Gracias por visitar Nature.com. La versión del navegador que está utilizando tiene soporte limitado para CSS. Para obtener la mejor experiencia, le recomendamos que utilice un navegador actualizado (o desactive el modo de compatibilidad en Internet Explorer). Mientras tanto, para asegurarse soporte continuo, mostraremos el sitio sin estilos y sin JavaScript.
La importancia de monitorear muestras ambientales ha sido muy apreciada desde el comienzo de la pandemia de COVID-19, y algunos esfuerzos de monitoreo se están realizando utilizando el estándar de oro, aunque las técnicas basadas en qPCR son costosas. Los biosensores electroquímicos de ADN podrían proporcionar una solución potencialmente rentable. solución para monitorear muestras de agua ambiental en países de bajos y medianos ingresos. En este trabajo, demostramos la detección electroquímica de amplicones obtenidos del fago Phi6 aislado de muestras de agua de lago enriquecidas (un sustituto popular para SARS-CoV-2), usando ENIG para completar electrodos de PCB sin modificar la superficie.sexo. La respuesta del sensor electroquímico se caracterizó a fondo para dos fragmentos de ADN de diferentes longitudes (\({117}\,\hbox {bp}\) y \({503}\,\hbox {bp}\)), y el efecto de las sales en las mezclas maestras de PCR en las interacciones de azul de metileno (MB)-ADN. importante para la medición in situ de muestras de agua.Una solución totalmente automatizada para la carga viral es un buen augurio.
La transmisión de virus a través del agua se conoce como un peligro para la salud pública desde la década de 1940, con la primera evidencia de transmisión de poliomielitis y hepatitis E1 a través del agua. La Organización Mundial de la Salud (OMS) ha clasificado varios patógenos virales a través del agua de importancia moderada a alta para la salud Los métodos de detección se basan en técnicas estándar basadas en qPCR, que son altamente sensibles y específicas, pero requieren personal calificado para realizar pruebas en el laboratorio con instrumentos costosos. Sin embargo, en países de ingresos bajos y medianos (LMIC) con recursos limitados, humanos Es probable que el análisis de muestras tenga prioridad sobre el monitoreo de muestras de agua ambiental. Por lo tanto, se necesitan métodos alternativos de bajo costo para el monitoreo sostenible y en tiempo real de muestras de agua y aguas residuales en países de bajos y medianos ingresos como advertencias tempranas de brotes de enfermedades emergentes. protegiéndolos así de los graves impactos socioeconómicos de la pandemia del virus. Los biosensores electroquímicos de bajo costo para ácidos nucleicos podrían proporcionar una solución potencial prometedora para esta necesidad insatisfecha. Muchos de estos biosensores de ADN funcionan por el hecho de que las hebras de ADN complementarias están inmovilizadas en el electrodo. emergen e hibridan cuando una secuencia coincidente está presente en la muestra. Esto se puede convertir en una señal mediante varias técnicas electroquímicas que utilizan mediadores redox como hierro/ferrocianuro de potasio. El azul de metileno (MB) es una de esas moléculas con actividad redox, que tiene Se ha informado que se intercalan en el ADN de doble cadena (dsDNA) además de su unión más inespecífica al ADN de una sola cadena. configuraciones de sensores5,6,7,8,9. Aunque la intercalación de MB con el ADN no es específica, y la especificidad de este sensor electroquímico depende en gran medida de la pureza de los cebadores utilizados para la PCR o la amplificación isotérmica, es muy adecuado para implementar qPCR basada en electroquímica en tiempo real o amplificación isotérmica de fluorescencia como alternativa a la medición de la concentración de ADN 9 . En una de esas implementaciones, Won et al. medición de amplicones de PCR con MB mediante voltamperometría de pulso diferencial (DPV)9. En otros casos, Ramírez et al. Detección de SARS-CoV-2 en aguas residuales mediante reacción RT-LAMP utilizando MB con electrodos serigrafiados. utilizados como electrodos in situ en una plataforma de PCR microfluídica diseñada para detectar amplicones electroquímicamente durante las reacciones 8 . Todos estos estudios requieren la modificación de la superficie de los electrodos, lo que implica mayores costos de producción y operación debido a los requisitos especiales de almacenamiento para la estabilidad de estos electrodos funcionalizados.
Esquema del flujo de trabajo para la detección electroquímica de amplicones obtenidos de partículas virales concentradas en muestras de agua del lago.
