Dankon pro vizito de Nature.com.La retumila versio, kiun vi uzas, havas limigitan subtenon por CSS.Por la plej bona sperto, ni rekomendas, ke vi uzu ĝisdatigitan retumilon (aŭ malŝaltu kongruecreĝimon en Internet Explorer).Dume, por certigi daŭra subteno, ni montros la retejon sen stiloj kaj JavaScript.
La graveco de monitorado de mediaj specimenoj estis multe aprezita ekde la komenco de la COVID-19-pandemio, kaj kelkaj monitoradklopodoj estas faritaj uzante la oran normo, kvankam qPCR-bazitaj teknikoj estas multekostaj. Elektrokemiaj DNA-biosensiloj povus provizi eble kostefika. solvo por monitorado de mediaj akvoprovaĵoj en malaltaj kaj mezaj enspezaj landoj.En ĉi tiu laboro, ni pruvas la elektrokemian detekton de amplikonoj akiritaj de Phi6-fago izolitaj de pikitaj lagaj akvoprovaĵoj (populara anstataŭanto por SARS-CoV-2), uzante ENIG. kompletigi PCB-elektrodojn sen surfaca modifo.sekso.La elektrokemia sensilrespondo estis ĝisfunde karakterizita por du DNA-fragmentoj de malsamaj longoj (\({117}\,\hbox {bp}\) kaj \({503}\,\hbox {bp}\)), kaj la efiko de saloj en PCR-majstraj miksaĵoj sur metilenbluo (MB)-DNA-interagoj. Niaj rezultoj montras, ke la longo de DNA-fragmentoj signife determinas la elektrokemian sentemon kaj pruvas en ĉi tiu laboro, ke la kapablo detekti longajn amplikonojn sen ĝela purigo de PCR-produktoj estas. grava por surloke mezurado de akvoprovaĵoj.Plene aŭtomatigita solvo por virusŝarĝo aŭguras bone.
Transsendo de la viruso en akvo estas konata kiel danĝero pri publika sano ekde la 1940-aj jaroj, kun la unua signo de transdono de poliomjelito kaj hepatito en akvo E1.La Monda Organizo pri Sano (OMS) klasifikis plurajn virusajn patogenojn en akvo de modera ĝis alta signifo de sano2.Tradicia viruso. detektaj metodoj dependas de or-normaj qPCR-bazitaj teknikoj, kiuj estas tre sentemaj kaj specifaj, sed postulas kvalifikitan personaron testi en la laboratorio uzante multekostajn instrumentojn. Tamen, en malaltaj kaj mez-enspezaj landoj (LMICoj) kun limigitaj rimedoj, homaj specimeno-testado verŝajne prenos prioritaton super media akvospecimena monitorado. Tial, alternativaj malmultekostaj metodoj estas bezonataj por daŭrigebla, realtempa monitorado de akvo kaj kloakaĵoprovaĵoj en malaltaj kaj mezenspezaj landoj kiel fruaj avertoj pri emerĝantaj malsanoj, tiel protektante ilin kontraŭ la severaj sociekonomikaj efikoj de la viruspandemio.Malaltkostaj elektrokemiaj biosensiloj por nukleaj acidoj povus disponigi promesplenan potencialan solvon al ĉi tiu nekontentigita bezono. Multaj el ĉi tiuj DNA-biosensiloj funkcias per la fakto ke komplementaj DNA-fadenoj estas senmoviĝitaj sur la elektrodo. surfaco kaj hibridiĝu kiam kongrua sekvenco ĉeestas en la specimeno. Ĉi tio povas tiam esti konvertita en signalon per diversaj elektrokemiaj teknikoj uzantaj redoksajn perantojn kiel ekzemple kalia fero/ferocianido.Metilenbluo (MB) estas unu tia redoks-aktiva molekulo, kiu havas estis raportita interkruciĝi en duoble-fadenan DNA (dsDNA) aldone al ĝia pli nespecifa ligado al unu-fadena DNA5,6.La interkaliga naturo de MBoj por formi MB-DNA-kompleksojn igas ilin populara elekto kiel redox-mediaciistoj en pluraj elektrokemia DNA. sensilaj agordoj5,6,7,8,9.Kvankam la interkalado de MB al DNA estas nespecifa, kaj la specifeco de ĉi tiu elektrokemia sensilo dependas plejparte de la pureco de la enkondukoj uzataj por PCR aŭ izoterma plifortigo, ĝi bone taŭgas por efektivigo de reala sensilo. -time elektrokemi-bazita qPCR aŭ fluoreskeca izoterma plifortigo kiel alternativo al DNA-koncentriĝo-mezurado 9 .En unu tia efektivigo, Won et al.La surfaco de oraj elektrodoj estis modifita kun 6-mercapto-1-hexanol (MCH) por reala tempo mezurado de PCR-amplikonoj kun MB uzante diferencigan pulsvoltametrion (DPV)9.En aliaj kazoj, Ramirez et al.Detection de SARS-CoV-2 en kloakaĵo per RT-LAMP-reago uzante MB kun ekran-presitaj elektrodoj. Platenaj elektrodoj ankaŭ estis uzataj kiel surlokaj elektrodoj en mikrofluida PCR-platformo desegnita por elektrokemie detekti amplikonojn dum reagoj 8 .Ĉiuj ĉi tiuj studoj postulas surfacan modifon de la elektrodoj, kio implicas pliigitajn produktadojn kaj operaciajn kostojn pro specialaj stokaj postuloj por la stabileco de ĉi tiuj funkciigitaj elektrodoj.
