Täname, et külastasite veebisaiti Nature.com. Teie kasutatav brauseri versioon toetab CSS-i piiratud ulatuses. Parima kasutuskogemuse tagamiseks soovitame teil kasutada värskendatud brauserit (või Internet Exploreris ühilduvusrežiim välja lülitada). Seni aga veenduge, et jätkuvat tuge, kuvame saidi ilma stiilide ja JavaScriptita.
Keskkonnaproovide seire olulisust on COVID-19 pandeemia algusest saadik kõrgelt hinnatud ja mõningaid seiretegevusi tehakse kuldstandardi abil, kuigi qPCR-põhised tehnikad on kallid. Elektrokeemilised DNA biosensorid võivad olla potentsiaalselt kulutõhusad lahendus keskkonna veeproovide seireks madala ja keskmise sissetulekuga riikides. Selles töös demonstreerime amplikonide elektrokeemilist tuvastamist, mis on saadud Phi6 faagist, mis on eraldatud teravdatud järveveeproovidest (SARS-CoV-2 populaarne surrogaat), kasutades ENIG-i. PCB elektroodide komplekteerimiseks ilma pinda muutmata.elektrokeemilise anduri vastust iseloomustati põhjalikult kahe erineva pikkusega DNA fragmendi (\({117}\,\hbox {bp}\) ja \({503}\,\hbox {bp}\)) puhul ning PCR põhisegude soolade mõju metüleensinise (MB)-DNA interaktsioonidele.Meie tulemused näitavad, et DNA fragmentide pikkus määrab oluliselt elektrokeemilise tundlikkuse ja näitavad selles töös, et võime tuvastada pikki amplikone ilma PCR-produktide geelpuhastuseta on oluline veeproovide in situ mõõtmiseks.Täisautomaatne lahendus viiruskoormuse jaoks ennustab head.
Vee kaudu leviv viirus on rahvatervisele ohtlik alates 1940. aastatest ning esimesed tõendid lastehalvatuse ja hepatiidi E1 leviku vee kaudu. Maailma Terviseorganisatsioon (WHO) on klassifitseerinud mitu vee kaudu levivat mõõdukat kuni kõrget tervisele ohtlikku viiruspatogeeni2. Traditsiooniline viirus. tuvastamismeetodid põhinevad kullastandarditel qPCR-l põhinevatel tehnikatel, mis on väga tundlikud ja spetsiifilised, kuid nõuavad kvalifitseeritud töötajaid kallite instrumentide abil laboris testimiseks. Piiratud ressurssidega madala ja keskmise sissetulekuga riikides (LMIC) on aga inimressurss proovide testimine on tõenäoliselt ülimuslik keskkonnaveeproovide seire suhtes. Seetõttu on madala ja keskmise sissetulekuga riikides vee- ja reoveeproovide jätkusuutlikuks reaalajas jälgimiseks vaja alternatiivseid odavaid meetodeid, mis hoiatavad varajase haiguspuhangute eest. kaitstes neid sellega viiruse pandeemia tõsiste sotsiaalmajanduslike mõjude eest.Madala hinnaga elektrokeemilised biosensorid nukleiinhapete jaoks võivad pakkuda sellele rahuldamata vajadusele paljutõotavat lahendust. Paljud neist DNA biosensoritest töötavad seetõttu, et komplementaarsed DNA ahelad on elektroodile immobiliseeritud pinnale ja hübridiseeruda, kui proovis on sobiv järjestus. Seda saab seejärel muuta signaaliks erinevate elektrokeemiliste tehnikate abil, kasutades redoksmediaatoreid, nagu kaaliumraud/ferrotsüaniid. Metüleensinine (MB) on üks sellistest redoksaktiivsetest molekulidest, millel on on teatatud, et see interkaleerub kaheahelaliseks DNA-ks (dsDNA) lisaks mittespetsiifilisemale seondumisele üheahelalise DNA-ga5,6. MB-de interkaleeruv iseloom MB-DNA komplekside moodustamiseks muudab need populaarseks valiku redoks-mediaatoritena mitmes elektrokeemilises DNA-s andurite konfiguratsioonid5,6,7,8,9.Kuigi MB interkalatsioon DNA-sse on mittespetsiifiline ja selle elektrokeemilise anduri spetsiifilisus sõltub suuresti PCR-is või isotermilises amplifikatsioonis kasutatavate praimerite puhtusest, sobib see hästi reaalseks rakendamiseks. -ajaline elektrokeemiline qPCR või fluorestsentsisotermiline amplifikatsioon alternatiivina DNA kontsentratsiooni mõõtmisele 9. Ühes sellises teostuses Won jt. Kuldelektroodide pinda modifitseeriti reaalajas 6-merkapto-1-heksanooliga (MCH). PCR-i amplikonide mõõtmine MB-ga diferentsiaalimpulss-voltameetria (DPV) abil9.Teistel juhtudel Ramirez jt.SARS-CoV-2 tuvastamine reovees RT-LAMP-reaktsiooni abil, kasutades MB-d siiditrükiga elektroodidega.Plaatinaelektroodid on samuti kasutatud. kasutatakse in situ elektroodidena mikrofluidilises PCR-platvormis, mis on loodud amplikonide elektrokeemiliseks tuvastamiseks reaktsioonide ajal 8 . Kõik need uuringud nõuavad elektroodide pinna modifitseerimist, mis tähendab suurenenud tootmis- ja tegevuskulusid, mis on tingitud nende funktsionaliseeritud elektroodide stabiilsuse säilitamise erinõuetest.