Recientemente demostramos la detección electroquímica de amplicones de SARS-CoV-2 con electrodos de placa de circuito impreso (PCB) de bajo costo basados en DPV y voltamperometría cíclica (CV) inducida por la adsorción de complejos MB-DNA en la superficie de electrodos no modificados) cambios en el pico actual11.Informamos que los fragmentos de ADN más largos (N1-N2, \({943}\, \hbox) formados con los cebadores N1 directo y N2 inverso recomendados por los CDC en comparación con los fragmentos más cortos {bp}\)) mostraron una mejor linealidad en la respuesta del sensor. ( N1, \(72\,\hbox {bp}\)) formado usando conjuntos de cebadores N1 directos y N1 inversos. Estos estudios se informan usando diluciones de ADN preparadas en agua libre de nucleasas. La plataforma también se usó para detectar SARS-CoV -2 amplicones en muestras de aguas residuales simuladas (obtenidas al añadir ARN del SARS-CoV-2 a muestras de ARN total). Dado que el ARN es susceptible de fragmentarse durante el aislamiento y el procesamiento posterior,12,13 es difícil amplificar fragmentos más largos con esta muestra heterogénea. Por lo tanto, la demostración de la detección electroquímica del amplicón del SARS-CoV-2 en las aguas residuales se limita al fragmento \(72\,\hbox {bp}\) N1 más corto.
En este trabajo, investigamos la viabilidad de la detección electroquímica basada en PCB ENIG del fago Phi6 concentrado y aislado de muestras de agua del lago (Fig. 1). Los fagos Phi6 son comparables en tamaño (80-100 nm) al SARS-CoV-2 y también tienen una membrana lipídica y una proteína espiga. Por estas razones, el bacteriófago Phi6 es un sustituto popular del SARS-CoV-2 y otros virus de ARN patógenos envueltos14,15. El ARN aislado de partículas de fago se usó como plantilla para la síntesis de ADNc seguido de PCR para obtener dos fragmentos de ADN de 117 y 503 pares de bases de longitud. Dado el desafío de amplificar \(943\,\hbox {bp}\) fragmentos N1-N2 en nuestro trabajo anterior, buscamos fragmentos de longitud intermedia (\(117 \,\hbox {bp}\) y \(503 \,\hbox {bp}\)), basados en cebadores disponibles. La respuesta del sensor electroquímico se estudió sistemáticamente en un amplio rango de concentración (\({10}\,{ \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) a \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) para ambos fragmentos en la presencia de MB, el efecto de la sal en la respuesta del sensor se ha caracterizado y validado de forma cruzada mediante mediciones espectrofotométricas. Las principales contribuciones de este trabajo son las siguientes:
La longitud del fragmento de ADN y la presencia de sal en la muestra afectan fuertemente la sensibilidad.Nuestros resultados muestran que la actividad electroquímica depende de diferentes mecanismos de interacción de MB, ADN y el sensor en la respuesta voltamperométrica, dependiendo de la concentración y longitud del ADN, con fragmentos más largos muestran mayor sensibilidad, aunque la sal tiene un efecto negativo en las interacciones electrostáticas entre MB y ADN.
La concentración de ADN determina el mecanismo de interacción MB-ADN en electrodos no modificados. Demostramos que diferentes mecanismos de interacción MB-ADN dependen de la concentración de ADN. A concentraciones de ADN por debajo de una pequeña cantidad de \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), observamos que la respuesta de corriente electroquímica estuvo determinada principalmente por la adsorción de MB-DNA en el electrodo, mientras que a concentraciones más bajas A concentraciones altas de ADN, la respuesta de corriente electroquímica estuvo determinada por la inhibición estérica de redox actividad debido a la inserción de MB entre pares de bases de ADN.
ENIG Detección electroquímica basada en PCB de ácidos nucleicos virales en muestras de agua de lago Resultado fago.
Bajo costo de implementación y potencial de integración en sistemas de monitoreo totalmente automatizados, oligonucleótidos o aptámeros en electrodos con mayor vida útil.
