Eskerrik asko Nature.com bisitatzeagatik. Erabiltzen ari zaren arakatzailearen bertsioak CSSrako laguntza mugatua du. Esperientzia onena lortzeko, eguneratutako arakatzailea erabiltzea gomendatzen dugu (edo Internet Explorer-en bateragarritasun modua desaktibatzea). Bitartean, ziurtatzeko laguntza jarraituz, gunea estilorik eta JavaScript gabe bistaratuko dugu.
COVID-19 pandemia hasi zenetik oso estimatua izan da ingurumen-laginen jarraipenaren garrantzia, eta monitorizazio-ahalegin batzuk egiten ari dira urrezko estandarra erabiliz, nahiz eta qPCRn oinarritutako teknikak garestiak diren. DNAren biosentsore elektrokimikoek kostu-eraginkorra izan dezakete. Errenta baxuko eta ertaineko herrialdeetako ingurumen-ur laginak monitorizatzeko irtenbidea. Lan honetan, lakuetako ur-laginetatik (SARS-CoV-2-ren ordezko ezaguna) isolatutako Phi6 fagotik lortutako anplikoien detekzio elektrokimikoa frogatzen dugu, ENIG erabiliz. PCB elektrodoak gainazal aldaketarik gabe osatzeko.sexua. Sentsore elektrokimikoaren erantzuna luzera ezberdineko bi DNA zatitan (\({117}\,\hbox {bp}\) eta \({503}\,\hbox {bp}\)]) eta PCR nahasketa nagusietako gatzen eragina metileno urdina (MB)-DNA elkarrekintzetan. Gure emaitzek erakusten dute DNA zatien luzerak sentsibilitate elektrokimikoa nabarmen zehazten duela eta lan honetan frogatzen dute PCR produktuen gel-arazterik gabe anplikoi luzeak detektatzeko gaitasuna dela. garrantzitsua da ur laginak in situ neurtzeko.Karga birikorako soluzio guztiz automatizatua ona da.
Ur bidezko birusen transmisioa osasun publikoko arrisku gisa ezagutzen da 1940ko hamarkadatik, poliomielitisaren eta hepatitisaren ur bidezko transmisioaren lehen frogarekin. Osasunaren Mundu Erakundeak (OME) uretan transmititzen diren hainbat patogeno biriko sailkatu ditu osasun-garrantzi ertainetik altuko 2. Birus tradizionalak. detekzio-metodoek urrezko qPCR-n oinarritutako tekniketan oinarritzen dira, oso sentikorrak eta espezifikoak dira, baina langile trebeak behar dituzte laborategian probak egiteko tresna garestiak erabiliz. Hala ere, errenta baxuko eta ertaineko herrialdeetan (LMIC) baliabide mugatuekin, giza litekeena da lagin-probak ingurumen-uraren laginaren monitorizazioari lehentasuna izatea. Hori dela eta, kostu baxuko metodo alternatiboak behar dira denbora errealean errenta baxuko eta ertaineko herrialdeetan uraren eta hondakin-uren laginen jarraipena egiteko, gaixotasun-agerraldien abisu goiztiar gisa. horrela, birusaren pandemiaren eragin sozioekonomiko larrietatik babesten dituzte. Azido nukleikoetarako kostu baxuko biosentsore elektrokimikoek irtenbide potentzial itxaropena eman diezaiokete ase gabeko behar horri. azaleratu eta hibridatu egiten dira laginean bat datorren sekuentzia bat dagoenean. Ondoren, hainbat teknika elektrokimikoren bidez seinale bihur daiteke potasio burdina/ferroyanuroa bezalako erredox bitartekariak erabiliz. kate bikoitzeko DNAn (dsDNA) tartekatzen direla jakinarazi dute kate bakarreko DNArekin lotura ez-espezifikoaz gain5,6. MB-ak MB-DNA konplexuak osatzeko duten elkarrekikotasunari esker, erredox bitartekari gisa aukera ezaguna egiten da hainbat DNA elektrokimikotan. sentsoreen konfigurazioak5,6,7,8,9.MB-ren DNAren arteko interkalazioa ez-espezifikoa den arren, eta sentsore elektrokimiko honen espezifikotasuna PCR edo anplifikazio isotermikorako erabiltzen diren lehengaien garbitasunaren araberakoa den arren, oso egokia da benetako ezartzeko. -denbora elektrokimikoan oinarritutako qPCR edo fluoreszentzia isotermiko anplifikazioa DNAren kontzentrazioa neurtzeko alternatiba gisa 9 .Halako ezarpen batean, Won et al.Urrezko elektrodoen gainazala 6-mercapto-1-hexanol (MCH) aldatu zen denbora errealerako. MB duten PCR anplikoien neurketa pultsu-voltametria diferentziala (DPV) erabiliz9.Beste kasu batzuetan, Ramirez et al. SARS-CoV-2 hondakin-uretan detektatzea RT-LAMP erreakzioaren bidez MB serigrafiatutako elektrodoekin.Platinozko elektrodoak ere izan dira. in situ elektrodo gisa erabiltzen da erreakzioetan anplikoiak elektrokimikoki detektatzeko diseinatutako PCR mikrofluidikoko plataforma batean 8 .Ikerketa hauek guztiek elektrodoen gainazaleko aldaketa eskatzen dute, eta horrek ekoizpen eta funtzionamendu kostuak areagotu ditu, elektrodo funtzionalizatu horien egonkortasunerako biltegiratze eskakizun bereziengatik.