Järveveeproovides kontsentreeritud viirusosakestest saadud amplikonide elektrokeemilise tuvastamise töövoo skeem.
Hiljuti demonstreerisime SARS-CoV-2 amplikonide elektrokeemilist tuvastamist odavate trükkplaadi (PCB) elektroodidega, mis põhinevad DPV-l ja tsüklilisel voltamperomeetrial (CV), mis on põhjustatud MB-DNA komplekside adsorptsioonist modifitseerimata elektroodide pinnal. praegune11.Teatame, et pikemad DNA fragmendid (N1-N2, \({943}\, \hbox), mis moodustati CDC soovitatud N1 päri- ja N2 pöördpraimerite abil võrreldes lühemate fragmentidega {bp}\)) näitasid sensori vastuses paremat lineaarsust (N1, \(72\,\hbox {bp}\)), mis on moodustatud N1 päri- ja N1 tagurpidi praimerite komplektidega. Nende uuringute kohta on kasutatud nukleaasivabas vees valmistatud DNA lahjendusi. Platvormi kasutati ka SARS-CoV tuvastamiseks. -2 amplikonit simuleeritud reoveeproovides (saadud kogu RNA proovide lisamisel SARS-CoV-2 RNA-ga). Kuna RNA on isoleerimise ja allavoolu töötlemise ajal vastuvõtlik nihkele,12,13 on selle heterogeense prooviga raske amplifitseerida pikemaid fragmente. Seetõttu piirdub SARS-CoV-2 amplikoni elektrokeemilise tuvastamise demonstreerimine reovees lühema \(72\,\hbox {bp}\) N1 fragmendiga.
Selles töös uurisime järveveeproovidest kontsentreeritud ja eraldatud faagi Phi6 (joonis 1) ENIG PCB-põhise elektrokeemilise tuvastamise teostatavust (joonis 1). Phi6 faagid on suuruselt (80-100 nm) võrreldavad SARS-CoV-2 ja neil on ka lipiidmembraan ja spike-valk. Nendel põhjustel on bakteriofaag Phi6 populaarne SARS-CoV-2 ja teiste ümbrisega patogeensete RNA viiruste surrogaat14,15. Faagiosakestest eraldatud RNA-d kasutati cDNA sünteesi matriitsina, millele järgnes PCR, et saada kaks 117 ja 503 aluspaari pikkust DNA fragmenti. Võttes arvesse \(943\,\hbox {bp}\) N1-N2 fragmentide amplifitseerimise väljakutset meie eelmises töös, sihime keskmise pikkusega fragmente (\(117) \,\hbox {bp}\) ja \(503 \,\hbox {bp}\)), mis põhinevad saadaolevatel praimeritel. Elektrokeemilise anduri vastust uuriti süstemaatiliselt laias kontsentratsioonivahemikus (\({10}\,{ \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) kuni \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) Mõlema fragmendi jaoks MB olemasolu, soola mõju anduri reaktsioonile on iseloomustatud ja ristvalideeritud spektrofotomeetriliste mõõtmistega. Selle töö peamised panused on järgmised:
DNA fragmendi pikkus ja soola olemasolu proovis mõjutavad tugevalt tundlikkust.Meie tulemused näitavad, et elektrokeemiline aktiivsus sõltub MB, DNA ja anduri interaktsiooni erinevatest mehhanismidest voltammeetrilises vastuses, sõltuvalt DNA kontsentratsioonist ja pikkusest, pikemate fragmentide tundlikkus on suurem, kuigi soolal on negatiivne mõju elektrostaatilistele interaktsioonidele MB ja DNA.
DNA kontsentratsioon määrab MB-DNA interaktsiooni mehhanismi modifitseerimata elektroodides Näitame, et MB-DNA interaktsiooni erinevad mehhanismid sõltuvad DNA kontsentratsioonist. DNA kontsentratsioonidel, mis on väiksemad kui \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), täheldasime, et elektrokeemilise voolureaktsiooni määras peamiselt MB-DNA adsorptsioon elektroodil, samas kui madalamate kontsentratsioonide korral suure DNA kontsentratsiooni korral määras elektrokeemilise voolureaktsiooni redoks-reduktsiooni steeriline inhibeerimine. aktiivsus, mis on tingitud MB sisestamisest DNA aluspaaride vahele.
ENIG PCB-põhine viiruslike nukleiinhapete elektrokeemiline tuvastamine järveveeproovides Vaatlused kinnitati Phi6-ga lisatud \(503\,\hbox {bp}\) DNA fragmentide elektrokeemilise tuvastamisega, mis saadi Powai järvest, IIT Mumbai ülikoolilinnakust. Tulemusfaag.