El fago Phi6 es un virus dsRNA envuelto de la familia Cytoviridae que infecta a Pseudomonas syringae. El genoma del fago Phi6 existe en forma de 3 fragmentos: S (\(2.95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4.07 \,\hbox {Kb}\)) y L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\))16,17. Dado que el fago Phi6 infecta una cepa BSL-1 de Pseudomonas no patógena, su uso es seguro y se puede cultivar fácilmente en el laboratorio. El fago Phi6 y su huésped Pseudomonas syringae se adquirieron en el Centro de referencia Felix d'Herelle para virus bacterianos, Universidad Laval, Canadá (los números de catálogo del centro de referencia son HER-102 y HER-1102, respectivamente) El fago Phi6 y su huésped se revivieron según las indicaciones del centro de referencia. El fago Phi6 se purificó mediante lisis en placa y elución para obtener títulos finales con \(\about 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { ml}}\) (unidades formadoras de placa/mililitros). El ARN se aisló de partículas de fago purificadas utilizando el kit de purificación de ARN total universal GenElute™ (Sigma-Aldrich) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, una suspensión purificada de fago Phi6\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) y el lisado se cargó en una columna giratoria para permitir que el ARN se uniera a la columna de resina. Luego, el ARN se eluye en la solución de elución \({ 50}\,{\upmu \hbox {l}}}\) proporcionada por el kit. Estime la concentración de ARN por absorbancia a \(260\,\hbox {nm}\). El ARN se almacenó en alícuotas en \ ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) hasta su uso posterior.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) El iScript cDNA Synthesis Kit (Bio -Rad Laboratories) como plantilla para la síntesis de cDNA siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, una reacción de síntesis de cDNA consta de 3 pasos: cebado en \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min} }\) , transcripción inversa de \({20}\,{\hbox {min}}\) en \({46}\,{^{\circ }\hbox {C}}\), y viceversa La grabadora está en \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) durante \({1}\,{\hbox {min }}\). Cuando se ejecutó en un gel de agarosa al 1 %, el ADNc mostró tres bandas correspondientes a los tres fragmentos de ARN esperados (datos no mostrados). Los siguientes cebadores se usaron para amplificar dos fragmentos de ADN de 117 y 503 pb de longitud, utilizando cDNA como plantilla para PCR en un termociclador miniPCR® mini8:
Los cebadores para \(117\,\hbox {bp}\) y \(503\,\hbox {bp}\) corresponden a 1476-1575 nucleótidos del segmento M y 458-943 nucleótidos del segmento L, respectivamente ácidos Todos los productos de PCR amplificados se sometieron a electroforesis en geles de agarosa al 1 % y el ADN diana amplificado se purificó utilizando el kit de extracción en gel GeneJET (Thermo Fisher Scientific).
Se usó un lago en el campus de IIT Mumbai (Powai Lake, Powai, Mumbai) para agregar partículas de fagos. El agua del lago se filtró a través de una membrana \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) para eliminar partículas suspendidas y luego se agregó el fago Phi6. Agregue \({1}\,{\hbox {ml}}\) de \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} \) a \( {100}\ ,{\hbox {ml}}\) agua de lago filtrada, en \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\). Se tomó una pequeña alícuota reservado para la medición de la carga viral por ensayo de placa. Probamos dos métodos diferentes para concentrar partículas de virus Phi6 enriquecidas: (1) el método de adsorción-precipitación de hidróxido de aluminio,19 que ha sido validado para la concentración de varios virus de ARN envueltos de muestras ambientales, y (2) ) El método de concentración de virus basado en polietilenglicol (PEG) se adaptó de Flood et al.20 .Dado que se encontró que la eficiencia de recuperación del método basado en PEG era mejor que la del método de hidróxido de aluminio, se utilizó el método basado en PEG para concentrar partículas Phi6 de muestras de agua del lago.