Lakuko ur laginetan partikula biral kontzentratuetatik lortutako anplikoiak detektatzeko lan-fluxuaren eskema.
Duela gutxi SARS-CoV-2 anplikoien sentsazio elektrokimikoa frogatu dugu kostu baxuko zirkuitu inprimatuko plakako (PCB) elektrodoekin DPVn eta MB-DNA konplexuen adsortzioan eragindako gailur aldaketetan oinarritutako voltametria ziklikoan (CV) gailurrean. egungo11.Jakinarazten dugu DNA zati luzeagoek (N1-N2, \({943}\, \hbox) CDC-k gomendatutako N1 aurrerantz eta N2 alderantzizko abiarazleen bidez sortutako zati laburragoekin alderatuta {bp}\)) linealtasun hobea erakutsi zutela sentsorearen erantzunean. ( N1, \(72\,\hbox {bp}\)) N1 aurrerantz eta N1 alderantzizko primer multzoak erabiliz eratua. Azterketa hauek nukleasarik gabeko uretan prestatutako DNA diluzioak erabiliz egiten dira. Plataforma SARS-CoV detektatzeko ere erabili zen. -2 anplikoi hondakin-uren lagin simulatuetan (ARN totalaren laginak SARS-CoV-2 RNArekin erpin eginez lortutakoak). Isolamenduan eta beheranzko prozesatzean RNA moztu daitekeenez,12,13 zaila da lagin heterogeneo honekin zati luzeagoak anplifikatzea. Beraz, hondakin-uretan SARS-CoV-2 anplikoiaren sentsazio elektrokimikoaren erakustaldia \(72\,\hbox {bp}\) N1 zati laburrara mugatzen da.
Lan honetan, Phi6 fagoaren ENIG PCBn oinarritutako sentsazio elektrokimikoaren bideragarritasuna ikertu dugu lakuko ur laginetatik kontzentratuta eta isolatuta (1. irudia). mintz lipidikoa eta erpin-proteina ere badituzte.Arrazoi horiengatik, Phi6 bakteriofagoa SARS-CoV-2 eta beste RNA birus patogeno inguratzaile batzuen ordezko ezaguna da14,15.Fago-partikulatik isolatutako RNA cDNA sintesirako txantiloi gisa erabili zen eta ondoren. PCR luzera duten 117 eta 503 base bikoteko bi DNA zati lortzeko. Gure aurreko lanean \(943\,\hbox {bp}\) N1-N2 zatiak anplifikatzeko erronka ikusita, tarteko luzera zatiak (\(117)). \,\hbox {bp}\) eta \(503 \,\hbox {bp}\)), erabilgarri dauden lehengaietan oinarrituta. Sentsore elektrokimikoen erantzuna sistematikoki aztertu zen kontzentrazio-tarte zabal batean (\({10}\,{ \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) to \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) bi zatietarako MBren presentzia, gatzak sentsorearen erantzunean duen eragina neurketa espektrofotometrikoen bidez ezaugarritu eta balioztatu da. Lan honen ekarpen nagusiak hauek dira:
DNA zatiaren luzerak eta laginaren gatzaren presentziak asko eragiten du sentikortasunean.Gure emaitzek erakusten dute jarduera elektrokimikoa MBren, DNAren eta sentsorearen elkarrekintzaren mekanismo ezberdinen araberakoa dela erantzun voltametrikoan, DNAren kontzentrazio eta luzeraren arabera, zati luzeagoekin. MB eta DNA.
ADN-kontzentrazioa MB-DNA-ren elkarreraginaren mekanismoa zehazten du aldatu gabeko elektrodoetan MB-DNA-ren elkarrekintzaren mekanismo desberdinak DNA-kontzentrazioaren araberakoak direla frogatzen dugu. {l}}}\), ikusi genuen korronte elektrokimikoaren erantzuna elektrodoan MB-DNAren adsortzioak zehazten zuela batez ere, eta kontzentrazio baxuagoetan, berriz, DNA kontzentrazio handietan, korronte elektrokimikoaren erantzuna redox-aren inhibizio esterikoaren arabera zehazten zela ikusi genuen. DNA base bikoteen artean MB txertatzearen ondoriozko jarduera.
ENIG PCB-n oinarritutako azido nukleiko biralen sentsazio elektrokimikoa lakuko ur laginetan Behaketak Phi6-n gehitutako \(503\,\hbox {bp}\) DNA zatien detekzio elektrokimikoaren bidez balioztatu dira Powai Lake-ko ur laginetatik lortutako IIT Mumbai Campusean. Emaitza fagoa.
Inplementazio-kostu baxua eta kontrol-sistema guztiz automatizatuetan, oligonukleotidoetan edo aptameroetan integratzeko potentziala, iraupen luzeagoa duten elektrodoetan.