Madalad juurutamiskulud ja potentsiaal integreerimiseks täisautomaatsetesse seiresüsteemidesse, oligonukleotiididesse või elektroodide aptameeridesse, millel on pikem säilivusaeg.
Phi6 faag on Cytoviridae perekonda kuuluv ümbrisega dsRNA viirus, mis nakatab Pseudomonas syringae. Phi6 faagi genoom eksisteerib kolme fragmendina: S (\(2.95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4.07) \,\hbox {Kb}\)) ja L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\))16,17. Kuna Phi6 faag nakatab mittepatogeenset BSL-1 Pseudomonase tüve, on selle kasutamine ohutu ja seda saab hõlpsasti laboris kasvatada.Faag Phi6 ja selle peremeesorganism Pseudomonas syringae osteti Kanada Lavali ülikooli Felix d'Herelle'i bakteriviiruste tugikeskusest (teatekeskuse katalooginumbrid on vastavalt HER-102 ja HER-1102) Phi6 faag ja selle peremees taaselustati vastavalt võrdluskeskuse juhistele. Phi6 faag puhastati plaadilüüsi ja elueerimisega, et saada lõplikud tiitrid \(\umbes 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { ml}}\) (naastu moodustavad ühikud/ milliliitrid). RNA eraldati puhastatud faagiosakestest, kasutades GenElute™ Universal Total RNA Purification Kit (Sigma-Aldrich) vastavalt tootja juhistele. Lühidalt, puhastatud faagi Phi6 suspensioon\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) lüüsiti ja lüsaat laaditi tsentrifuugimiskolonni, et võimaldada RNA-l seonduda vaigukolonniga. Seejärel elueeritakse RNA elueerimislahuses \({ 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) komplektis. Hinnake RNA kontsentratsiooni neeldumise järgi \(260\,\hbox {nm}\). RNA-d säilitati alikvootidena \ ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) kuni edasise kasutamiseni.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) iScripti cDNA sünteesikomplekt (Bio -Rad Laboratories) kasutati cDNA sünteesi mallina, järgides tootja juhiseid. Lühidalt, cDNA sünteesireaktsioon koosneb kolmest etapist: praimimine \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min} }\) , \({20}\,{\hbox {min}}\) pöördtranskriptsioon asukohas \({46}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) ja tagurpidi Salvesti on \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) jaoks \({1}\,{\hbox {min }}\). 1% agaroosgeelil töötamisel näitas cDNA kolm riba, mis vastasid eeldatavale kolmele RNA fragmendile (andmeid pole näidatud). Kahe 117 ja 503 bp pikkuse DNA fragmendi amplifitseerimiseks kasutati järgmisi praimereid. cDNA kasutamine PCR mallina miniPCR® mini8 termotsükleris:
\(117\,\hbox {bp}\) ja \(503\,\hbox {bp}\) praimerid vastavad vastavalt happele M-segmendi 1476-1575 nukleotiidile ja L-segmendi 458-943 nukleotiidile. Kõik amplifitseeritud PCR produktid elektroforeesiti 1% agaroosgeelidel ja amplifitseeritud sihtmärk-DNA puhastati GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Fisher Scientific) abil.
Faagiosakeste lisamiseks kasutati IIT Mumbai ülikoolilinnaku järve (Powai Lake, Powai, Mumbai). Järve vesi filtreeriti eemaldamiseks läbi \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) membraani. hõljuvad osakesed ja seejärel lisati Phi6 faag. Lisage \({1}\,{\hbox {ml}}\) / (10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} \) \( {100}\ ,{\hbox {ml}}\) filtreeritud järvevette, \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\). Väike alikvoot oli reserveeritud viiruskoormuse mõõtmiseks naastude analüüsiga. Testisime kaht erinevat meetodit teravdatud Phi6 viiruseosakeste kontsentreerimiseks: (1) alumiiniumhüdroksiidi adsorptsiooni-sadestamise meetodit,19 mis on valideeritud mitmete ümbrisega RNA viiruse kontsentratsiooni jaoks keskkonnaproovidest, ja (2) ) Polüetüleenglükoolil (PEG) põhinev viiruse kontsentreerimise meetod kohandati Flood et al.20 .Kuna leiti, et PEG-põhise meetodi taaskasutamise efektiivsus on parem kui alumiiniumhüdroksiidi meetodil, kasutati PEG-põhist meetodit Phi6 osakeste kontsentreerimiseks järveveeproovidest.