El método de PEG utilizado fue el siguiente: se agregaron PEG 8000 y \(\hbox {NaCl}\) a muestras de agua de lago enriquecidas con Phi6 para obtener un 8 % de PEG 8000 y \(0,2\,\hbox {M} \) \( \ hbox {NaCl}\). Las muestras se incubaron en un agitador\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), luego centrifugar a \(4700 \,\hbox {g}\) es \({45}\,{\hbox {min}}\). Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento en \({1}\, {\hbox {ml}}\) en el mismo sobrenadante. Todos los experimentos de adición y concentración de virus se realizaron por triplicado. Después de la concentración, se reservó una pequeña alícuota para medir la eficiencia de recuperación mediante ensayo de placa. El ARN se aisló como se describió anteriormente y se eluyó. en el tampón de elución suministrado por el kit\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\). Dado que la concentración de ARN variará de una muestra a otra por triplicado, \({2}\,{\upmu \ hbox {l}}\) de ARN se usa para los tres, independientemente de su concentración. Síntesis de cDNA de las muestras. La síntesis de cDNA se realizó como se describió anteriormente. se utilizó como plantilla para \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR durante 35 ciclos para amplificar \(117\,\hbox {bp}\) y \(503\,\hbox { bp}\). Estas muestras se representan como “1:1″, es decir, sin dilución. Se configuró un control sin plantilla (NTC) como control negativo, mientras que se configuró un ADNc sintetizado utilizando ARN aislado de fagos purificados. como plantilla para un control positivo (PC). La PCR cuantitativa (qPCR) se realizó en un instrumento Stratagene Mx3000P RT-PCR utilizando Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies). Las reacciones se configuraron por triplicado como antes. descrito. El umbral del ciclo (Ct) se registró para todas las muestras. Además, las muestras diluidas fueron \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) usando cDNA diluido 1:100 en agua de lago filtrada como \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR para 35 ciclos. Estas muestras se representan como “1:100″.
Los electrodos de PCB se fabrican utilizando un proceso de inmersión en oro sin electrodos (ENIG) de bajo costo comercialmente disponible sin la necesidad de un baño de oro adicional. Las especificaciones de los electrodos de PCB de ENIG se detallan en nuestro trabajo anterior. No se recomienda la solución de piraña o la voltamperometría cíclica de ácido sulfúrico, ya que pueden provocar el desprendimiento de la fina capa de oro (espesor \(\approx\) \(100\,\hbox {nm }\)) y exponer las capas de cobre subyacentes que son propensas. a la corrosión 21, 22, 23, 24, 25. Por lo tanto, limpie los electrodos con un paño sin pelusa humedecido con IPA. La muestra a analizar se incubó con \({50}\,{\upmu \hbox {M} }\) MB en \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) para facilitar la inserción. En nuestro trabajo anterior , observamos que la sensibilidad y la linealidad del sensor mejoraron al aumentar la concentración de MB 11 . Según las optimizaciones informadas en nuestro trabajo anterior, usamos \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB concentraciones para incrustar el ADN en este estudio. La detección electroquímica de ADN de doble cadena (ds-DNA) se puede lograr usando intercaladores aniónicos o catiónicos. Aunque los intercaladores aniónicos detectan el ADN con mejor selectividad, requieren una incubación durante la noche, lo que resulta en tiempos de por otro lado, los intercaladores catiónicos como MB requieren tiempos de incubación más cortos, aproximadamente \({1}\,{\hbox {h}}\) para la detección electroquímica de ds-DNA6. Cada medición implica dispensar la muestra a analizar en el electrodo\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), luego limpiar con un trapo humedecido con alcohol isopropílico, antes de proceder con otra muestra.una medición. Cada muestra se analizó en 5 electrodos diferentes, a menos que se indique lo contrario. Las mediciones de DPV y CV se realizaron con un potenciostato PalmSens Sensit Smart, y se utilizó el software PSTrace para la configuración del potenciostato y la adquisición de datos, incluidos los cálculos de corriente máxima. Se utilizan los siguientes ajustes para mediciones DPV y CV:
DPV: Tiempo de equilibrio = \(8\,\hbox {s}\), Paso de voltaje = \(3\,\hbox {mV}\), Voltaje de pulso = \(25\,\hbox {mV}\), duración del pulso = \(50\,\hbox {ms}\), tasa de exploración = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: Tiempo de equilibrio = \(8\,\hbox {s}\), Paso de voltaje = \(3\,\hbox {mV}\), Tasa de barrido = \({300}\,\hbox {mV/ s }\)
Corrientes máximas obtenidas de voltamogramas de ADN complejado con \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
