 ) استفاده می کنند PCR انجام شده است. در مقایسه با NTC و PC (شکل S4 را در اطلاعات تکمیلی برای ولتاموگرافی های معرف ببینید). هر جعبه در نمودار جعبه در شکل 6 شامل اندازه گیری هایی از سه نمونه در 5 الکترود است. برای جلوگیری از خطاهای ناشی از الکترود از الکترودهای یکسان برای اندازه گیری همه نمونه ها استفاده شد. در مقایسه با اندازه‌گیری‌های CV، اندازه‌گیری‌های DPV وضوح بهتری برای تشخیص نمونه‌های آزمایشی و PC از NTC نشان می‌دهند، زیرا همانطور که قبلاً ذکر شد، جریان‌های فارادیک به دلیل جریان‌های خازنی پس‌زمینه در دومی پنهان هستند. برای آمپلیکون‌های طولانی‌تر، مشاهده کردیم که کنترل منفی (NTC) منجر به جریان‌های پیک CV و DPV بالاتر نسبت به کنترل مثبت شد، در حالی که نمونه‌های آزمایشی مثبت و رقیق‌نشده، ارتفاع‌های پیک پیک جریان‌های DPV مشابهی را نشان دادند. مقادیر میانگین و میانه اندازه‌گیری شده برای هر رقیق‌نشده (1:1) نمونه آزمایش و PC را می توان به وضوح از خروجی سنسور برای نمونه NTC تشخیص داد، در حالی که وضوح برای نمونه رقیق شده 1:100 کمتر مشخص است. برای رقت 100 برابری cDNA، ما هیچ باندی را در طول الکتروفورز ژل مشاهده نکردیم. (خطوط در شکل 5 نشان داده نشده است)، و جریان های پیک DPV و CV مشابه با جریان های مورد انتظار برای NTC بودند. نتایج برای قطعه \(117\,\hbox {bp}\) در اطلاعات تکمیلی نشان داده شده است. کنترل یک پاسخ الکتروشیمیایی را از سنسور PCB به دلیل جذب مگابایت آزاد روی الکترود و برهمکنش MB با اولیگونوکلئوتید پرایمر تک رشته ای القا کرد. بنابراین، هر بار که یک نمونه آزمایش می شود، باید یک کنترل منفی اجرا شود و حداکثر جریان نمونه آزمایشی در مقایسه با جریان پیک به دست آمده توسط کنترل منفی برای دستیابی به اندازه گیری دیفرانسیل (نسبی)39،40 برای طبقه بندی نمونه آزمایشی به عنوان مثبت یا منفی.
(الف) DPV و (ب) پیک جریان CV برای تشخیص الکتروشیمیایی قطعات \(503\,\hbox {bp}\) در نمونه‌های آب دریاچه. نمونه‌های آزمایشی در سه تکرار اندازه‌گیری شدند و با کنترل‌های بدون الگو (NTC) و کنترل های مثبت (PC).
یافته‌های ما مکانیسم‌های مختلفی را نشان می‌دهد که بر عملکرد حسگرهای الکتروشیمیایی برای آمپلیکون‌های با طول‌های مختلف برای DNA‌های مختلف تأثیر می‌گذارد، با غلظت‌هایی که با اندازه‌گیری‌های نوری با استفاده از طیف‌سنج UV/Vis تأیید می‌شوند. مشاهدات ما بر این بینش تأکید می‌کند که قطعات DNA طولانی‌تر تا \(\تقریبا\) \(500\,\hbox {bp}\) را می توان با حساسیت بالاتر تشخیص داد و وجود نمک در نمونه حساسیت غلظت DNA را که بر حساسیت بالاتر تأثیر می گذارد (به ندرت \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) و بالاتر). علاوه بر این، ما تأثیر انواع مختلف نمونه‌ها، از جمله آمپلیکن‌های خالص‌شده با ژل با و بدون نمک افزوده، و افزودن نمونه‌های آب دریاچه در اندازه‌گیری‌های DPV و CV را بررسی کردیم.ما مشاهده کردیم که DPV وضوح بهتری ارائه می‌دهد، زیرا جریان خازنی پس‌زمینه نیز بر اندازه‌گیری CV تأثیر می‌گذارد و آن را کمتر حساس می‌کند.