Kasutatud PEG-meetod oli järgmine: Phi6-kõrgusega järveveeproovidele lisati PEG 8000 ja \(\hbox {NaCl}\), et saada 8% PEG 8000 ja \(0,2\,\hbox {M} \) \( \ hbox {NaCl}\).Proove inkubeeriti loksutis\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), seejärel tsentrifuugitakse \(4700 \,\hbox {g}\) on \({45}\,{\hbox {min}}\). Supernatant visake ära ja suspendeerige pellet uuesti \({1}\, {\hbox {ml}}\) samas supernatandis. Kõik spiking- ja viirusekontsentratsiooni katsed viidi läbi kolmes eksemplaris. Pärast kontsentreerimist reserveeriti väike alikvoot taastumise efektiivsuse mõõtmiseks naastude analüüsiga. RNA eraldati eelnevalt kirjeldatud viisil ja elueeriti komplektiga kaasasolevas elueerimispuhvris\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\). Kuna RNA kontsentratsioon on prooviti erinev kolmes eksemplaris, siis \({2}\,{\upmu \ hbox {l}}\) RNA-d kasutatakse kõigi kolme jaoks, olenemata selle kontsentratsioonist. Proovide cDNA süntees.cDNA süntees viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud.\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNA kasutati mallina \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR jaoks 35 tsükli jaoks, et võimendada \ (117\,\hbox {bp}\) ja \(503\,\hbox { bp}\) fragmendid. Need proovid on esitatud kui "1:1", st ilma lahjendamiseta. Negatiivse kontrollina seadistati matriitsita kontroll (NTC), samas kui puhastatud faagist eraldatud RNA abil sünteesitud cDNA positiivse kontrolli (PC) mallina. Kvantitatiivne PCR (qPCR) viidi läbi Stratagene Mx3000P RT-PCR seadmega, kasutades Brilliant III ülikiire SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies). Reaktsioonid seadistati kolmes eksemplaris nagu varem. Kõikide proovide jaoks registreeriti tsükli lävi (Ct). Lisaks tehti lahjendatud proovid \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\), kasutades filtreeritud järvevees 1:100 lahjendatud cDNA-d. \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR 35 tsükli jaoks. Need proovid on esitatud kui "1:100".
PCB-elektroodide valmistamisel kasutatakse kaubanduslikult saadavat odavat elektroodide nikkelkümbluskulla (ENIG) protsessi, ilma et oleks vaja täiendavat kullakatmist.ENIG-i PCB-elektroodide spetsifikatsioonid on üksikasjalikult kirjeldatud meie eelmises töös11.ENIG-i PCB-elektroodide puhul kasutatakse traditsioonilisi elektroodide puhastusmeetodeid, nagu näiteks piraaja lahust või väävelhappe tsüklilist voltamperomeetriat ei soovitata, kuna need võivad põhjustada õhukese kullakihi (paksus \(\umbes\) \(100\,\hbox {nm }\) koorumist ja paljastada all olevad vasekihid, mis on altid. korrosioonile 21, 22, 23, 24, 25. Seetõttu puhastage elektroodid IPA-s niisutatud ebemevaba lapiga. Testitavat proovi inkubeeriti \({50}\,{\upmu \hbox {M} }\) MB kaustas \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) hõlpsaks sisestamiseks. Meie eelmises töös , täheldasime, et anduri tundlikkust ja lineaarsust parandati MB kontsentratsiooni suurendamisega 11 . Varasemas töös kirjeldatud optimeerimiste põhjal kasutasime \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB kontsentratsioonid DNA manustamiseks selles uuringus.Kaheahelalise DNA (ds-DNA) elektrokeemilist tuvastamist saab saavutada anioonsete või katioonsete interkalaatorite abil.Kuigi anioonsed interkalaatorid tuvastavad DNA parema selektiivsusega, vajavad nad üleöö inkubeerimist, mille tulemuseks on pikem tuvastamisaeg. teisest küljest vajavad katioonsed interkalaatorid, nagu MB, lühemat inkubatsiooniaega, ligikaudu \({1}\,{\hbox {h}}\) ds-DNA6 elektrokeemiliseks tuvastamiseks. Iga mõõtmine hõlmab testitava proovi väljastamist. elektrood\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), seejärel puhastage IPA-ga niisutatud lapiga, enne kui jätkate teise prooviga.üks mõõtmine.Iga proovi testiti viiel erineval elektroodil, kui pole öeldud teisiti.DPV ja CV mõõtmised viidi läbi PalmSens Sensit Smart potentiostaadi abil ning PSTrace'i tarkvara kasutati potentsiostaadi konfigureerimiseks ja andmete hankimiseks, sealhulgas tippvoolu arvutamiseks.Kasutatakse järgmisi sätteid. DPV ja CV mõõtmiseks:
DPV: tasakaaluaeg = \(8\,\hbox {s}\), pinge samm = \(3\,\hbox {mV}\), impulsi pinge = \(25\,\hbox {mV}\) , impulsi kestus = \(50\,\hbox {ms}\), skannimissagedus = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: tasakaaluaeg = \(8\,\hbox {s}\), pinge samm = \(3\,\hbox {mV}\), pühkimiskiirus = \({300}\,\hbox {mV/s }\)
Tippvoolud, mis on saadud \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB-ga komplekseeritud DNA voltammogrammidest: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