Se obtuvieron voltamogramas DPV y CV en electrodos PCB ENIG \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB complejados con ADN (a concentraciones de 10–\({20}\,{\ hbox {ng }/{\upmu \hbox {l}}}\) es decir, 0,13–\({0,26}\,{\upmu \hbox {M}}\) para \(117\,\hbox {bp}\ ) y 0,03 –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) para \(503\,\hbox {bp}\)). Los voltamogramas representativos se muestran en la Figura S1 en Información complementaria. La Figura 2 muestra los resultados de mediciones de DPV y CV (corriente máxima) utilizando productos de PCR purificados en gel. En comparación con las mediciones de CV, las mediciones de DPV muestran una mayor sensibilidad (corriente en función de la concentración de ADN) porque las corrientes capacitivas de fondo en las mediciones de CV ocultan las corrientes de Faradaic 26 . para cada cuadro en el diagrama de cuadro contiene mediciones de 5 electrodos. Todas las mediciones usan el mismo conjunto de electrodos para evitar errores de medición debido a la variación de electrodo a electrodo. Observamos una tendencia creciente en las corrientes máximas medidas de DPV y CV para concentraciones más bajas de ADN , más largo (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ comparado con \(117) ). La adsorción del complejo MB-DNA facilita la transferencia de carga en el electrodo, lo que contribuye al aumento de la corriente de pico. Otros estudios han demostrado el efecto del tamaño y la secuencia del oligonucleótido en la intercalación MB-DNA27,28,29,30. La guanina El contenido de -citosina (GC) de los dos amplicones (\(117\,\hbox {bp}\) y \(503\,\hbox {bp}\)) fue de aproximadamente 50 %, lo que indica que la observación La diferencia se debe a la longitud del amplicón. Sin embargo, para concentraciones más altas de ADN (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), para \(503\,\hbox {bp} \) y \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) para \(117\,\hbox {bp}\)), observamos dos amplificaciones La las corrientes máximas de los subs se reducen tanto en las mediciones de DPV como de CV. Esto se debe a que MB se satura y se intercala entre pares de bases de ADN, lo que resulta en una inhibición estérica de la actividad redox del grupo reducible en MB31,32.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV。
Las sales presentes en las mezclas maestras de PCR interfieren con las interacciones electrostáticas entre el MB y el ADN, por lo que al agregar \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) con \({50} \,{\ upmu \hbox {M}}\) Producto purificado en gel MB para estudiar el efecto de la sal en la interacción MB-ADN. Como se muestra en la Figura 3, observamos que para concentraciones más altas de ADN (\(>{2}\,{\ hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) y \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) para \(117\,\hbox {bp} \)), en DPV y CV La adición de sal no afectó significativamente las mediciones (consulte la Figura S2 en Información complementaria para voltamogramas representativos). Sin embargo, en concentraciones más bajas de ADN, la adición de sal reduce en gran medida la sensibilidad, lo que no produce cambios significativos en la corriente con la concentración de ADN. Otros investigadores han informado previamente efectos negativos similares de la sal en las interacciones MB-ADN y la intercalación33,34. Los cationes Mg}^{2+}\) se unen al esqueleto de fosfato negativo del ADN, lo que dificulta la interacción electrostática entre el MB y el ADN. no afectan significativamente la respuesta del sensor. El punto clave es que este biosensor es más adecuado para detectar concentraciones más altas de ADN (raramente \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) o más), para el procesamiento completamente automatizado de muestras de agua ambiental, donde la purificación en gel de los productos de PCR puede no ser factible.
Área bajo la curva de absorción para el rango de longitud de onda 600–700 \(\hbox {nm}\) para varias concentraciones de ADN complejado con \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) con y sin sal (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) con y sin sal (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) Concentraciones de ADN correspondientes a \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) muestras MB Sin ADN.
Para verificar aún más los resultados anteriores, realizamos mediciones ópticas usando un espectrofotómetro UV/Vis (Thermo Scientific Multiskan GO), las muestras \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) se usaron para cada Medición. La firma de absorción disminuye con el aumento de la concentración de ADN, como se puede ver en la tendencia del área bajo la curva de absorción para el rango de longitud de onda \(600\,\hbox {nm}\) a \(700\,\hbox { nm}\), como se muestra en la Fig. 4 (espectro de absorción que se muestra en la Fig. S3 en Información complementaria). Para muestras con concentraciones de ADN inferiores a \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), no hubo una diferencia significativa en la captación entre las muestras que contenían ADN y las que solo contenían MB (para \(503\,\hbox {bp}\) y \(117\,\hbox {bp}\ ) fragmentos de longitud), lo que indica la ausencia de inhibición estérica de MB con actividad redox. interacciones e inhibición estérica con apilamiento de bases en híbridos de ADN. Nuestros resultados son consistentes con los informes en la literatura sobre estudios espectroscópicos de intercalación de ADN-MB que asocian la hipocromaticidad con niveles de energía reducidos en \(\pi\)–\(\pi ^*\ ) transiciones electrónicas debidas a la intercalación de las Capas 36, 37, 38.