Phi6 fagoa Cytoviridae familiako dsRNA birus bat da, Pseudomonas syringae infektatzen duena. Phi6 fagoaren genoma 3 zatitan dago: S (\(2,95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4,07 \,\hbox {Kb}\)) eta L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\))16,17.Phi6 fagoak BSL-1 Pseudomonas andui ez-patogeno bat infektatzen duenez, segurua da erabiltzeko. eta erraz hazi daiteke laborategian.Phage Phi6 eta bere ostalaria Pseudomonas syringae Felix d'Herelle Reference Center for Bacterial Viruses, Kanadako Laval Unibertsitatean erosi ziren (erreferentzia zentroen katalogoaren zenbakiak HER-102 eta HER-1102 dira, hurrenez hurren) .Phi6 fagoa eta bere ostalaria erreferentzia-zentroak agindu bezala berpiztu ziren. Phi6 fagoa plaken lisiaren eta eluzioaren bidez araztu zen \(\10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox {rekin azken tituluak lortzeko. ml}}\) (plaka osatzen duten unitateak/ mililitro). RNA araztutako fago-partikulaetatik GenElute™ Universal Total RNA Purification Kit (Sigma-Aldrich) erabiliz fabrikatzailearen argibideen arabera isolatu zen. Laburbilduz, Phi6 suspentsio araztutako fago bat\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) lisatu egin zen eta lisatua spin zutabe batean kargatu zen RNA erretxinaren zutabeari lotzeko. 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) kitak emandakoa. Estimatu ARNaren kontzentrazioa absorbantziaren arabera \(260\,\hbox {nm}\).RNA alikuotan gorde zen \-n. ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) gehiago erabili arte.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) iScript cDNA Synthesis Kit (Bio -Rad Laboratories) cDNA sintesirako txantiloi gisa erabili zen fabrikatzailearen argibideei jarraituz. Laburbilduz, cDNA sintesi-erreakzio batek 3 urrats ditu: lehentzea \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min} }\) , \({20}\,{\hbox {min}}\)-ren alderantzizko transkripzioa \({46}\,{^{\circ }\hbox {C}}\), eta alderantziz Grabagailua \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) \({1}\,{\hbox {min }}\).% 1eko agarosa-gel batean exekutatzen denean, cDNAk espero ziren hiru RNA zatiei dagozkien hiru banda erakutsi zituen (datuak ez dira erakusten).Ondoko abiarazle hauek 117 eta 503 bp-ko luzera duten bi DNA zati handitzeko erabili ziren, cDNA erabiliz PCRrako txantiloi gisa miniPCR® mini8 termoziklatu batean:
\(117\,\hbox {bp}\) eta \(503\,\hbox {bp}\) abiarazleak M segmentuko 1476-1575 nukleotido eta L segmentuko 458-943 nukleotidoei dagozkie, hurrenez hurren azidoa. .Anplifikatutako PCR produktu guztiak % 1eko agarosa geletan elektroforesatu ziren, eta anplifikatutako DNA xede GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Fisher Scientific) erabiliz araztu zen.
IIT Mumbaiko campuseko laku bat (Powai Lake, Powai, Mumbai) erabili zen fago-partikulak gehitzeko. Aintzirako ura \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) mintz batetik iragazten zen kentzeko. esekitako partikulak, eta gero Phi6 fagoa gehitu zen. Gehitu \({1}\,{\hbox {ml}}\)-ren \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} \) \({100}\ ,{\hbox {ml}}\) iragazitako lakuko uretara, \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\).Alikuota txiki bat izan zen. karga birikoa plaken saiakuntzaren bidez neurtzeko erreserbatuta. Bi metodo ezberdin probatu ditugu Phi6 birus-partikulak kontzentratzeko: (1) aluminio hidroxidoaren adsortzio-prezipitazio metodoa,19 inguruneko laginetatik ateratako RNA birus inguratzaileen kontzentraziorako balioztatu dena, eta (2) ) Polietilenglikol (PEG) oinarritutako birusen kontzentrazio metodoa Flood et al.20 .PEG-en oinarritutako metodoaren berreskuratze-eraginkortasuna aluminio hidroxidoaren metodoarena baino hobea zela ikusi zenez, PEG-en oinarritutako metodoa erabili zen lakuko ur laginetatik Phi6 partikulak kontzentratzeko.