DPV ja CV voltammogrammid saadi DNA-ga komplekseeritud ENIG PCB elektroodidel \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB (kontsentratsioonidel 10–\({20}\,{\ hbox {ng) }/{\upmu \hbox {l}}}\) st 0,13–\({0,26}\,{\upmu \hbox {M}}\) \(117\,\hbox {bp}\ ) jaoks ja 0,03 –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) \(503\,\hbox {bp}\) jaoks). Tüüpilised voltammogrammid on näidatud lisateabe joonisel S1. Joonisel 2 on näidatud tulemused. DPV ja CV mõõtmistest (tippvool), kasutades geelpuhastatud PCR tooteid. Võrreldes CV mõõtmistega näitavad DPV mõõtmised suuremat tundlikkust (vool DNA kontsentratsiooni funktsioonina), kuna CV mõõtmiste taustvoolud peidavad Faradaic voolusid 26 .Andmed iga kast sisaldab 5 elektroodi mõõtmisi. Kõigil mõõtmistel kasutatakse sama elektroodide komplekti, et vältida elektroodidevahelisest erinevusest tingitud mõõtmisvigu. Täheldasime madalamate DNA kontsentratsioonide korral DPV ja CV mõõdetud tippvoolude suurenemist. , pikem (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ võrreldes \(117) ) fragmendiga. See on kooskõlas meie eelmises töös kirjeldatud elektroodide adsorptsiooni eeldatava suundumusega. MB-DNA kompleksi adsorptsioon hõlbustab laengu ülekandmist elektroodil, mis aitab kaasa tippvoolu suurenemisele.Teised uuringud on näidanud oligonukleotiidi suuruse ja järjestuse mõju MB-DNA interkalatsioonile27,28,29,30.Guaniin -tsütosiini (GC) sisaldus kahes amplikonis (\(117\,\hbox {bp}\) ja \(503\,\hbox {bp}\)) oli ligikaudu 50%, mis näitab, et vaatlus Erinevus on tingitud amplikoni pikkusele. Suuremate DNA kontsentratsioonide jaoks (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), \(503\,\hbox {bp} \) ja \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) jaoks \(117\,\hbox {bp}\)), täheldame kahte võimendust. alamvoolude tippvoolud vähenevad nii DPV kui ka CV mõõtmisel. Seda seetõttu, et MB küllastub ja interkaleerub DNA aluspaaride vahel, mille tulemuseks on MB31,32 redutseeritava rühma redoksaktiivsuse steeriline inhibeerimine.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
PCR põhisegudes sisalduvad soolad häirivad elektrostaatilisi interaktsioone MB ja DNA vahel, nii et lisades \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) koos \({50} \,{\ upmu \hbox {M}}\) MB geeliga puhastatud toode, et uurida soola mõju MB-DNA interaktsioonile. Nagu on näidatud joonisel 3, täheldasime, et suuremate DNA kontsentratsioonide korral (\(>{2}\,{\) hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) ja \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) jaoks \(117\,\hbox {bp} \)), DPV-s ja CV-s Soola lisamine ei mõjutanud oluliselt mõõtmisi (vt lisateabe joonist S2 tüüpiliste voltammogrammide kohta). madalama DNA kontsentratsiooni korral vähendab soola lisamine oluliselt tundlikkust, mistõttu ei muutu voolus oluliselt DNA kontsentratsiooniga.Sola sarnaseid negatiivseid mõjusid MB-DNA interaktsioonidele ja interkalatsioonile on varem teatanud ka teised teadlased33,34.\(\hbox { Mg}^{2+}\) katioonid seonduvad DNA negatiivse fosfaatkarkassiga, takistades seeläbi MB ja DNA vahelist elektrostaatilist interaktsiooni. Suuremate DNA kontsentratsioonide korral põhjustab redoksaktiivsete MB-de steeriline inhibeerimine madalamaid tippvoolusid, seega elektrostaatilised vastasmõjud. ei mõjuta oluliselt anduri vastust. Peamine on see, et see biosensor sobib paremini kõrgemate DNA kontsentratsioonide tuvastamiseks (harva \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) või rohkem), keskkonna veeproovide täisautomaatseks töötlemiseks, kus PCR-toodete geelpuhastus ei pruugi olla teostatav.
Neeldumiskõvera alune pindala lainepikkuste vahemikus 600–700 \(\hbox {nm}\) \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) kompleksis oleva DNA erinevate kontsentratsioonide korral MB: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) soolaga ja ilma (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) soolaga ja ilma (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) DNA kontsentratsioonid, mis vastavad \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB proovidele DNA puudub.
Ülaltoodud tulemuste täiendavaks kontrollimiseks teostasime UV/Vis spektrofotomeetriga (Thermo Scientific Multiskan GO) optilised mõõtmised, mille puhul kasutati proove \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\). Mõõtmine. Neeldumissignatuur väheneb DNA kontsentratsiooni suurenedes, nagu on näha neeldumiskõvera aluse ala trendist lainepikkuste vahemikus \(600\,\hbox {nm}\) kuni \(700\,\hbox { nm}\) , nagu on näidatud joonisel 4 (neeldumisspekter on näidatud täiendava teabe joonisel S3). Proovide puhul, mille DNA kontsentratsioon on väiksem kui \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), DNA-d sisaldavate ja ainult MB-d sisaldavate proovide (\(503\,\hbox {bp}\) ja \(117\,\hbox {bp}\) omastamises ei olnud olulist erinevust ) pikkusega fragmendid), mis viitab redoksaktiivse MB steerilise inhibeerimise puudumisele. Suuremate DNA kontsentratsioonide korral täheldasime neeldumissignaali järkjärgulist vähenemist ja soola juuresolekul neeldumise väiksemat langust.Need tulemused omistati molekulaarsele interaktsioonid ja steeriline inhibeerimine DNA hübriidide aluste virnastamisega. Meie tulemused on kooskõlas kirjanduses avaldatud aruannetega MB-DNA interkalatsiooni spektroskoopiliste uuringute kohta, mis seostavad hüpokromaatilisust vähenenud energiatasemega vahemikus \(\pi\)–\(\pi ^*\ ) interkalatsioonist tingitud elektroonilised üleminekud Kihid 36, 37, 38.