Skemo de la laborfluo por elektrokemia detekto de amplikonoj akiritaj de densaj viruspartikloj en lagaj akvoprovaĵoj.
Ni lastatempe pruvis elektrokemian sentadon de SARS-CoV-2-amplikonoj per malmultekostaj elektrodoj de presita cirkvito (PCB) bazitaj sur DPV kaj cikla voltametrio (CV) induktita de adsorbado de MB-DNA-kompleksoj sur la surfaco de nemodifitaj elektrodoj) ŝanĝoj en pinto. aktuala11.Ni raportas ke pli longaj DNA-fragmentoj (N1-N2, \({943}\, \hbox) formiĝis uzante la CDC-rekomenditajn N1 antaŭen kaj N2 inversajn enkondukojn kompare kun pli mallongaj fragmentoj {bp}\)) montris pli bonan linearecon en la sensilrespondo. ( N1, \(72\,\hbox {bp}\)) formiĝis uzante N1 antaŭen kaj N1 inversajn enkondukajn arojn. Ĉi tiuj studoj estas raportitaj uzante DNA-diluojn preparitajn en sennukleaza akvo. La platformo ankaŭ estis uzata por detekti SARS-CoV. -2 amplikonoj en ŝajnigaj kloakaĵprovaĵoj (akiritaj per pikado de totalaj RNA-specimenoj kun SARS-CoV-2 RNA). Ĉar RNA estas sentema al tondado dum izolado kaj kontraŭflua prilaborado,12,13 estas malfacile amplifi pli longajn fragmentojn kun ĉi tiu heterogena specimeno. Tial, la pruvo de elektrokemia sentado de SARS-CoV-2 amplikono en kloakaĵo estas limigita al la pli mallonga \(72\,\hbox {bp}\) N1 fragmento.
En ĉi tiu laboro, ni esploris la fareblecon de ENIG-PCB-bazita elektrokemia sento de fago Phi6 koncentrita kaj izolita de lagaj akvoprovaĵoj (Fig. 1). Phi6-fagoj estas kompareblaj en grandeco (80-100 nm) al SARS-CoV-2 kaj ankaŭ havas lipidan membranon kaj pikan proteinon.Pro ĉi tiuj kialoj, bakteriofago Phi6 estas populara surogato por SARS-CoV-2 kaj aliaj envolvitaj patogenaj RNA-virusoj14,15.RNA izolita de fagaj partikloj estis uzata kiel ŝablono por cDNA-sintezo sekvita de PCR por akiri du DNA-fragmentojn de 117 kaj 503 bazparoj longaj. Donante la defion pligrandigi \(943\,\hbox {bp}\) N1-N2-fragmentojn en nia antaŭa laboro, ni celas mezlongajn fragmentojn (\(117). \,\hbox {bp}\) kaj \(503 \,\hbox {bp}\)), surbaze de disponeblaj enkondukoj. La elektrokemia sensilrespondo estis sisteme studita en larĝa koncentriĝa gamo (\({10}\,{ \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) al \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) Por ambaŭ fragmentoj en la ĉeesto de MB, la efiko de salo sur la sensilrespondo estis karakterizita kaj krucvalidigita per spektrofotometriaj mezuradoj. La ĉefaj kontribuoj de ĉi tiu laboro estas kiel sekvas:
DNA-fragmentolongo kaj la ĉeesto de salo en la provaĵo forte influas sentemon.Niaj rezultoj montras, ke elektrokemia agado dependas de malsamaj mekanismoj de la interago de MB, DNA, kaj la sensilo en la voltametria respondo, depende de DNA-koncentriĝo kaj longeco, kun pli longaj Fragmentoj montras pli altan sentemon, kvankam salo havas negativan efikon sur elektrostatikaj interagoj inter MB kaj DNA.
DNA-koncentriĝo determinas la mekanismon de MB-DNA-interago en nemodifitaj elektrodoj Ni pruvas ke malsamaj mekanismoj de MB-DNA-interago dependas de DNA-koncentriĝo. Ĉe DNA-koncentriĝoj sub malgranda kvanto de \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), ni observis, ke la elektrokemia aktuala respondo estis ĉefe determinita de la adsorbado de MB-DNA sur la elektrodo, dum ĉe pli malaltaj koncentriĝoj Ĉe altaj DNA-koncentriĝoj, la elektrokemia aktuala respondo estis determinita de la stera inhibicio de redox. agado pro MB-enigo inter DNA-bazparoj.
ENIG-PCB-Bazita Elektrokemia Sentado de Viraj Nukleaj Acidoj en Lago-Akvoprovaĵoj La observoj estis validigitaj per elektrokemia detekto de Phi6-aldonitaj \(503\,\hbox {bp}\) DNA-fragmentoj akiritaj de akvoprovaĵoj de Powai Lago, IIT Mumbai Campus. Rezulta fago.