Erabilitako PEG metodoa honako hau izan zen: PEG 8000 eta \(\hbox {NaCl}\) Phi6-ko lakuko ur laginei gehitu zitzaizkien PEG 8000 % 8 eta \(0,2\,\hbox {M} \) \( \ hbox {NaCl}\).Laginak astingailu batean inkubatu ziren\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), orduan zentrifugatua \(4700 \,\hbox {g}\) \({45}\,{\hbox {min}}\) da. Bota gainditzailea eta berriro suspentsi pelleta \({1}\, {\hbox {ml}}\) gainnatzaile berean. Spiking eta birusen kontzentrazio esperimentu guztiak hirutan egin ziren. Kontzentrazioa egin ondoren, alikuota txiki bat gorde zen plaka saiaketaren bidez berreskuratzeko eraginkortasuna neurtzeko. kit-ek hornitutako eluzio-buffer batean\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\). ARN kontzentrazioa lagin batetik bestera hirukoiztuta aldatuko denez, \({2}\,{\upmu \ hbox {l}}\) ARN hiruretarako erabiltzen da bere kontzentrazioa edozein dela ere laginen cDNA sintesia.cDNA sintesia lehen azaldu bezala egin zen.\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNA \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCRrako txantiloi gisa erabili zen 35 zikloetarako \(117\,\hbox {bp}\) eta \(503\,\hbox {). bp}\) zatiak. Lagin hauek "1:1" gisa irudikatzen dira, hau da, diluziorik gabe. Txantiloirik gabeko kontrol bat (NTC) ezarri zen kontrol negatibo gisa, eta araztutako fagoetatik isolatutako RNA erabiliz sintetizatutako cDNA bat ezarri zen bitartean. kontrol positibo baterako (PC) txantiloi gisa. PCR kuantitatiboa (qPCR) Stratagene Mx3000P RT-PCR tresna batean egin zen Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies) erabiliz. Erreakzioak lehen bezala hirukoiztuta ezarri ziren. deskribatu. Zikloaren atalasea (Ct) erregistratu zen lagin guztietarako. Gainera, diluitutako laginak \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) izan ziren 1:100ean diluitutako cDNA erabiliz iragazitako uretan. \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) 35 zikloetarako PCR. Lagin hauek "1:100" gisa adierazten dira.
PCB elektrodoak kostu baxuko Elektroless Nickel Immersion Gold (ENIG) prozesu baten bidez fabrikatzen dira, urrezko plaka gehigarririk behar izan gabe.ENIG PCB elektrodoen zehaztapenak gure aurreko lanean zehazten dira11.ENIG PCB elektrodoetarako, elektrodoen garbiketa metodo tradizionalak, esaterako. Piraña disoluzioa edo azido sulfurikoko voltametria ziklikoa ez da gomendagarria, urrezko geruza mehea (lodiera \(\gutxi gorabehera\) \(100\,\hbox {nm }\)) zuritu eta azpian dauden kobre geruzak agerian uzten baitituzte. korrosioari 21, 22, 23, 24, 25. Hori dela eta, garbitu elektrodoak IPAz hezetutako litxarrik gabeko zapi batekin. Probatu beharreko lagina \({50}\,{\upmu \hbox {M}) inkubatu zen. }\) MB \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) erraz txertatzeko. Gure aurreko lanean , MB kontzentrazioa handituz sentsorearen sentsibilitatea eta linealtasuna hobetu zirela ikusi genuen 11 .Gure lehen lanetan jakinarazitako optimizazioetan oinarrituta, \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB erabili genuen. Azterketa honetan DNA txertatzeko kontzentrazioek.Hari bikoitzeko DNAren (ds-DNA) detekzio elektrokimikoa tartekatzaile anioniko edo katioikoen bidez lor daiteke.Tarkagailu anionikoek DNA selektibitate hobearekin detektatzen badute ere, gaueko inkubazioa behar dute, eta ondorioz detekzio-denbora luzeagoak izango dira.On bestetik, MB bezalako interkaladore katioikoek inkubazio denbora laburragoak behar dituzte, gutxi gorabehera \({1}\,{\hbox {h}}\) ds-DNA6 elektrokimiko detektatzeko. Neurketa bakoitzak probatu beharreko lagina banatzea dakar. elektrodoa\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), ondoren IPAz hezetutako trapu batekin garbitu, beste lagin batekin jarraitu aurretik.neurketa bat.Lagin bakoitza 5 elektrodo ezberdinetan probatu zen, bestela adierazi ezean.DPV eta CV neurketak PalmSens Sensit Smart potentiostato baten bidez egin ziren, eta PSTrace softwarea potentiostatoaren konfiguraziorako eta datuak eskuratzeko, korronte gailurreko kalkuluak barne. Ezarpen hauek erabiltzen dira. DPV eta CV neurketetarako:
DPV: oreka-denbora = \(8\,\hbox {s}\), tentsio-urrats = \(3\,\hbox {mV}\), pultsu-tentsioa = \(25\,\hbox {mV}\), pultsuaren iraupena = \(50\,\hbox {ms}\), eskaneaketa-abiadura = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: oreka-denbora = \(8\,\hbox {s}\), Tentsio urratsa = \(3\,\hbox {mV}\), Ekorketa-tasa = \({300}\,\hbox {mV/ s }\)
\({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB-rekin konplexatutako DNAren voltamogrametatik lortutako korronte gailurrak: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