Faagi Phi6 agaroosgeelelektroforees: PCR produktid pikkusega \(117\,\hbox {bp}\) ja \(503\,\hbox {bp}\) järve veeproovidest.M-DNA marker;NTC-matriitsita kontroll, vastavaid amplikone sisaldavad praimerid;PC positiivne kontroll;1, 2, 3-lahjendamata (1:1) teravdatud järvevee proovid kolmes eksemplaris. Vööt on nähtav \(\umbes 50\,\hbox {bp}\) \(503\,\) kasutamata oligonukleotiidide tõttu. hbox {bp}\) rada.
Hindasime anduri kasulikkust, kasutades Phi6 faagiga rikastatud Powai järve veeproove. Faagirikastest veeproovidest eraldatud RNA kontsentratsioonid jäid vahemikku 15,8–\({19,4}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox { ml}}\), samas kui need, mis eraldati puhastatud faagisuspensioonidest. RNA oli hinnanguliselt \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) taastumise efektiivsusega ligikaudu 1 %.RNA pöördtranskribeeriti cDNA-ks ning kasutati PCR-i ja qPCR-i matriitsina. Toote suurus kinnitati enne anduriga testimist agaroosgeelelektroforeesiga (joonis 5). Neid proove ei ole geelpuhastatud ja seetõttu sisaldavad need kõiki PCR-i komponente. samuti huvipakkuvad amplikonid. Näidati, et qPCR-i käigus salvestatud Ct väärtused (tabel 1) korreleerusid vastavatest veeproovidest eraldatud RNA kontsentratsiooniga. Ct väärtus näitab tsüklite arvu, mis on vajalikud fluorestsentssignaali saamiseks ületada läve või taustsignaali. Kõrgemad Ct väärtused näitavad madalamat matriitsi kontsentratsiooni ja vastupidi. NTC proovide Ct väärtused olid ootuspäraselt kõrged. \(\ligikaudu 3\) Ct väärtuste erinevus positiivne kontroll ja uuritav proov näitavad lisaks, et igas uuritavas proovis on positiivse kontrolliga võrreldes ligikaudu 1% matriitsi. Oleme varem arutanud, et pikemad amplikonid toovad kaasa parema tundlikkuse. Heterogeensetest keskkonnaproovidest eraldatud pikemate fragmentide amplifitseerimine on ebasoodsate kohtade tõttu keeruline. viiruse madala kontsentratsiooni ja RNA lagunemise tõttu. Kuid meie viiruse rikastamise ja PCR amplifitseerimisprotokolli abil suutsime edukalt amplifitseerida \(503\,\hbox {bp}\) fragmenti elektrokeemiliseks tuvastamiseks.
Joonisel 6 on näidatud \(503\,\hbox {bp}\) fragmendi amplikoni elektrokeemilised anduri tulemused, kasutades nii lahjendamata cDNA-d matriitsina (1:1) kui ka 100-kordselt lahjendatud cDNA-d matriitsina (1:100), teostatud PCR. , võrreldes NTC ja PC-ga (vt joonist S4 täiendava teabe esinduslike voltammogrammide kohta). Joonisel fig 6 kujutatud kastdiagrammi iga kast sisaldab kolme proovi mõõtmisi 5 elektroodiga. Elektroodist tingitud vigade vältimiseks kasutati kõigi proovide mõõtmiseks samu elektroode. variatsioon elektroodi vahel. Võrreldes CV mõõtmistega näitavad DPV mõõtmised paremat eraldusvõimet, et eristada test- ja PC-näidiseid NTC-dest, sest nagu varem mainitud, on Faradaic voolud viimaste taustvoolude tõttu peidetud. Pikemate amplikonide puhul täheldasime, et negatiivne kontroll (NTC) andis positiivse kontrolliga võrreldes kõrgemad CV ja DPV tippvoolud, samas kui positiivsed ja lahjendamata proovid näitasid sarnaseid DPV tippvoolude kõrgusi. Mõõdetud keskmised ja mediaanväärtused iga lahjendamata kujul (1:1) ) testproovi ja PC saab selgelt eraldada NTC proovi anduri väljundist, samas kui 1:100 lahjendatud proovi eraldusvõime on vähem väljendunud. 100-kordse cDNA lahjenduse korral ei täheldanud me geelelektroforeesi ajal ühtegi riba (rajad pole näidatud joonisel 5) ning vastavad DPV ja CV tippvoolud olid sarnased NTC puhul eeldatutega. Fragmendi \(117\,\hbox {bp}\) tulemused on näidatud täiendavas teabes. kontroll kutsus esile PCB anduri elektrokeemilise reaktsiooni, mis on tingitud vaba MB adsorptsioonist elektroodil ja MB interaktsioonist üheahelalise praimeri oligonukleotiidiga. Seetõttu tuleb iga kord, kui proovi testitakse, läbi viia negatiivne kontroll ja uuritava proovi tippvool võrreldes negatiivse kontrolliga saadud tippvooluga, et saavutada diferentsiaalne (suhteline) mõõtmine39,40, et klassifitseerida uuritav proov positiivseks või negatiivseks.