Malalta kosto de efektivigo kaj potencialo por integriĝo en plene aŭtomatigitajn monitoradsistemojn, oligonukleotidojn aŭ aptamerojn sur elektrodoj kun pli longa bretdaŭro.
Phi6-fago estas envolvita dsRNA-viruso de la familio Cytoviridae, kiu infektas Pseudomonas syringae.La genaro de Phi6-fago ekzistas en la formo de 3 fragmentoj: S (\(2.95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4.07). \,\hbox {Kb}\)) kaj L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\))16,17.Ĉar la Phi6 fago infektas ne-patogenan BSL-1 Pseudomonas-trostreĉiĝon, ĝi estas sekure uzi kaj povas esti facile kreskigita en la laboratorio.Phage Phi6 kaj ĝia gastiganto Pseudomonas syringae estis aĉetitaj de la Felix d'Herelle Reference Center for Bacterial Viruses, Laval University, Kanado (referenca centro-katalognombroj estas HER-102 kaj HER-1102, respektive) .Phi6-fago kaj ĝia gastiganto estis revivigitaj kiel direktite fare de la referenccentro. Fago Phi6 estis purigita per platlizo kaj eluo por akiri finajn titolojn kun \(\ĉirkaŭ 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { ml}}\) (plakformaj unuoj/ mililitroj).RNA estis izolita de purigitaj fagaj partikloj uzante la GenElute™ Universal Total RNA Purification Kit (Sigma-Aldrich) laŭ la instrukcioj de la fabrikanto.Mallonge, purigita fago Phi6-suspendo\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) estis lizita kaj la lisato estis ŝarĝita sur spinkolonon por permesi al RNA ligi al la rezina kolono .La RNA tiam estas eluita en la elicia solvaĵo \({ 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) provizita de la ilaro.Taksi la koncentriĝon de RNA per absorbo ĉe \(260\,\hbox {nm}\).RNA estis stokita en alikvotoj en \ ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) ĝis plua uzo.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) La iScript cDNA Sinteza Ilaro (Bio -Rad Laboratories) estis uzata kiel ŝablono por cDNA-sintezo sekvante la instrukciojn de la fabrikanto.Mallonge, cDNA-sinteza reago konsistas el 3 paŝoj: amorado ĉe \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min} }\) , inversa transskribo de \({20}\,{\hbox {min}}\) ĉe \({46}\,{^{\circ }\hbox {C}}\), kaj reverso La registrilo estas en \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) por \({1}\,{\hbox {min }}\).Kiam prizorgita sur 1% agarosa ĝelo, la cDNA montris tri bendojn respondajn al la atendataj tri RNA-fragmentoj (datenoj ne montritaj).La sekvaj enkondukoj estis uzitaj por plifortigi du DNA-fragmentojn de 117 kaj 503 bp en longo, uzante cDNA kiel ŝablonon por PCR en termociklilo miniPCR® mini8:
La enkondukoj por \(117\,\hbox {bp}\) kaj \(503\,\hbox {bp}\) egalrilatas al 1476-1575 nukleotidoj de la M-segmento kaj 458-943 nukleotidoj de la L-segmento, respektive acida. .Ĉiuj plifortigitaj PCR-produktoj estis elektroforesitaj sur 1%-agarozaj ĝeloj, kaj plifortigita cela DNA estis purigita uzante la GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Fisher Scientific).
Lago ĉe la IIT-Mumbajo-kampuso (Powai Lake, Powai, Mumbajo) estis uzita por aldoni fagpartiklojn. La laga akvo estis filtrita tra \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) membrano por forigi suspenditaj partikloj, kaj poste Phi6-fago estis aldonita.Aldonu \({1}\,{\hbox {ml}}\) de \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} \) al \( {100}\ ,{\hbox {ml}}\) filtrita laga akvo, en \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\).Malgranda alikvoto estis rezervita por mezurado de virusŝarĝo per plaka analizo. Ni testis du malsamajn metodojn por koncentri pikitajn Phi6-virusajn partiklojn: (1) la aluminia hidroksida adsorba-precipita metodo,19 kiu estis validigita por la koncentriĝo de pluraj envolvitaj RNA-virusoj de mediaj specimenoj, kaj (2) ) La metodo de koncentriĝo de viruso bazita en polietilenglikolo (PEG) estis adaptita de Flood et al.20 .Ĉar la reakiro-efikeco de la PEG-bazita metodo estis trovita pli bona ol tiu de la aluminia hidroksida metodo, la PEG-bazita metodo estis uzata por koncentri Phi6-partiklojn el lagaj akvoprovaĵoj.