DPV eta CV voltamogramak ENIG PCB elektrodoetan lortu ziren \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB DNArekin konplexuak (10–\({20}\,{\ hbox {ng) kontzentrazioetan. }/{\upmu \hbox {l}}}\) hau da, 0,13–\({0,26}\,{\upmu \hbox {M}}\) \(117\,\hbox {bp}\ ) eta 0,03rako –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) for \(503\,\hbox {bp}\)). Voltamograma errepresentatiboak informazio osagarriko S1 irudian agertzen dira. 2. irudiak emaitzak erakusten ditu. DPV eta CV neurketen (korronte gailurra) gel bidez araztutako PCR produktuak erabiliz. CV neurketekin alderatuta, DPV neurketek sentsibilitate handiagoa erakusten dute (korrontea DNAren kontzentrazioaren arabera), CV neurketetan atzeko korronte kapazitiboek korronte faradaikoak ezkutatzen dituztelako 26 . boxplot-eko kutxa bakoitzak 5 elektrodotako neurketak ditu. Neurketa guztiek elektrodo-multzo bera erabiltzen dute neurketa-erroreak saihesteko elektrodoz-elektrodoaren aldakuntzaren ondorioz. , luzeagoa (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ \(117) ) zatiarekin alderatuta. Hau bat dator gure aurreko lanean adierazitako elektrodoen adsortziorako espero den joerarekin. MB-DNA konplexuaren adsortzioak elektrodoaren karga-transferentzia errazten du, eta horrek korronte gailurra areagotzen laguntzen du.Beste ikerketek erakutsi dute oligonukleotidoen tamaina eta sekuentziaren eragina MB-DNA arteko interkalazioan27,28,29,30.Guanina. Bi anplikoien (\(117\,\hbox {bp}\) eta \(503\,\hbox {bp}\)) -zitosina (GC) edukia gutxi gorabehera % 50ekoa zen, behaketa desberdintasuna dela eta. anplikoiaren luzerara.Hala ere, DNA kontzentrazio handiagoetarako (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), \(503\,\hbox {bp}) \) eta \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) \(117\,\hbox {bp}\)), bi anplifikazio ikusten ditugu. Subs-en gailur-korronteak murrizten dira bai DPV bai CV neurketetan. Hau da, MB DNAren base-pareen artean saturatu eta interkalatzen delako, eta ondorioz MB31,32 talde erreduzigarriaren jarduera redox-aren inhibizio esterikoa eragiten du.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
PCR nahasketa nagusietan dauden gatzak MB eta DNAren arteko interakzio elektrostatikoak oztopatzen ditu, beraz \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) \({50} \,{\) gehituz. upmu \hbox {M}}\) MB gel bidez araztutako produktua gatzak MB-DNA elkarrekintzan duen eragina aztertzeko. 3. Irudian ikusten den bezala, DNA kontzentrazio altuagoetarako (\(>{2}\,{\) ikusi dugu. hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) eta \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) for \(117\,\hbox {bp} \)), DPV eta CV-n Gatza gehitzeak ez zuen neurri handi batean eraginik izan (ikus S2 irudia informazio osagarria voltamograma adierazgarrietarako). ADN-kontzentrazio baxuagoetan, gatza gehitzeak sentikortasuna asko murrizten du, eta ondorioz ez da korronte aldaketa nabarmenik sortzen DNA-kontzentrazioarekin.Gatzaren antzeko efektu negatiboak MB-DNA elkarrekintzan eta interkalazioan beste ikertzaile batzuek jakinarazi dituzte aurretik33,34.\(\hbox { Mg}^{2+}\) katioiak DNAren fosfato negatiboarekin lotzen dira, eta, ondorioz, MB eta DNAren arteko interakzio elektrostatikoa oztopatzen dute. DNAren kontzentrazio altuagoetan, redox-aktiboen MBren inhibizio esterikoek gailur-korronte txikiagoak eragiten dituzte, beraz, interakzio elektrostatikoak. ez dute eragin nabarmenik sentsorearen erantzunean. Funtsezko puntua da biosentsore hau hobeagoa dela DNA kontzentrazio handiagoak detektatzeko (gutxitan \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) edo handiagoa), Ingurumeneko ur laginak guztiz automatizatuta prozesatzeko, non PCR produktuen gel-araztea bideragarria ez den.
Xurgapen-kurbaren azpiko azalera 600-700 \(\hbox {nm}\) \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB-rekin konplexatutako DNAren hainbat kontzentraziorako: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) gatzarekin eta gatz gabe (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) gatzarekin eta gatz gabe (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB laginei dagozkien DNA-kontzentrazioak DNArik ez.
Goiko emaitzak gehiago egiaztatzeko, neurketa optikoak egin ditugu UV/Vis espektrofotometro bat erabiliz (Thermo Scientific Multiskan GO), laginak \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) erabili dira bakoitzerako. Neurketa. Xurgapen-sinadura txikiagotzen da DNA-kontzentrazioa handitzen den heinean, \(600\,\hbox {nm}\) eta \(700\,\hbox {) uhin-luzera tarteko xurgapen-kurbaren azpian dagoen eremuaren joeran ikus daitekeenez. nm}\), 4. irudian ageri den bezala (S3 irudian ageri den xurgapen espektroa Informazio osagarrian). \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox baino txikiagoak diren DNA-kontzentrazioa duten laginetarako). {l}}}\), ez zen desberdintasun handirik izan DNA duten eta MB soilik duten laginen artean (\(503\,\hbox {bp}\) eta \(117\,\hbox {bp}\) ) luzera zatiak), MB redox-aktiboen inhibizio esterikorik ez dagoela adieraziz. DNAren kontzentrazio altuagoetan, xurgapen-seinalearen pixkanaka-pixkanaka gutxitzen zela ikusi genuen eta gatzaren aurrean xurgapenaren murrizketa txikiagoa ikusi genuen. Emaitza hauek molekularrei egotzi zitzaizkion. elkarrekintzak eta inhibizio esterikoa DNA hibridoetan base pilaketarekin. Gure emaitzak bat datoz MB-DNA arteko interkalazio-azterketa espektroskopikoei buruzko txostenekin, hipokromatikotasuna \(\pi\)–\(\pi ^*\)-n lotzen duten txostenekin. ) interkalazioaren ondoriozko trantsizio elektronikoak 36, 37, 38 geruzak.