(a) DPV ja (b) CV tippvool \(503\,\hbox {bp}\) fragmentide elektrokeemiliseks tuvastamiseks järveveeproovides. Katseproove mõõdeti kolmes eksemplaris ja võrreldi mallita kontrollidega (NTC) ja positiivsed kontrollid (PC).
Meie leiud illustreerivad erinevaid mehhanisme, mis mõjutavad erinevate DNA-de erineva pikkusega amplikonide elektrokeemiliste andurite jõudlust, kusjuures kontsentratsioone kontrolliti optiliste mõõtmistega UV/Vis spektrofotomeetriga. Meie tähelepanekud rõhutavad arusaama, et pikemad DNA fragmendid kuni \(\umbes\) \(500\,\hbox {bp}\) saab tuvastada suurema tundlikkusega ja et soola olemasolu proovis ei mõjuta Tundlikkus DNA kontsentratsioon, mis mõjutab suuremat tundlikkust (harva \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) ja eespool).Lisaks uurisime erinevat tüüpi proovide, sealhulgas geelpuhastatud amplikonide mõju soolalisandiga ja ilma ning järvevee proovide lisamist DPV ja CV mõõtmisel.Märkasime, et DPV andis parema eraldusvõime, kuna taustmahtuvusvool mõjutab ka CV mõõtmist, muutes selle vähem tundlikuks.
Pikemate fragmentide amplifitseerimine sõltub viiruse genoomse RNA terviklikkusest. Mitmed uuringud on näidanud, et pikemate fragmentide amplifitseerimine ei ole alati efektiivne RNA lagunemise tõttu keskkonnas ja splaissimise võimaluse tõttu isoleerimise ajal11, 41, 42, 43, 44 . Täheldasime, et PEG-põhine viiruse kontsentreerimise meetod oli järveveeproovides teravdatud faagi Phi-6 kontsentreerimisel tõhusam kui alumiiniumhüdroksiidil põhinev viiruse kontsentreerimise meetod. Pikkade DNA fragmentide tuvastamise võime ületas multipleksse PCR nõude. mitme lühema pikkusega malli võimendamiseks ja ristspetsiifilisuse võimaluse vähendamiseks.
Bioloogilisi proove on vähe, mistõttu on vaja kavandada biosensor, mille testimiseks on vaja minimaalselt proove. Selles uuringus kasutatud ENIG PCB elektroodid nõudsid ainult \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ ) proovid testimiseks, et katta elektroodide efektiivne ala. Lisaks saab sama elektroodi pärast puhastamist enne järgmise proovi väljastamist uuesti kasutada. Amplifitseeritud proovide puhul ei ole vaja lisada muid kemikaale peale metüleensinise, mis on odav. ja tavaliselt kasutatav kemikaal.Kuna iga elektroodi tootmine maksab umbes 0,55 dollarit (või 40 INR), võib see biosensor olla kulutõhus alternatiiv olemasolevatele tuvastamistehnoloogiatele. Tabelis 2 on toodud selle töö võrdlus teiste kirjanduses kirjeldatud anduritega. DNA fragmendid heterogeensetes proovides.
Arvestades, et MB-põhised elektrokeemilised tuvastamisprotokollid põhinevad PCR-i spetsiifilisusel, on selle meetodi peamiseks piiranguks võimalus mittespetsiifiliseks amplifikatsiooniks heterogeensetes proovides, nagu reovesi ja järvevesi, või madala puhtusastmega praimerite kasutamine. elektrokeemilised tuvastamismeetodid puhastamata PCR-produktide DNA tuvastamiseks modifitseerimata ENIG PCB elektroode kasutades, on vaja paremini mõista kasutamata dNTP-de ja praimerite tekitatud vigu ning optimeerida reaktsioonitingimusi ja analüüsiprotokolle. Täiendavad füüsikalis-keemilised parameetrid, nagu pH, temperatuur ja bioloogilised parameetrid. Mõõtmise täpsuse parandamiseks võib osutuda vajalikuks mõõta ka veeproovi hapnikutarbimist (BOD).