Electroforesis en gel de agarosa del fago Phi6: productos de PCR de longitud \(117\,\hbox {bp}\) y \(503\,\hbox {bp}\) de muestras de agua del lago. Marcador M-DNA;Control sin plantilla NTC, cebadores que contienen los amplicones correspondientes;control positivo PC;1, 2, 3-muestras de agua de lago enriquecidas sin diluir (1:1) por triplicado. Se ve una banda en \(\alrededor de 50\,\hbox {bp}\) debido a los oligonucleótidos no utilizados en \(503\,\ hbox {pb}\) carril.
Evaluamos la utilidad del sensor usando muestras de agua del lago Powai enriquecidas con fagos Phi6. Las concentraciones de ARN aisladas de muestras de agua enriquecidas con fagos oscilaron entre 15,8 y \({19,4}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox { ml}}\), mientras que los aislados de suspensiones de fagos purificados Se estimó que el ARN era \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) con una eficiencia de recuperación de aproximadamente 1 El % de ARN se transcribió inversamente en ADNc y se usó como molde para PCR y qPCR. El tamaño del producto se confirmó mediante electroforesis en gel de agarosa (Figura 5) antes de realizar la prueba con el sensor. Estas muestras no están purificadas en gel y, por lo tanto, contienen todos los componentes de PCR como así como los amplicones de interés. Se demostró que los valores de Ct registrados durante la qPCR (Tabla 1) se correlacionan con la concentración de ARN aislado de las muestras de agua enriquecidas correspondientes. El valor de Ct revela el número de ciclos necesarios para que la señal fluorescente superan el umbral o la señal de fondo. Los valores de Ct más altos indican concentraciones de plantilla más bajas y viceversa. Los valores de Ct de las muestras de NTC fueron tan altos como se esperaba. La diferencia en \(\aproximadamente 3\) valores de Ct entre el control positivo y la muestra de prueba indican además que cada muestra de prueba tiene aproximadamente un 1 % de plantilla en comparación con el control positivo. Hemos discutido anteriormente que los amplicones más largos conducen a una mejor sensibilidad. La amplificación de fragmentos más largos aislados de muestras ambientales heterogéneas es un desafío dadas las desventajas de baja concentración viral y degradación del ARN. Sin embargo, con nuestro protocolo de enriquecimiento de virus y amplificación por PCR, pudimos amplificar con éxito el fragmento \(503\,\hbox {bp}\) para la detección electroquímica.
La Figura 6 muestra los resultados del sensor electroquímico del amplicón del fragmento \(503\,\hbox {bp}\), tanto utilizando cDNA sin diluir como plantilla (1:1) como cDNA diluido 100 veces como plantilla (1:100 ), PCR realizada , en comparación con NTC y PC (consulte la Figura S4 en Información complementaria para voltamogramas representativos). Cada cuadro en el diagrama de cuadro en la Figura 6 contiene mediciones de tres muestras en 5 electrodos. Se usaron los mismos electrodos para medir todas las muestras para evitar errores debido al electrodo. -a la variación del electrodo. En comparación con las mediciones de CV, las mediciones de DPV muestran una mejor resolución para distinguir las muestras de prueba y PC de los NTC porque, como se mencionó anteriormente, las corrientes de Faradaic están ocultas debido a las corrientes capacitivas de fondo en este último. Para amplicones más largos, observamos que el control negativo (NTC) resultó en corrientes máximas de CV y DPV más altas en relación con el control positivo, mientras que las muestras de prueba positivas y sin diluir mostraron alturas máximas similares de corrientes máximas de DPV. Los valores medios y medianos medidos para cada uno sin diluir (1: 1 ) la muestra de prueba y PC se pueden resolver claramente a partir de la salida del sensor para la muestra NTC, mientras que la resolución para la muestra diluida 1:100 es menos pronunciada. Para una dilución de cDNA de 100 veces, no observamos ninguna banda durante la electroforesis en gel (carriles que no se muestran en la Figura 5), y las corrientes máximas de DPV y CV correspondientes fueron similares a las esperadas para NTC. Los resultados para el fragmento \(117\,\hbox {bp}\) se muestran en Información complementaria. El negativo El control indujo una respuesta electroquímica del sensor de PCB debido a la adsorción de MB libre en el electrodo y la interacción del MB con el oligonucleótido cebador monocatenario. Por lo tanto, cada vez que se analiza una muestra, se debe ejecutar un control negativo y el pico de corriente de la muestra de prueba en comparación con el pico de corriente obtenido por el control negativo para lograr una medición diferencial (relativa)39,40 para clasificar la muestra de prueba como positiva o negativa.