Phi6 fagoaren agarosa gel elektroforesia: \(117\,\hbox {bp}\) eta \(503\,\hbox {bp}\) luzerako PCR produktuak lakuetako ur laginetatik.M-DNA markatzailea;NTC-ez-txantiloi kontrola, dagozkien anplikoiak dituzten abiarazleak;PC kontrol positiboa;1, 2, 3-diluitu gabeko (1:1) aintzirako ur laginak hirukoiztuta. Banda bat ikusten da \(\50\,\hbox {bp}\) \(503\,\) erabiltzen ez diren oligonukleotidoengatik. hbox {bp}\) erreia.
Sentsorearen erabilgarritasuna ebaluatu dugu Phi6 fagoarekin pikaturiko Powai lakuko ur-laginak erabiliz. ml}}\), araztutako fago esekietatik isolatutakoak, berriz, RNA \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) dela kalkulatu zen, gutxi gorabehera 1eko berreskuratze-eraginkortasunarekin. %.RNA alderantziz transkribatu zen cDNAra eta PCRrako eta qPCRrako txantiloi gisa erabili zen. Produktuaren tamaina agarosa gelaren elektroforesiaren bidez baieztatu zen (5. irudia) sentsorearekin probatu aurretik. Lagin hauek ez dira gel araztuak eta, beraz, PCRren osagai guztiak dituzte. baita interesgarri diren anplikoiak ere. qPCR-an erregistratutako Ct balioak (1. taula) dagozkien ur-laginetatik isolatutako RNAren kontzentrazioarekin erlazionatzen direla frogatu da. Ct balioak seinale fluoreszenteak behar dituen ziklo kopurua erakusten du. atalasea edo atzeko seinalea gainditzea. Ct balio altuek txantiloiaren kontzentrazio txikiagoa adierazten dute eta alderantziz. NTC laginen Ct balioak espero bezain altuak ziren. \(\gutxi gorabehera 3\) Ct balioen arteko aldea. kontrol positiboak eta proba-laginak, gainera, proba-lagin bakoitzak gutxi gorabehera % 1eko txantiloia duela kontrol positiboarekin alderatuta.Aurretik eztabaidatu dugu anplikoi luzeagoek sentikortasun hobea dakartela.Inguruko lagin heterogeneoetatik isolatutako zati luzeagoen anplifikazioa erronka da, desabantailak kontuan hartuta. birusen kontzentrazio baxuko eta RNA degradazioko.Hala ere, gure birusak aberasteko eta PCR anplifikatzeko protokoloarekin, \(503\,\hbox {bp}\) zatia arrakastaz handitu ahal izan genuen sentsazio elektrokimikorako.
6. Irudiak \(503\,\hbox {bp}\) zati-anplikoiaren sentsore elektrokimikoaren emaitzak erakusten ditu, biak diluitu gabeko cDNA txantiloi gisa (1:1) eta 100 aldiz diluitutako cDNA txantiloi gisa (1:100) erabiliz egindako PCR gisa. , NTC eta PCrekin alderatuta (ikus S4 irudia informazio osagarria voltamograma adierazgarrietarako). 6. irudiko kutxa-plotaren kutxa bakoitzak 5 elektrodotako hiru laginetako neurketak ditu. Elektrodo berdinak erabili ziren lagin guztiak neurtzeko elektrodoaren ondoriozko erroreak saihesteko. -elektrodoaren aldakuntza.CV neurketekin alderatuta, DPV neurketek bereizmen hobea erakusten dute proba eta PC laginak NTCetatik bereizteko, zeren, lehen esan bezala, korronte faradaikoak ezkutatu egiten dira azken hauetan hondoko korronte kapazitiboen ondorioz. Anplikoi luzeagoetarako, ikusi dugu kontrol negatiboak (NTC) CV eta DPV gailurreko korronte handiagoak eragin zituen kontrol positiboaren aldean, proba positibo eta diluitu gabeko laginek, berriz, DPV gailurreko korronteen antzeko altuera erakutsi zuten. Neurtutako batez besteko eta medianako balioak diluitu gabeko bakoitzeko (1:1) ) proba-lagina eta PC argi eta garbi ebatzi daitezke NTC laginaren sentsorearen irteeratik, 1:100 diluitutako laginaren bereizmena, berriz, ez da hain nabarmena. cDNAren 100 aldiz diluitzeko, ez dugu bandarik ikusi gel elektroforesian. (5. irudian agertzen ez diren bideak), eta dagozkion DPV eta CV gailurreko korronteak NTCrako espero zirenen antzekoak ziren. \(117\,\hbox {bp}\) zatiaren emaitzak Informazio osagarrian agertzen dira. Negatiboa kontrolak PCB sentsorearen erantzun elektrokimikoa eragin zuen elektrodoan MB askea xurgatzearen ondorioz eta MB-ak kate bakarreko lehen oligonukleotidoarekin elkarreraginaren ondorioz. Hori dela eta, lagin bat probatzen den bakoitzean, kontrol negatiboa egin behar da eta Proba-laginaren gailur-korrontea kontrol negatiboak lortutako gailur-korrontearekin alderatuta, neurketa diferentziala (erlatiboa) lortzeko39,40 proba-lagina positibo edo negatibo gisa sailkatzeko.