La PEG-metodo uzita estis jena: PEG 8000 kaj \(\hbox {NaCl}\) estis aldonitaj al Phi6-pikitaj lagakvoprovaĵoj por akiri 8 % PEG 8000 kaj \(0.2\,\hbox {M} \) \( \ hbox {NaCl}\).Provoj estis kovataj sur skuilo\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), tiam centrifugata ĉe \(4700 \,\hbox {g}\) estas \({45}\,{\hbox {min}}\).Forĵetu la supernatanton kaj resuspendu la buleton en \({1}\, {\hbox {ml}}\) en la sama supernatante.Ĉiuj eksperimentoj pri pikado kaj viruskoncentriĝo estis faritaj triope.Post koncentriĝo, malgranda alikvoto estis rezervita por mezurado de reakira efikeco per plaka analizo.RNA estis izolita kiel antaŭe priskribite kaj eluita. en eluvbufro provizita per ilaro\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\). Ĉar la RNA-koncentriĝo varias de specimeno al specimeno trioble, la \({2}\,{\upmu \ hbox {l}}\) de RNA estas uzata por ĉiuj tri sendepende de ĝia koncentriĝo cDNA sintezo de specimenoj.cDNA sintezo estis farita kiel antaŭe priskribite.\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNA estis uzata kiel ŝablono por \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR dum 35 cikloj por plifortigi \ (117\,\hbox {bp}\) kaj \(503\,\hbox { bp}\) fragmentoj.Ĉi tiuj specimenoj estas reprezentitaj kiel “1:1″, te sen diluo.Ne-ŝablona kontrolo (NTC) estis starigita kiel negativa kontrolo, dum cDNA sintezita uzante RNA izolita de purigita fago estis starigita. kiel ŝablono por pozitiva kontrolo (PC).Kvanta PCR (qPCR) estis farita en Stratagene Mx3000P RT-PCR-instrumento uzante Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies).Reagoj estis starigitaj triope kiel antaŭe. priskribita.La ciklosojlo (Ct) estis registrita por ĉiuj specimenoj.Krome, la diluitaj specimenoj estis \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) uzante cDNA diluitan 1:100 en filtrita laga akvo kiel \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR por 35 cikloj. Ĉi tiuj specimenoj estas reprezentitaj kiel “1:100″.
La PCB-elektrodoj estas fabrikitaj uzante komerce haveblan malaltkostan Elektroless Nickel Immersion Gold (ENIG) procezo sen la bezono de plia ora tegado.ENIG-PCB-elektrodaj specifoj estas detalaj en nia antaŭa laboro11.Por ENIG-PCB-elektrodoj, tradiciaj elektrodaj purigaj metodoj kiel ekzemple piranha solvaĵo aŭ sulfuracida cikla voltametrio ne estas rekomenditaj ĉar ili povas kaŭzi senŝeliĝon de la maldika ortavolo (dikeco \(\approx\) \(100\,\hbox {nm }\)) kaj elmontri la subestajn kuprajn tavolojn kiuj estas inklinaj. al korodo 21, 22, 23, 24, 25. Sekve, purigu la elektrodojn per senpelusa tuko malsekigita per IPA. La teston specimenon oni kovis per \({50}\,{\upmu \hbox {M} }\) MB en \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) por facila enmeto.En nia antaŭa laboro , ni observis, ke la sentemo kaj lineareco de la sensilo estis plibonigitaj per pliigo de la MB-koncentriĝo 11 .Surbaze de optimumoj raportitaj en nia pli frua laboro, ni uzis \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB koncentriĝoj por enigi DNA en ĉi tiu studo.Elektrokemia detekto de duoble-fadena DNA (ds-DNA) povas esti atingita per anjonaj aŭ katjonaj interkaliloj.Kvankam anjonaj interkaloj detektas DNA kun pli bona selektiveco, ili postulas dumnoktan kovadon, rezultigante pli longajn detektajn tempojn.On aliflanke, katjonaj interkaliloj kiel MB postulas pli mallongajn kovadotempojn, proksimume \({1}\,{\hbox {h}}\) por elektrokemia detekto de ds-DNA6. Ĉiu mezurado implikas disdoni la provaĵon por esti testita sur la elektrodo\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), poste purigante per IPA-malsekigita ĉifono, antaŭ ol daŭrigi kun alia specimeno.unu mezurado.Ĉiu specimeno estis testita sur 5 malsamaj elektrodoj krom se alie dirite.DPV kaj CV-mezuradoj estis faritaj per PalmSens Sensit Smart-potenciostato, kaj PSTrace-programaro estis uzata por potentiostat-agordo kaj akiro de datumoj, inkluzive de pint-kurantaj kalkuloj.La sekvaj agordoj estas uzataj. por DPV kaj CV-mezuradoj:
DPV: Ekvilibra Tempo = \(8\,\hbox {s}\), Tensio-Paŝo = \(3\,\hbox {mV}\), Pulsa Tensio = \(25\,\hbox {mV}\) , pulsdaŭro = \(50\,\hkesto {ms}\), skanada indico = \({20}\,\hkesto {mV/s}\)
CV: Ekvilibro-Tempo = \(8\,\hbox {s}\), Tensio-Paŝo = \(3\,\hbox {mV}\), Balaa indico = \({300}\,\hbox {mV/ s }\)
Pintfluoj akiritaj de voltamogramoj de DNA kompleksita kun \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