تکثیر قطعات طولانی‌تر به یکپارچگی RNA ژنومی ویروسی بستگی دارد. مطالعات متعدد نشان داده‌اند که تکثیر قطعات طولانی‌تر به دلیل تخریب RNA در محیط و پتانسیل پیوند در طول جداسازی همیشه کارآمد نیست. ما مشاهده کردیم که روش غلظت ویروس مبتنی بر PEG در تغلیظ فاژ Phi-6 در نمونه‌های آب دریاچه نسبت به روش غلظت ویروس مبتنی بر هیدروکسید آلومینیوم مؤثرتر بود. ثابت شد که توانایی تشخیص قطعات طولانی DNA بر نیاز به Multiplex PCR غلبه می‌کند. برای تقویت چندین قالب با طول کوتاه تر و کاهش احتمال تطابق ویژگی.
نمونه‌های بیولوژیکی کمیاب هستند، بنابراین نیاز به طراحی یک حسگر زیستی وجود دارد که به حداقل نمونه‌ها برای آزمایش نیاز دارد. الکترودهای PCB ENIG مورد استفاده در این مطالعه فقط به \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ نیاز دارند. ) نمونه هایی برای آزمایش برای پوشش ناحیه موثر الکترودها. علاوه بر این، همان الکترود را می توان پس از تمیز کردن قبل از توزیع نمونه بعدی مجددا استفاده کرد. نمونه های تقویت شده نیازی به افزودن هیچ ماده شیمیایی دیگری به جز متیلن بلو ندارند که ارزان است. از آنجایی که تولید هر الکترود حدود 0.55 دلار (یا INR 40) هزینه دارد، این حسگر زیستی می تواند جایگزین مقرون به صرفه ای برای فناوری های تشخیص موجود باشد. جدول 2 مقایسه این کار را با سایر حسگرهای گزارش شده در ادبیات برای مدت طولانی نشان می دهد. قطعات DNA در نمونه های ناهمگن
با توجه به اینکه پروتکل‌های تشخیص الکتروشیمیایی مبتنی بر MB بر ویژگی PCR تکیه دارند، محدودیت اصلی این روش پتانسیل تقویت غیر اختصاصی در نمونه‌های ناهمگن مانند فاضلاب و آب دریاچه یا استفاده از پرایمرهای با خلوص پایین است. برای بهبود حساسیت روش های تشخیص الکتروشیمیایی برای تشخیص DNA محصولات PCR خالص نشده با استفاده از الکترودهای PCB اصلاح نشده ENIG، درک بهتر خطاهای وارد شده توسط dNTP ها و پرایمرهای استفاده نشده و بهینه سازی شرایط واکنش و پروتکل های سنجش ضروری است. پارامترهای فیزیکوشیمیایی اضافی مانند pH، دما و بیولوژیکی. نیاز به اکسیژن (BOD) نمونه آب نیز ممکن است نیاز به اندازه گیری داشته باشد تا دقت اندازه گیری بهبود یابد.
در نتیجه، ما یک سنسور الکتروشیمیایی ENIG PCB ارزان قیمت برای تشخیص ویروس در نمونه‌های محیطی (آب دریاچه) پیشنهاد می‌کنیم. برخلاف الکترودهای الیگونوکلئوتیدی تثبیت‌شده یا بسترهای سفارشی برای سنجش DNA که برای حفظ حساسیت به ذخیره‌سازی برودتی نیاز دارند، تکنیک ما از PCB اصلاح‌نشده استفاده می‌کند. الکترودهایی با ماندگاری طولانی‌تر و بدون نیاز به ذخیره‌سازی خاص و بنابراین برای توسعه راه‌حل‌های اندازه‌گیری با پردازش نمونه خودکار مستقر در LMICs مناسب هستند. این حسگر زیستی از رنگ‌های ردوکس با DNA intercalating ارزان (MB) برای تشخیص سریع آمپلیکون‌های هدف استفاده می‌کند. تقویت غیر اختصاصی رایج در نمونه های محیطی به دلیل اتصال غیراختصاصی MBs به الیگونوکلئوتیدهای تک و دو رشته ای، ویژگی این روش سنجش را کاهش می دهد. بنابراین، ویژگی این آزمایش به بهینه سازی پرایمرها و شرایط واکنش PCR بستگی دارد. علاوه بر این، CV و پیک جریان های DPV به دست آمده از نمونه های آزمایش شده باید نسبت به پاسخ های به دست آمده از کنترل منفی (NTC) برای هر آزمون تفسیر شوند. طرح ها و روش های سنسور الکتروشیمیایی ارائه شده در این کار می توانند با نمونه گیری های خودکار یکپارچه شوند تا یک نمونه کاملاً خودکار و کم ایجاد کنند. - راه حل هزینه ای که می تواند نمونه ها را جمع آوری و تجزیه و تحلیل کند و نتایج را به صورت بی سیم به آزمایشگاه منتقل کند.