(a) DPV, eta (b) CV gailurra lakuko ur laginetan \(503\,\hbox {bp}\) zati elektrokimikoak detektatzeko CV gailurra. kontrol positiboak (PC).
Gure aurkikuntzek ADN desberdinetarako luzera ezberdineko anplikoien sentsore elektrokimikoen errendimenduan eragiten duten mekanismo desberdinak erakusten dituzte, UV/Vis espektrofotometro baten bidez neurketa optikoen bidez egiaztatutako kontzentrazioekin. Gure behaketek azpimarratzen dute DNA zati luzeagoa dela \(\gutxi gorabehera\) \(500\,\hbox {bp}\) sentsibilitate handiagoarekin detekta daiteke eta laginean gatz egoteak ez duela sentikortasun handiagoa eragiten duen DNA kontzentrazioa (gutxitan \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) eta gorago). Horrez gain, lagin mota ezberdinen eragina ikertu dugu, besteak beste, gel bidez araztutako anplikoiak gatz erantsiarekin eta gabe, eta lakuko ur laginak gehitzea DPV eta CV neurketetan.DPV-k bereizmen hobea ematen zuela ikusi genuen, hondoko korronte kapazitiboak CV neurketari ere eragiten diolako, hain sentikorrago bihurtuz.
Zati luzeen anplifikazioa RNA genomikoaren osotasunaren araberakoa da. Hainbat ikerketek frogatu dute zati luzeen anplifikazioa ez dela beti eraginkorra ingurunean RNA degradatzeagatik eta isolamenduan splicing ahalmenagatik11,41,42,43,44. .PEGn oinarritutako birusen kontzentrazio-metodoa eraginkorragoa zela aintzirako ur-laginetan pikatutako Phi-6 fagoak kontzentratzeko aluminio hidroxidoan oinarritutako birusen kontzentrazio-metodoa baino. DNA zati luzeak detektatzeko gaitasunak PCR multiplexaren eskakizuna gainditzen zuela frogatu zen. luzera laburragoko hainbat txantiloi handitzeko eta espezifikotasun gurutzatuaren aukera murrizteko.
Lagin biologikoak urriak dira, beraz, probak egiteko gutxieneko laginak behar dituen biosentsore bat diseinatzeko beharra dago.Ikerlan honetan erabilitako ENIG PCB elektrodoek \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ baino ez zuten behar. ) elektrodoen eremu eraginkorra estaltzeko probak egiteko laginak. Gainera, elektrodo bera berrerabili daiteke hurrengo lagina banatu aurretik garbitu ondoren. Anplifikatutako laginek ez dute metileno urdina ez den beste produktu kimikorik gehitu behar, hau da, merkea. eta gehien erabiltzen den produktu kimikoa. Elektrodo bakoitzak 0,55 dolar inguru (edo 40 INR) kostatzen duenez, biosentsore hau egungo detekzio-teknologien alternatiba errentagarria izan daiteke. DNA zatiak lagin heterogeneoetan.
MB-n oinarritutako detekzio elektrokimikoko protokoloak PCRren espezifikotasunean oinarritzen direla kontuan hartuta, metodo honen muga garrantzitsu bat lagin heterogeneoetan (esaterako, hondakin-urak eta lakuetako urak bezalako anplifikazio ez-espezifikoa izateko potentziala da edo purutasun gutxiko lehengaiak erabiliz). Araztu gabeko PCR produktuen DNA detektatzeko metodo elektrokimikoak aldatu gabeko ENIG PCB elektrodoak erabiliz, beharrezkoa da erabili gabeko dNTP eta abiarazleek eragindako akatsak hobeto ulertzea, eta erreakzio-baldintzak eta entsegu-protokoloak optimizatzea. Parametro fisiko-kimiko osagarriak, hala nola pH, tenperatura eta biologikoak. Baliteke ur laginaren oxigeno-eskaera (BOD) ere neurtu behar izatea neurketaren zehaztasuna hobetzeko.