DPV kaj CV-voltamogramoj estis akiritaj sur ENIG-PCB-elektrodoj \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB kompleksitaj kun DNA (ĉe koncentriĝoj de 10–\({20}\,{\ hbox {ng). }/{\upmu \hbox {l}}}\) t.e. 0,13–\({0,26}\,{\upmu \hbox {M}}\) por \(117\,\hbox {bp}\ ) kaj 0,03 –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) por \(503\,\hbox {bp}\)).Reprezentaj voltamogramoj estas montritaj en Figuro S1 en Suplementaj Informoj.Figuro 2 montras la rezultojn. de DPV- kaj CV-mezuradoj (pinta kurento) uzante ĝelpurigitajn PCR-produktojn.Kompare al CV-mezuradoj, DPV-mezuradoj montras pli altan sentemon (kurento kiel funkcio de DNA-koncentriĝo) ĉar la fonaj kapacivaj fluoj en CV-mezurado kaŝas Faradaikaj fluoj 26 .La datenoj. por ĉiu skatolo en la kestintrigo enhavas mezuradojn de 5 elektrodoj.Ĉiuj mezuradoj uzas la saman aron da elektrodoj por eviti mezurajn erarojn pro elektrodo-al-elektroda vario.Ni observis kreskantan tendencon en DPV kaj CV mezuritaj pintfluoj por pli malaltaj koncentriĝoj de DNA. , pli longa (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ kompare kun \(117) ) fragmento.Ĉi tio kongruas kun la atendata tendenco de elektrodsorbado raportita en nia antaŭa laboro.La adsorbo de la MB-DNA-komplekso faciligas la ŝargan translokigon sur la elektrodo, kiu kontribuas al la pliigo de la pinta kurento.Aliaj studoj montris la efikon de oligonucleotida grandeco kaj sekvenco sur MB-DNA-interkalado27,28,29,30.La guanino. -citozina (GC) enhavo de la du amplikonoj (\(117\,\hbox {bp}\) kaj \(503\,\hbox {bp}\)) estis proksimume 50%, indikante ke la observado La diferenco ŝuldiĝas al amplikonlongo.Tamen, por pli altaj DNA-koncentriĝoj (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), por \(503\,\hbox {bp} \) kaj \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) por \(117\,\hbox {bp}\)), ni observas du plifortigojn La pintfluoj de la subs estas reduktitaj en kaj DPV kaj CV-mezuradoj. Ĉi tio estas ĉar MB saturas kaj interkalas inter bazparoj de DNA, rezultigante steran inhibicion de la redox-agado de la reduktebla grupo en MB31,32.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV。
Saloj ĉeestantaj en PCR majstraj miksaĵoj influas elektrostatikajn interagojn inter MB kaj DNA, do aldonante \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) kun \({50} \,{\ upmu \hbox {M}}\) MB-ĝelpurigita produkto por studi la efikon de salo sur MB-DNA-interago. Kiel montrite en Figuro 3, ni observis ke por pli altaj DNA-koncentriĝoj (\(>{2}\,{\ hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) kaj \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) por \(117\,\hbox {bp} \)), en DPV kaj CV La aldono de salo ne grave influis la mezuradojn (vidu Figuron S2 en Suplementaj Informoj por reprezentaj voltamogramoj).Tamen, ĉe pli malaltaj DNA-koncentriĝoj, la aldono de salo multe reduktas sentivecon, rezultigante neniun signifan ŝanĝon en fluo kun DNA-koncentriĝo.Similaj negativaj efikoj de salo sur MB-DNA interagoj kaj interkalado estis antaŭe raportitaj de aliaj esploristoj33,34.\(\hbox { Mg}^{2+}\) katjonoj ligas al la negativa fosfata spino de DNA, tiel malhelpante la elektrostatikan interagadon inter MB kaj DNA. Ĉe pli altaj DNA-koncentriĝoj, stera inhibicio de redox-aktivaj MBoj rezultigas pli malaltajn pintfluojn, do elektrostatikaj interagoj. ne signife influas la sensilrespondon. La ŝlosila punkto estas, ke ĉi tiu biosensilo pli taŭgas por detekti pli altajn DNA-koncentriĝojn (malofte \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) aŭ pli alte), por plene- Aŭtomatigita pretigo de mediaj akvoprovaĵoj, kie ĝela purigo de PCR-produktoj eble ne estas farebla.
Areo sub la sorba kurbo por la ondolongintervalo 600–700 \(\hbox {nm}\) por diversaj koncentriĝoj de DNA kompleksigita kun \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) kun kaj sen salo (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) kun kaj sen salo (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) DNA-koncentriĝoj respondaj al \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB-provaĵoj Neniu DNA.
Por plu kontroli la suprajn rezultojn, ni faris optikaj mezuradoj per UV/Vis-spektrofotometro (Thermo Scientific Multiskan GO), la specimenoj \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) estis uzataj por ĉiu. Mezurado.La sorbadsignaturo malpliiĝas kun pliiĝanta DNA-koncentriĝo, kiel videblas el la tendenco de la areo sub la sorbadkurbo por la ondolonga gamo \(600\,\hbox {nm}\) al \(700\,\hbox {). nm}\) , kiel montrite en Fig. 4 (sorbada spektro montrita en Fig. S3 en Suplementaj Informoj).Por specimenoj kun DNA-koncentriĝoj malpli ol \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), ekzistis neniu signifa diferenco en asimilado inter DNA-enhavantaj kaj nur MB-specimenoj (por \(503\,\hbox {bp}\) kaj \(117\,\hbox {bp}\) ) longaj fragmentoj), indikante la foreston de stera inhibicio de redox-aktiva MB. Ĉe pli altaj DNA-koncentriĝoj, ni observis laŭpaŝan malkreskon en la sorba signalo kaj notis malpli grandan malkreskon de absorbo en ĉeesto de salo. Ĉi tiuj rezultoj estis atribuitaj al molekula. interagoj kaj stera inhibicio kun bazstakado en DNA-hibridoj. Niaj rezultoj estas kongruaj kun raportoj en la literaturo pri spektroskopaj studoj de MB-DNA interkalado, kiuj asocias hipokromatikecon kun reduktitaj energiniveloj en \(\pi\)–\(\pi ^*\ ) elektronikaj transiroj pro interkalaj Tavoloj 36, 37, 38.