Cashdollar, J. & Wymer, L. روش‌های غلظت اولیه ویروس‌ها از نمونه‌های آب: بررسی و متاآنالیز مطالعات اخیر.Application.microorganism.115, pp. 1-11 (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL viruses waterborne: موانع برای آب آشامیدنی سالم. PLoS Pathogens.11, E1004867 (2015).
Shrestha، S. و همکاران. اپیدمیولوژی فاضلاب برای نظارت مقرون به صرفه در مقیاس بزرگ COVID-19 در کشورهای با درآمد کم و متوسط: چالش ها و فرصت ها. آب 13، 2897 (2021).
Palecek, E. & Bartosik, M. الکتروشیمی اسید نوکلئیک. شیمیایی.Rev.112, 3427-3481 (2012).
Tani, A., Thomson, AJ & Butt, JN متیلن بلو به عنوان یک تمایز الکتروشیمیایی الیگونوکلئوتیدهای تک و دو رشته ای بی حرکت بر روی بسترهای طلا. تحلیلگر 126، 1756-1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ مقایسه بین کاتیون و آنیون برای انتقال الکتروشیمیایی هیبریداسیون DNA توسط انتقال الکترون دوربرد.Electrochemistry.comminicate.6, 648-654 (2004).
Wong، EL & Gooding، JJ انتقال بار از طریق DNA: یک DNA الکتروشیمیایی انتخابی biosensor.anus.Chemical.78، 2138-2144 (2006).
Fang، TH و همکاران. دستگاه میکروسیالی PCR در زمان واقعی با تشخیص همزمان الکتروشیمیایی. حسگر بیولوژیکی. Bioelectronics.24، 2131-2136 (2009).
Win، BY و همکاران. مطالعه مکانیسم سیگنالینگ و تأیید عملکرد یک سیستم PCR بلادرنگ الکتروشیمیایی بر اساس برهمکنش متیلن بلو با DNA. تحلیلگر 136، 1573-1579 (2011).
رامیرز-چواریا، RG و همکاران. حسگر الکتروشیمیایی مبتنی بر تقویت همدما با واسطه حلقه برای تشخیص sars-cov-2 در نمونه‌های فاضلاب.Environment.Chemical.Britain.10, 107488 (2022).
کومار، ام و همکاران. سنجش الکتروشیمیایی آمپلیکون‌های SARS-CoV-2 با الکترودهای PCB. سنسور فعال می‌شود. B Chemistry.343، 130169 (2021).
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. & Yoshida, H. تشخیص کارآمد RNA SARS-CoV-2 در بخش جامد wastewater.science.general environment.763, 144587 (2021).
Alygizakis، N. و همکاران. روش‌های تحلیلی برای تشخیص SARS-CoV-2 در فاضلاب: پروتکل و دیدگاه‌های آینده. TraC trending anal.Chemical.134، 116125 (2020).
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. & Kashtan, N. بقای باکتریوفاژ پوشیده شده Phi6 (جایگزین SARS-CoV-2) در قطرات بزاق تبخیر شده که روی سطوح شیشه ای رسوب کرده است. علم. Rep.10، 1-10 (2020).
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ تداوم زیست محیطی یک جانشین SARS-CoV-2 (Phi6) در آمیب آزاد.Water Health 20, 83 (2021).
Mindich, L. بسته بندی دقیق سه قطعه ژنومی باکتریوفاژ RNA دو رشته ای\(\varphi\)6.microorganism.Moore.biology.Rev.63، 149-160 (1999).
Pirttimaa، MJ و بامفورد، ساختار ثانویه DH RNA فاژ \(\varphi\)6 منطقه بسته بندی.RNA 6، 880-889 (2000).
Bonilla, N. et al.Phages on the Tap - یک پروتکل سریع و کارآمد برای تهیه انبارهای آزمایشگاهی باکتریوفاژها. PeerJ 4, e2261 (2016).