Vielen Dank für Ihren Besuch auf Nature.com. Die von Ihnen verwendete Browserversion unterstützt CSS nur eingeschränkt. Für ein optimales Erlebnis empfehlen wir Ihnen, einen aktualisierten Browser zu verwenden (oder den Kompatibilitätsmodus in Internet Explorer zu deaktivieren). weiterhin unterstützen, werden wir die Seite ohne Stile und JavaScript anzeigen.
Die Bedeutung der Überwachung von Umweltproben wird seit Beginn der COVID-19-Pandemie sehr geschätzt, und einige Überwachungsbemühungen werden unter Verwendung des Goldstandards durchgeführt, obwohl qPCR-basierte Techniken teuer sind. Elektrochemische DNA-Biosensoren könnten eine potenziell kostengünstige Lösung darstellen Lösung zur Überwachung von Umweltwasserproben in Ländern mit niedrigem und mittlerem Einkommen. In dieser Arbeit demonstrieren wir den elektrochemischen Nachweis von Amplikons, die aus Phi6-Phagen gewonnen wurden, die aus gespikten Seewasserproben (ein beliebter Ersatz für SARS-CoV-2) isoliert wurden, unter Verwendung von ENIG um PCB-Elektroden ohne Oberflächenmodifikation zu vervollständigen.Geschlecht. Die Reaktion des elektrochemischen Sensors wurde gründlich für zwei DNA-Fragmente unterschiedlicher Länge (\({117}\,\hbox {bp}\) und \({503}\,\hbox {bp}\)) charakterisiert Wirkung von Salzen in PCR-Mastermixen auf Methylenblau (MB)-DNA-Wechselwirkungen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Länge von DNA-Fragmenten maßgeblich die elektrochemische Sensitivität bestimmt und demonstrieren in dieser Arbeit, dass die Fähigkeit zum Nachweis langer Amplikons ohne Gelreinigung von PCR-Produkten besteht wichtig für die In-situ-Messung von Wasserproben.Eine vollautomatische Lösung für Viruslast verheißt Gutes.
Die Übertragung von Viren durch Wasser ist seit den 1940er Jahren als Gefahr für die öffentliche Gesundheit bekannt, mit den ersten Hinweisen auf eine Übertragung von Polio und Hepatitis E1 durch Wasser Nachweismethoden beruhen auf qPCR-basierten Goldstandard-Techniken, die hochempfindlich und spezifisch sind, aber qualifiziertes Personal erfordern, um im Labor mit teuren Instrumenten zu testen Probentests werden wahrscheinlich Vorrang vor der Überwachung von Wasserproben in der Umwelt haben. Daher werden alternative kostengünstige Methoden für die nachhaltige Echtzeitüberwachung von Wasser- und Abwasserproben in Ländern mit niedrigem und mittlerem Einkommen als Frühwarnung vor neu auftretenden Krankheitsausbrüchen benötigt. Dadurch werden sie vor den schwerwiegenden sozioökonomischen Auswirkungen der Viruspandemie geschützt.Kostengünstige elektrochemische Biosensoren für Nukleinsäuren könnten eine vielversprechende potenzielle Lösung für diesen ungedeckten Bedarf darstellen.Viele dieser DNA-Biosensoren funktionieren durch die Tatsache, dass komplementäre DNA-Stränge auf der Elektrode immobilisiert sind Oberfläche und hybridisieren, wenn eine passende Sequenz in der Probe vorhanden ist. Dieses kann dann durch verschiedene elektrochemische Techniken unter Verwendung von Redox-Mediatoren wie Kaliumeisen/Ferrocyanid in ein Signal umgewandelt werden. Methylenblau (MB) ist ein solches redoxaktives Molekül, das hat Es wurde berichtet, dass es zusätzlich zu seiner eher unspezifischen Bindung an einzelsträngige DNA in doppelsträngige DNA (dsDNA) interkaliert5,6. Die interkalierende Natur von MBs zur Bildung von MB-DNA-Komplexen macht sie zu einer beliebten Wahl als Redoxmediatoren in mehreren elektrochemischen DNA Sensorkonfigurationen5,6,7,8,9.Obwohl die Interkalation von MB in DNA unspezifisch ist und die Spezifität dieses elektrochemischen Sensors weitgehend von der Reinheit der für die PCR oder isotherme Amplifikation verwendeten Primer abhängt, eignet er sich gut für die Durchführung realer -time elektrochemische qPCR oder isothermische Fluoreszenzverstärkung als Alternative zur DNA-Konzentrationsmessung 9 .In einer solchen Implementierung Won et al.Die Oberfläche von Goldelektroden wurde mit 6-Mercapto-1-Hexanol (MCH) für Echtzeit modifiziert Messung von PCR-Amplikons mit MB unter Verwendung von differentieller Pulsvoltammetrie (DPV)9. In anderen Fällen Ramirez et al. Nachweis von SARS-CoV-2 in Abwasser durch RT-LAMP-Reaktion unter Verwendung von MB mit siebgedruckten Elektroden verwendet als in situ-Elektroden in einer mikrofluidischen PCR-Plattform zur elektrochemischen Erkennung von Amplikons während Reaktionen 8. Alle diese Studien erfordern eine Oberflächenmodifikation der Elektroden, was erhöhte Produktions- und Betriebskosten aufgrund spezieller Lageranforderungen für die Stabilität dieser funktionalisierten Elektroden impliziert.