Agarose-ĝelelektroforezo de fago Phi6: PCR-produktoj de longo \(117\,\hbox {bp}\) kaj \(503\,\hbox {bp}\) de lagaj akvoprovaĵoj.M-DNA-signo;NTC-senŝablona kontrolo, enkondukoj enhavantaj ekvivalentajn amplikonojn;Komputila pozitiva kontrolo;1, 2, 3-nediluitaj (1:1) pikitaj lagaj akvoprovaĵoj trioble.Bando videblas ĉe \(\ĉirkaŭ 50\,\hbox {bp}\) pro neuzataj oligonukleotidoj en la \(503\,\). hbox {bp}\) lane.
Ni taksis la utilecon de la sensilo uzante specimenojn de akvo de Powai Lake pikitaj kun Phi6-fago. La RNA-koncentriĝoj izolitaj de fago-pikitaj akvoprovaĵoj variis de 15.8–\({19.4}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox { ml}}\), dum tiuj izolitaj de purigitaj fagsuspensioj La RNA estis taksita esti \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) kun reakira efikeco de proksimume 1 %.RNA estis inverse transskribita en cDNA kaj uzata kiel ŝablono por PCR kaj qPCR.Produkta grandeco estis konfirmita per agarosa ĝela elektroforezo (Figuro 5) antaŭ testado per la sensilo. Ĉi tiuj specimenoj ne estas ĝelo purigitaj kaj tial enhavas ĉiujn komponantojn de PCR kiel same kiel la amplikonoj de intereso.La Ct-valoroj registritaj dum qPCR (Tablo 1) estis montritaj korelacii kun la koncentriĝo de RNA izolita de la respondaj pikitaj akvoprovaĵoj. La Ct-valoro rivelas la nombron da cikloj necesaj por la fluoreska signalo al. superi la sojlon aŭ fonan signalon.Pli altaj Ct-valoroj indikas pli malaltajn ŝablonkoncentriĝojn kaj inverse.La Ct-valoroj de la NTC-provaĵoj estis tiel altaj kiel atendite.La diferenco en \(\ĉirkaŭ 3\) Ct-valoroj inter la pozitiva kontrolo kaj la testa specimeno plue indikas, ke ĉiu prova specimeno havas proksimume 1% ŝablonon kompare kun la pozitiva kontrolo.Ni antaŭe diskutis, ke pli longaj amplikonoj kondukas al pli bona sentemo.Plifortigo de pli longaj fragmentoj izolitaj de heterogenaj mediaj specimenoj estas malfacila pro la malavantaĝoj. de malalta viruskoncentriĝo kaj RNA-degenero.Tamen, per nia virusriĉigo kaj PCR-amplifiga protokolo, ni povis sukcese pligrandigi la fragmenton \(503\,\hbox {bp}\) por elektrokemia sentado.
Figuro 6 montras la elektrokemiajn sensilrezultojn de la fragmentamplikono \(503\,\hbox {bp}\), ambaŭ uzante nediluitan cDNA kiel ŝablonon (1:1) kaj 100-oblan diluitan cDNA kiel ŝablonon (1:100) farita PCR. , kompare kun NTC kaj PC (vidu Figuro S4 en Suplementaj Informoj por reprezentaj voltamogramoj).Ĉiu skatolo en la kestintrigo en Figuro 6 enhavas mezuradojn de tri specimenoj ĉe 5 elektrodoj.La samaj elektrodoj estis uzataj por mezuri ĉiujn specimenojn por eviti erarojn pro elektrodo. -al-elektrodo-vario.Kompare al CV-mezuradoj, DPV-mezuradoj montras pli bonan rezolucion por distingi provajn kaj komputilajn specimenojn de NTC-oj ĉar, kiel antaŭe menciite, Faradaaj fluoj estas kaŝitaj pro fonaj kapacivaj fluoj en ĉi-lastaj.Por pli longaj amplikonoj, ni observis, ke la negativa kontrolo (NTC) rezultigis pli altajn CV- kaj DPV-pintajn fluojn rilate al la pozitiva kontrolo, dum pozitivaj kaj nediluitaj testaj specimenoj montris similajn pintajn altecojn de DPV-pintaj fluoj. La mezuritaj averaĝaj kaj medianaj valoroj por ĉiu nediluita (1:1). ) provprovaĵo kaj komputilo povas esti klare solvitaj de la sensila eligo por la NTC-provaĵo, dum la rezolucio por la 1:100 diluita specimeno estas malpli prononcita.Por 100-obla diluo de cDNA, ni ne observis iujn ajn bendojn dum ĝela elektroforezo. (lenoj ne montritaj en Figuro 5), kaj la ekvivalentaj DPV kaj CV-pintaj fluoj estis similaj al tiuj atenditaj por NTC.La rezultoj por la fragmento \(117\,\hbox {bp}\) estas montritaj en Suplementaj Informoj.La negativa kontrolo induktis elektrokemian respondon de la PCB-sensilo pro la adsorbado de libera MB sur la elektrodo kaj la interago de la MB kun la unu-fadena primer-oligonukleotido. Sekve, ĉiufoje kiam specimeno estas provita, negativa kontrolo devas esti rulita kaj la pinta kurento de la testa specimeno kompare kun la pinta kurento akirita de la negativa kontrolo por atingi diferencian (relativa) mezurado39,40 por klasifiki la testan specimenon kiel pozitivan aŭ negativan.