Kokkuvõtteks pakume välja odava elektrokeemilise ENIG PCB anduri viiruse tuvastamiseks keskkonna (järvevee) proovides. Erinevalt immobiliseeritud oligonukleotiidelektroodidest või kohandatud substraatidest DNA tuvastamiseks, mis nõuavad tundlikkuse säilitamiseks krüogeenset säilitamist53,54, kasutab meie tehnika modifitseerimata PCB-d. elektroodid, millel on pikem säilivusaeg ja puuduvad spetsiifilised säilitusnõuded ning sobivad seetõttu LMIC-des kasutatavate automatiseeritud proovitöötlusega mõõtmislahenduste väljatöötamiseks.Biosensor kasutab sihtamplikonide kiireks tuvastamiseks odavaid DNA-ga interkaleerivaid redoksvärve (MB). Mittespetsiifiline amplifikatsioon keskkonnaproovides tavaline, vähendab selle tuvastusmeetodi spetsiifilisust MB-de mittespetsiifilise seondumise tõttu ühe- ja kaheahelaliste oligonukleotiididega.Seetõttu sõltub selle testi spetsiifilisus praimerite optimeerimisest ja PCR reaktsioonitingimustest.Lisaks on CV testitud proovidest saadud ja DPV tippvoolusid tuleks tõlgendada iga testi puhul negatiivse kontrolli (NTC) vastuste suhtes. Käesolevas töös esitatud elektrokeemiliste andurite konstruktsioone ja meetodeid saab integreerida automaatse proovivõtturitega, et töötada välja täielikult automatiseeritud ja madal. - kululahendus, mis suudab proove koguda ja analüüsida ning tulemusi juhtmevabalt laborisse tagasi saata.
Cashdollar, J. & Wymer, L. Veeproovide viiruste esialgse kontsentreerimise meetodid: hiljutiste uuringute ülevaade ja metaanalüüs.J.Application.microorganism.115, lk 1-11 (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL Waterborne viruses: Barriers to safe drinking water.PLoS Pathogens.11, E1004867 (2015).
Shrestha, S. et al.Reovee epidemioloogia COVID-19 kuluefektiivseks laiaulatuslikuks seireks madala ja keskmise sissetulekuga riikides: väljakutsed ja võimalused.Water 13, 2897 (2021).
Palecek, E. & Bartosik, M. Nucleic acid electrochemistry.Chemical.Rev.112, 3427–3481 (2012).
Tani, A., Thomson, AJ & Butt, JN. Metüleensinine kui kullasubstraatidele immobiliseeritud ühe- ja kaheahelaliste oligonukleotiidide elektrokeemiline diskrimineerija. Analyst 126, 1756–1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ Katioonide ja anioonide interkalaatorite võrdlus DNA hübridiseerimise elektrokeemilise ülekande jaoks pikamaaelektronülekande abil.Electrochemistry.comminicate.6, 648–654 (2004).
Wong, EL & Gooding, JJ Laengu ülekanne DNA kaudu: selektiivne elektrokeemiline DNA biosensor.anus.Chemical.78, 2138–2144 (2006).
Fang, TH et al.Reaalajas PCR-mikrofluidiseade samaaegse elektrokeemilise tuvastamisega.bioloogiline andur.Bioelectronics.24, 2131–2136 (2009).
Win, BY jt. Metüleensinise ja DNA interaktsioonil põhineva elektrokeemilise reaalajas PCR-süsteemi signaalimismehhanismide uuring ja toimivuse kontrollimine. Analyst 136, 1573–1579 (2011).
Ramirez-Chavarria, RG jt.Loop-mediated isothermal amplification-based elektrokeemiline andur sars-cov-2 tuvastamiseks reoveeproovides.J.Environment.Chemical.Britain.10, 107488 (2022).
Kumar, M. et al.SARS-CoV-2 amplikonide elektrokeemiline tuvastamine PCB elektroodidega.Andur on aktiveeritud.B Chemistry.343, 130169 (2021).
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. & Yoshida, H. SARS-CoV-2 RNA tõhus tuvastamine reovee tahkes fraktsioonis.teadus.üldkeskkond.763, 144587 (2021).
Alygizakis, N. et al.Analüütilised meetodid SARS-CoV-2 tuvastamiseks reovees: protokoll ja tulevikuperspektiivid.TraC trending anal.Chemical.134, 116125 (2020).
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. & Kashtan, N. Survival of the enveloped bacteriophage Phi6 (a surrogate for SARS-CoV-2) in aurustunud süljepiiskad, mis on ladestunud klaaspindadele.science.Rep.10, 1–10 (2020).
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ SARS-CoV-2 surrogaadi (Phi6) keskkonnapüsivus vabalt elavas amööbas.J.Water Health 20, 83 (2021).
Mindich, L. Kaheahelalise RNA bakteriofaagi\(\varphi\)6.mikroorganismi kolme genoomse fragmendi täpne pakendamine.Moore.biology.Rev.63, 149-160 (1999).
Pirttimaa, MJ & Bamford, Secondary structure of the DH RNA phage\(\varphi\)6 package region.RNA 6, 880–889 (2000).
Bonilla, N. et al.Phages on the Tap – Kiire ja tõhus protokoll bakteriofaagide laborivarude valmistamiseks.PeerJ 4, e2261 (2016).
Postitusaeg: 27. mai-2022