Ondorioz, kostu baxuko ENIG PCB sentsore elektrokimiko bat proposatzen dugu inguruneko (aintziko ura) laginetan birusak detektatzeko. Sentsibilitatea mantentzeko biltegiratze kriogenikoa behar duten oligonukleotido inmobilizatutako elektrodo edo substratu pertsonalizatuak ez bezala, sentikortasuna mantentzeko biltegiratze kriogenikoa behar duten53,54 gure teknikak aldatu gabeko PCB erabiltzen du. Iraupen luzeagoa eta biltegiratze-baldintza zehatzik ez duten elektrodoak eta, beraz, LMICetan zabaldutako laginaren prozesamendu automatizatua duten neurketa-soluzioen garapenerako egokiak. Biosentsoreak DNA-intercalating redox koloratzaile (MB) merkeak erabiltzen ditu xede-anplikoiak azkar detektatzeko. Anplifikazio ez-espezifikoa. ingurumen-laginetan ohikoa den sentsazio-metodo honen espezifikotasuna murrizten du MBak kate bakarreko eta bikoitzeko oligonukleotidoekiko lotura ez-espezifikoa duelako.Hori dela eta, proba honen espezifikotasuna abiarazteen eta PCR erreakzio-baldintzen optimizazioaren araberakoa da.Horrez gain, CV-a. eta probatutako laginetatik lortutako DPV gailurreko korronteak kontrol negatibotik (NTC) lortutako erantzunekin alderatuta interpretatu behar dira proba bakoitzerako. Lan honetan aurkezten diren sentsore elektrokimikoen diseinuak eta metodoak laginketa automatikoekin integra daitezke, guztiz automatizatu eta baxua garatzeko. -Laginak bildu eta aztertu eta emaitzak laborategira haririk gabe helarazi ditzakeen kostu-soluzioa.
Cashdollar, J. & Wymer, L. Ur laginetako birusen hasierako kontzentraziorako metodoak: azken ikerketen berrikuspena eta meta-analisia.J.Aplikazioa.mikroorganismoa.115, 1-11 or. (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL Waterborne viruses: Barriers to safe drinking water.PLoS Pathogens.11, E1004867 (2015).
Shrestha, S. et al.Wastewater epidemiology COVID-19-ren eskala handiko zaintza kostu-eraginkorra lortzeko errenta baxuko eta ertaineko herrialdeetan: erronkak eta aukerak.Water 13, 2897 (2021).
Palecek, E. & Bartosik, M. Nucleic acid electrochemistry.Chemical.Rev.112, 3427–3481 (2012).
Tani, A., Thomson, AJ & Butt, JN Metileno urdina urrezko substratuetan inmobilizatutako kate bakarreko eta bikoitzeko oligonukleotidoen diskriminatzaile elektrokimiko gisa.Analyst 126, 1756–1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ Katioi eta anioien arteko konparaketa, DNAren hibridazioaren transdukzio elektrokimikorako distantzia luzeko elektroien transferentziaren bidez.Electrochemistry.comminicate.6, 648–654 (2004).
Wong, EL & Gooding, JJ Karga-transferentzia DNAren bidez: ADN elektrokimiko selektiboa biosentsor.anus.Chemical.78, 2138–2144 (2006).
Fang, TH et al.Real-time PCR mikrofluidic device with concurrent elektrokimiko detekzioarekin.biological sentsor.Bioelectronics.24, 2131–2136 (2009).
Win, BY et al.Metileno urdinak DNArekin duen elkarrekintzan oinarritutako denbora errealeko PCR sistema elektrokimiko baten seinaleztapen-mekanismoaren azterketa eta errendimendua egiaztatzea.Analyst 136, 1573–1579 (2011).
Ramirez-Chavarria, RG et al.Loop bidezko anplifikazio isotermikoan oinarritutako sentsore elektrokimikoa sars-cov-2 detektatzeko hondakin-ur laginetan.J.Environment.Chemical.Britain.10, 107488 (2022).
Kumar, M. et al. SARS-CoV-2 anplikoien sentsazio elektrokimikoa PCB elektrodoekin. Sentsorea aktibatuta dago.B Chemistry.343, 130169 (2021).
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. & Yoshida, H. SARS-CoV-2 RNAren detekzio eraginkorra wastewater.science.general environment.763, 144587 (2021) frakzio solidoan.
Alygizakis, N. et al.Analytical Methods for SARS-CoV-2 Detection in Wastewater: Protocol and Future Perspectives.TraC trending anal.Chemical.134, 116125 (2020).
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. & Kashtan, N. Survival of the enveloped bacteriophage Phi6 (SARS-CoV-2-ren ordezkoa) kristalezko gainazaletan metatutako listu tanta lurrunduetan.zientzia.Errep.10, 1–10 (2020).
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ SARS-CoV-2 ordezko baten ingurumen-iraunkortasuna (Phi6) bizi askeko ameba batean.J.Uraren Osasuna 20, 83 (2021).
Mindich, L. Kate bikoitzeko RNA bakteriofagoaren hiru zati genomikoen ontziketa zehatza\(\varphi\)6.microorganism.Moore.biology.Rev.63, 149–160 (1999).
Pirttimaa, MJ & Bamford, DH RNA phage\(\varphi\)6 packaging region.RNA 6, 880–889 (2000).
Bonilla, N. et al.Phages on the Tap - Bakteriofagoen laborategiko stockak prestatzeko protokolo azkarra eta eraginkorra.PeerJ 4, e2261 (2016).
Argitalpenaren ordua: 2022-05-27