(a) DPV, y (b) Corriente máxima de CV para la detección electroquímica de fragmentos \(503\,\hbox {bp}\) en muestras de agua del lago. Las muestras de prueba se midieron por triplicado y se compararon con controles sin plantilla (NTC) y controles positivos (PC).
Nuestros hallazgos ilustran diferentes mecanismos que afectan el rendimiento de los sensores electroquímicos para amplicones de diferentes longitudes para diferentes ADN, con concentraciones verificadas mediante mediciones ópticas utilizando un espectrofotómetro UV/Vis. Nuestras observaciones subrayan la idea de que los fragmentos de ADN más largos hasta \(\approx\) \(500\,\hbox {bp}\) se puede detectar con mayor sensibilidad y que la presencia de sal en la muestra no Sensibilidad Concentración de ADN que afecta a mayor sensibilidad (raramente \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) y superiores). Además, investigamos el efecto de diferentes tipos de muestras, incluidos los amplicones purificados en gel con y sin sal añadida, y la adición de muestras de agua del lago en mediciones de DPV y CV.Observamos que DPV proporcionó una mejor resolución, ya que la corriente capacitiva de fondo también afecta la medición de CV, haciéndola menos sensible.
La amplificación de fragmentos más largos depende de la integridad del ARN genómico viral. Varios estudios han demostrado que la amplificación de fragmentos más largos no siempre es eficiente debido a la degradación del ARN en el medio ambiente y al potencial de empalme durante el aislamiento11,41,42,43,44 .Observamos que el método de concentración de virus basado en PEG fue más efectivo para concentrar el fago Phi-6 enriquecido en muestras de agua del lago que el método de concentración de virus basado en hidróxido de aluminio. La capacidad de detectar fragmentos largos de ADN demostró superar el requisito de PCR multiplex para amplificar múltiples plantillas de longitud más corta y reducir la posibilidad de especificidad cruzada.
Las muestras biológicas son escasas, por lo que existe la necesidad de diseñar un biosensor que requiera muestras mínimas para la prueba. Los electrodos de PCB ENIG utilizados en este estudio solo requirieron \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ ) muestras para probar para cubrir el área efectiva de los electrodos. Además, el mismo electrodo se puede reutilizar después de la limpieza antes de dispensar la siguiente muestra. Las muestras amplificadas no requieren la adición de ningún químico que no sea azul de metileno, que es un económico y químico de uso común. Dado que la fabricación de cada electrodo cuesta alrededor de $ 0,55 (o INR 40), este biosensor puede ser una alternativa rentable a las tecnologías de detección existentes. La Tabla 2 muestra una comparación de este trabajo con otros sensores informados en la literatura durante mucho tiempo. Fragmentos de ADN en muestras heterogéneas.
Dado que los protocolos de detección electroquímica basados en MB se basan en la especificidad de la PCR, una de las principales limitaciones de este método es el potencial de amplificación no específica en muestras heterogéneas, como aguas residuales y agua de lago, o el uso de cebadores de baja pureza. Para mejorar la sensibilidad de métodos de detección electroquímicos para la detección de ADN de productos de PCR no purificados utilizando electrodos de PCB ENIG no modificados, es necesario comprender mejor los errores introducidos por dNTP y cebadores no utilizados, y optimizar las condiciones de reacción y los protocolos de ensayo. Parámetros fisicoquímicos adicionales como el pH, la temperatura y También puede ser necesario medir la demanda de oxígeno (DBO) de la muestra de agua para mejorar la precisión de la medición.