(a) DPV, kaj (b) CV-pinta kurento por elektrokemia detekto de \(503\,\hbox {bp}\) fragmentoj en lagaj akvoprovaĵoj. Testprovaĵoj estis mezuritaj trioble kaj komparitaj kun neniuj ŝablonkontroloj (NTC) kaj pozitivaj kontroloj (komputilo).
Niaj trovoj ilustras malsamajn mekanismojn influantajn la agadon de elektrokemiaj sensiloj por amplikonoj de malsamaj longoj por malsamaj DNA-oj, kun koncentriĝoj kontrolitaj per optikaj mezuradoj per UV/Vis-spektrofotometro. Niaj observaĵoj substrekas la komprenon, ke pli longaj DNA-fragmentoj ĝis \(\ĉ.\) \(500\,\hbox {bp}\) povas esti detektita kun pli alta sentemo kaj ke la ĉeesto de salo en la specimeno ne Sentiveco DNA-koncentriĝo kiu influas pli altan sentemon (malofte \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) kaj supre).Krome, ni esploris la efikon de malsamaj specoj de specimenoj, inkluzive de ĝelpurigitaj amplikonoj kun kaj sen aldonita salo, kaj aldono de lagakvoprovaĵoj en DPV kaj CV-mezuradoj.Ni observis, ke DPV disponigis pli bonan rezolucion, ĉar la fona kapacita fluo ankaŭ influas la CV-mezuradon, igante ĝin malpli sentema.
Plifortigo de pli longaj fragmentoj dependas de la integreco de la virusa genoma RNA. Pluraj studoj montris, ke plifortigo de pli longaj fragmentoj ne ĉiam estas efika pro degenero de RNA en la medio kaj la potencialo por splisado dum izolado11,41,42,43,44. .Ni observis, ke la PEG-bazita virusa koncentriĝometodo estis pli efika en koncentri fago Phi-6 pikita en lagakvoprovaĵoj ol la aluminiohidroksid-bazita virusa koncentriĝometodo.La kapablo detekti longajn DNA-fragmentojn pruvis venki la postulon por multipleksa PCR. por pligrandigi multoblajn pli mallongajn longajn ŝablonojn kaj redukti la eblecon de kruc-specifeco.
Biologiaj specimenoj estas malabundaj, do necesas desegni biosensilon, kiu postulas minimumajn specimenojn por testado.La ENIG-PCB-elektrodoj uzataj en ĉi tiu studo nur postulis \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ ) specimenoj por testado por kovri la efikan areon de la elektrodoj. Krome, la sama elektrodo povas esti reuzita post purigado antaŭ ol disdoni la sekvan specimenon. Plifortigitaj specimenoj ne postulas la aldonon de iuj kemiaĵoj krom metilenbluo, kiu estas malmultekosta. kaj ofte uzata kemiaĵo.Ĉar ĉiu elektrodo kostas ĉirkaŭ 0,55 USD (aŭ 40 INR) por fabriki, ĉi tiu biosensilo povas esti kostefika alternativo al ekzistantaj detektteknologioj.Tablo 2 montras komparon de ĉi tiu laboro kun aliaj sensiloj raportitaj en la literaturo dum longa tempo. DNA-fragmentoj en heterogenaj provaĵoj.
Konsiderante ke MB-bazitaj elektrokemiaj detektaj protokoloj dependas de la specifeco de PCR, grava limigo de ĉi tiu metodo estas la potencialo por nespecifa plifortigo en heterogenaj specimenoj kiel ekzemple kloakaĵo kaj laga akvo aŭ uzado de malaltpuraj enkondukoj. Por plibonigi la sentemon de elektrokemiaj detektaj metodoj por DNA-detekto de nepurigitaj PCR-produktoj uzante nemodifitajn ENIG-PCB-elektrodojn, necesas pli bone kompreni erarojn enkondukitajn de neuzataj dNTP-oj kaj enkondukoj, kaj optimumigi reagkondiĉojn kaj analizprotokolojn.Pliaj fizikkemiaj parametroj kiel pH, temperaturo kaj biologiaj parametroj. oksigenpostulo (BOD) de la akvoprovaĵo ankaŭ povas devi esti mezurita por plibonigi la precizecon de la mezurado.