Schema des Arbeitsablaufs für den elektrochemischen Nachweis von Amplikons, die aus konzentrierten Viruspartikeln in Seewasserproben gewonnen wurden.
Wir haben kürzlich die elektrochemische Erfassung von SARS-CoV-2-Amplikons mit kostengünstigen Leiterplattenelektroden (PCB) auf der Grundlage von DPV und zyklischer Voltammetrie (CV) demonstriert, die durch die Adsorption von MB-DNA-Komplexen auf der Oberfläche von nicht modifizierten Elektroden induziert werden Strom11.Wir berichten, dass längere DNA-Fragmente (N1-N2, \({943}\, \hbox), die mit den von CDC empfohlenen N1-Vorwärts- und N2-Rückwärtsprimern gebildet wurden, im Vergleich zu kürzeren Fragmenten {bp}\)) eine bessere Linearität in der Sensorantwort zeigten ( N1, \(72\,\hbox {bp}\)) gebildet unter Verwendung von N1-Vorwärts- und N1-Rückwärtsprimersätzen. Diese Studien werden unter Verwendung von DNA-Verdünnungen berichtet, die in Nuklease-freiem Wasser hergestellt wurden. Die Plattform wurde auch zum Nachweis von SARS-CoV verwendet -2 Amplikons in simulierten Abwasserproben (erhalten durch Spiken von Gesamt-RNA-Proben mit SARS-CoV-2-RNA). Da RNA während der Isolierung und der nachgeschalteten Verarbeitung scherempfindlich ist,12,13 ist es schwierig, längere Fragmente mit dieser heterogenen Probe zu amplifizieren. Daher ist die Demonstration der elektrochemischen Erfassung des SARS-CoV-2-Amplikons im Abwasser auf das kürzere \(72\,\hbox {bp}\) N1-Fragment beschränkt.
In dieser Arbeit untersuchten wir die Machbarkeit der PCB-basierten elektrochemischen ENIG-Erfassung von Phi6-Phagen, konzentriert und isoliert aus Seewasserproben (Abb. 1). Phi6-Phagen sind in der Größe (80–100 nm) mit SARS-CoV-2 und vergleichbar haben auch eine Lipidmembran und ein Spike-Protein. Aus diesen Gründen ist der Bakteriophage Phi6 ein beliebter Ersatz für SARS-CoV-2 und andere umhüllte pathogene RNA-Viren14,15. Aus Phagenpartikeln isolierte RNA wurde als Matrize für die anschließende cDNA-Synthese verwendet PCR, um zwei DNA-Fragmente mit einer Länge von 117 und 503 Basenpaaren zu erhalten. Angesichts der Herausforderung, \(943\,\hbox {bp}\) N1-N2-Fragmente in unserer früheren Arbeit zu amplifizieren, zielen wir auf Fragmente mittlerer Länge (\(117 \,\hbox {bp}\) und \(503 \,\hbox {bp}\)), basierend auf verfügbaren Primern. Die elektrochemische Sensorreaktion wurde systematisch über einen weiten Konzentrationsbereich (\({10}\,{ \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) bis \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) Für beide Fragmente in B. das Vorhandensein von MB, wurde die Wirkung von Salz auf die Sensorreaktion durch spektrophotometrische Messungen charakterisiert und kreuzvalidiert. Die Hauptbeiträge dieser Arbeit sind wie folgt:
Die Länge der DNA-Fragmente und das Vorhandensein von Salz in der Probe wirken sich stark auf die Empfindlichkeit aus.Unsere Ergebnisse zeigen, dass die elektrochemische Aktivität von verschiedenen Mechanismen der Wechselwirkung von MB, DNA und dem Sensor in der voltammetrischen Antwort abhängig ist, je nach DNA-Konzentration und Länge, wobei längere Fragmente eine höhere Empfindlichkeit zeigen, obwohl Salz einen negativen Effekt auf elektrostatische Wechselwirkungen zwischen ihnen hat MB und DNA.