En conclusión, proponemos un sensor de PCB ENIG electroquímico de bajo costo para la detección de virus en muestras ambientales (agua de lago). A diferencia de los electrodos de oligonucleótidos inmovilizados o los sustratos personalizados para la detección de ADN que requieren almacenamiento criogénico para mantener la sensibilidad,53,54 nuestra técnica utiliza PCB sin modificar. electrodos con una vida útil más larga y sin requisitos de almacenamiento específicos y, por lo tanto, adecuados para el desarrollo de soluciones de medición con procesamiento automatizado de muestras implementado en países de ingresos bajos y medianos. común en muestras ambientales reduce la especificidad de este método de detección debido a la unión no específica de MB a oligonucleótidos de cadena simple y doble. Por lo tanto, la especificidad de esta prueba depende de la optimización de los cebadores y las condiciones de reacción de PCR. Además, el CV y las corrientes máximas de DPV obtenidas de las muestras analizadas deben interpretarse en relación con las respuestas obtenidas del control negativo (NTC) para cada prueba. Los diseños y métodos de sensores electroquímicos presentados en este trabajo pueden integrarse con muestreadores automáticos para desarrollar un solución económica que puede recolectar y analizar muestras y transmitir de forma inalámbrica los resultados al laboratorio.
Cashdollar, J. & Wymer, L. Métodos para la concentración inicial de virus a partir de muestras de agua: revisión y metanálisis de estudios recientes.J.Application.microorganism.115, pp. 1-11 (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL Virus transmitidos por el agua: barreras para el agua potable segura.PLoS Pathogens.11, E1004867 (2015).
Shrestha, S. et al. Epidemiología de las aguas residuales para la vigilancia rentable a gran escala de la COVID-19 en países de ingresos bajos y medianos: desafíos y oportunidades. Agua 13, 2897 (2021).
Palecek, E. & Bartosik, M. Electroquímica de ácidos nucleicos.Chemical.Rev.112, 3427–3481 (2012).
Tani, A., Thomson, AJ & Butt, JN Azul de metileno como discriminador electroquímico de oligonucleótidos de cadena simple y doble inmovilizados en sustratos de oro. Analyst 126, 1756–1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ Comparación de intercaladores de cationes y aniones para la transducción electroquímica de hibridación de ADN mediante transferencia de electrones de largo alcance. Electroquímica.comminicate.6, 648–654 (2004).
Wong, EL & Gooding, JJ Transferencia de carga a través del ADN: un biosensor de ADN electroquímico selectivo.anus.Chemical.78, 2138–2144 (2006).
Fang, TH et al.Dispositivo de microfluidos de PCR en tiempo real con detección electroquímica concurrente.sensor biológico.Bioelectrónica.24, 2131–2136 (2009).
Win, BY et al.Estudio del mecanismo de señalización y verificación del rendimiento de un sistema electroquímico de PCR en tiempo real basado en la interacción del azul de metileno con el ADN.Analyst 136, 1573–1579 (2011).
Ramirez-Chavarria, RG et al.Sensor electroquímico basado en amplificación isotérmica mediada por bucle para la detección de sars-cov-2 en muestras de aguas residuales.J.Environment.Chemical.Britain.10, 107488 (2022).
Kumar, M. et al. Detección electroquímica de amplicones de SARS-CoV-2 con electrodos de PCB. El sensor está activado. B Chemistry.343, 130169 (2021).
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. y Yoshida, H. Detección eficiente del ARN del SARS-CoV-2 en la fracción sólida de aguas residuales.ciencia.ambiente general.763, 144587 (2021).
Alygizakis, N. et al.Métodos analíticos para la detección de SARS-CoV-2 en aguas residuales: protocolo y perspectivas futuras.TraC trending anal.Chemical.134, 116125 (2020).
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. y Kashtan, N. Supervivencia del bacteriófago envuelto Phi6 (un sustituto del SARS-CoV-2) en gotitas de saliva evaporada depositadas en superficies de vidrio.ciencia.Rep.10, 1–10 (2020).
Dey, R., Dlusskaya, E. y Ashbolt, NJ Persistencia ambiental de un sustituto de SARS-CoV-2 (Phi6) en ameba de vida libre.J.Agua Salud 20, 83 (2021).
Mindich, L. Empaquetado preciso de tres fragmentos genómicos de bacteriófago de ARN de doble cadena\(\varphi\)6.microorganism.Moore.biology.Rev.63, 149–160 (1999).
Pirttimaa, MJ & Bamford, Estructura secundaria de la región de empaquetamiento del fago DH RNA\(\varphi\)6.RNA 6, 880–889 (2000).
Bonilla, N. et al. Phages on the Tap: un protocolo rápido y eficiente para preparar reservas de bacteriófagos de laboratorio. PeerJ 4, e2261 (2016).
Hora de publicación: 27-may-2022