Konklude, ni proponas malaltkostan elektrokemian ENIG-PCB-sensilon por virus-detekto en mediaj (lago-akvo) specimenoj. Male al senmovigitaj oligonukleotidaj elektrodoj aŭ kutimaj substratoj por DNA-sentado, kiuj postulas kriogenan stokadon por konservi sentivecon,53,54 nia tekniko uzas nemodifitan PCB. elektrodoj kun pli longa vivdaŭro kaj neniuj specifaj stokadpostuloj kaj tial taŭgaj por la evoluo de mezursolvoj kun aŭtomatigita specimena prilaborado deplojita en LMICoj.La biosensilo uzas malmultekostajn DNA-interkatajn redox-tinkturfarbojn (MB) por rapida detekto de celaj amplikonoj.La nespecifa plifortigo. ofta en mediaj specimenoj reduktas la specifecon de ĉi tiu senta metodo pro la nespecifa ligado de MBs al unu- kaj duoble-fadenaj oligonukleotidoj. Sekve, la specifeco de ĉi tiu testo dependas de la optimumigo de enkondukoj kaj PCR-reagaj kondiĉoj. Krome, la CV. kaj DPV-pintaj fluoj akiritaj de la testitaj specimenoj devus esti interpretitaj rilate al la respondoj akiritaj de la negativa kontrolo (NTC) por ĉiu testo.La elektrokemiaj sensildezajnoj kaj metodoj prezentitaj en ĉi tiu laboro povas esti integritaj kun aŭtospeciloj por evoluigi plene aŭtomatigitan kaj malaltan. -kosta solvo, kiu povas kolekti kaj analizi specimenojn kaj sendrate transdoni rezultojn reen al la laboratorio.
Cashdollar, J. & Wymer, L. Metodoj por komenca koncentriĝo de virusoj de akvoprovaĵoj: revizio kaj meta-analizo de lastatempaj studoj.J.Apliko.mikroorganismo.115, pp 1-11 (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL Waterborne viruses: Barriers to safe drinking water.PLoS Pathogens.11, E1004867 (2015).
Shrestha, S. et al.Wastewater epidemiology por kostefika grandskala gvatado de COVID-19 en malaltaj kaj mezaj enspezaj landoj: defioj kaj ŝancoj. Water 13, 2897 (2021).
Palecek, E. & Bartosik, M. Nucleic acid electrochemistry.Chemical.Rev.112, 3427-3481 (2012).
Tani, A., Thomson, AJ & Butt, JN Metilenbluo kiel elektrokemia diskriminanto de unu- kaj duoble-fadenaj oligonukleotidoj senmovigitaj sur orsubstratoj.Analizisto 126, 1756–1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ Komparo de Cattion kaj Anion Intercalators por Electrochemical Transduction of DNA Hybridization by Long-Range Electron Transfer.Electrochemistry.comminicate.6, 648-654 (2004).
Wong, EL & Gooding, JJ Ŝargotranslokigo tra DNA: selektema elektrokemia DNA-biosensor.anus.Chemical.78, 2138-2144 (2006).
Fang, TH et al.Real-time PCR mikrofluida aparato kun samtempa elektrokemia detekto.biological sensor.Bioelectronics.24, 2131-2136 (2009).
Win, BY et al.Signaling-mekanismostudo kaj agado-konfirmo de elektrokemia realtempa PCR-sistemo bazita sur la interago de metilenbluo kun DNA.Analizisto 136, 1573-1579 (2011).
Ramirez-Chavarria, RG et al.Loop-mediated izoterma plifortigo-bazita elektrokemia sensilo por detekto de sars-cov-2 en kloakaĵprovaĵoj.J.Medio.Kemia.Britio.10, 107488 (2022).
Kumar, M. et al.Elektrokemia sentado de SARS-CoV-2-amplikonoj kun PCB-elektrodoj.La sensilo estas aktivigita.B Chemistry.343, 130169 (2021).
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. & Yoshida, H. Efika detekto de SARS-CoV-2 RNA en la solida frakcio de wastewater.science.general environment.763, 144587 (2021).
Alygizakis, N. et al.Analytical Methods for SARS-CoV-2 Detection in Wastewater: Protocol and Future Perspectives.TraC trending anal.Chemical.134, 116125 (2020).
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. & Kashtan, N. Supervivo de la envolvita bakteriofago Phi6 (surogato por SARS-CoV-2) en vaporigitaj salivgutetoj deponitaj sur vitrosurfacoj.science.Rep.10, 1–10 (2020).
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ Media persisto de SARS-CoV-2 surogato (Phi6) en liberviva amebo.J.Akva Sano 20, 83 (2021).
Mindich, L. Precise package of three genomic fragments of double-stranded RNA bakteriophage\(\varphi\)6.microorganism.Moore.biology.Rev.63, 149-160 (1999).
Pirttimaa, MJ & Bamford, Sekundara strukturo de la DH RNA-fago\(\varphi\)6 pakregiono.RNA 6, 880–889 (2000).
Bonilla, N. et al.Phages on the Tap - Rapida kaj efika protokolo por prepari laboratoriajn akciojn de bakteriofagoj.PeerJ 4, e2261 (2016).
Afiŝtempo: majo-27-2022