DNA-Konzentration bestimmt den Mechanismus der MB-DNA-Wechselwirkung in unmodifizierten Elektroden Wir zeigen, dass verschiedene Mechanismen der MB-DNA-Wechselwirkung von der DNA-Konzentration abhängen. Bei DNA-Konzentrationen unter einer kleinen Menge von \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), beobachteten wir, dass die elektrochemische Stromreaktion hauptsächlich durch die Adsorption von MB-DNA an der Elektrode bestimmt wurde, während bei niedrigeren Konzentrationen die elektrochemische Stromreaktion bei hohen DNA-Konzentrationen durch die sterische Hemmung von Redox bestimmt wurde Aktivität aufgrund der MB-Insertion zwischen DNA-Basenpaaren.
ENIG PCB-basierte elektrochemische Erkennung viraler Nukleinsäuren in Seewasserproben Die Beobachtungen wurden durch elektrochemische Detektion von mit Phi6 versetzten \(503\,\hbox {bp}\) DNA-Fragmenten validiert, die aus Wasserproben von Powai Lake, IIT Mumbai Campus, gewonnen wurden Ergebnisphage.
Niedrige Implementierungskosten und Potenzial für die Integration in vollautomatische Überwachungssysteme, Oligonukleotide oder Aptamere auf Elektroden mit längerer Haltbarkeit.
Phage Phi6 ist ein umhülltes dsRNA-Virus der Cytoviridae-Familie, das Pseudomonas syringae infiziert \,\hbox {Kb}\)) und L (\ (6,37\ ,\hbox{Kb}\))16,17. Da der Phi6-Phage einen nicht pathogenen BSL-1-Pseudomonas-Stamm infiziert, ist seine Verwendung sicher und kann leicht im Labor gezüchtet werden. Der Phage Phi6 und sein Wirt Pseudomonas syringae wurden vom Felix d'Herelle Reference Centre for Bacterial Viruses, Laval University, Kanada, erworben (Referenzzentrums-Katalognummern sind HER-102 bzw. HER-1102). Der Phi6-Phage und sein Wirt wurden gemäß den Anweisungen des Referenzzentrums wiederbelebt. Der Phage Phi6 wurde durch Plattenlyse und Elution gereinigt, um Endtiter mit \(\about 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { ml}}\) (plaquebildende Einheiten/Milliliter). RNA wurde aus gereinigten Phagenpartikeln unter Verwendung des GenElute™ Universal Total RNA Purification Kit (Sigma-Aldrich) gemäß den Anweisungen des Herstellers isoliert. Kurz gesagt, eine gereinigte Phagen-Phi6-Suspension\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) wurde lysiert und das Lysat wurde auf eine Zentrifugationssäule geladen, damit RNA an die Harzsäule binden kann. Die RNA wird dann in der Elutionslösung eluiert \({ 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) im Kit enthalten. Schätzen Sie die RNA-Konzentration durch Absorption bei \(260\,\hbox {nm}\). RNA wurde in Aliquots in \ ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) bis zur weiteren Verwendung.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) Das iScript cDNA Synthesis Kit (Bio -Rad Laboratories) wurde als Matrize für die cDNA-Synthese gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Kurz gesagt besteht eine cDNA-Synthesereaktion aus 3 Schritten: Priming bei \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min} }\) , Rücktranskription von \({20}\,{\hbox {min}}\) bei \({46}\,{^{\circ }\hbox {C}}\), und umgekehrt Der Rekorder steht in \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) für \({1}\,{\hbox {min }}\). Beim Lauf auf einem 1 % Agarosegel zeigte die cDNA drei Banden, die den erwarteten drei RNA-Fragmenten entsprachen (Daten nicht gezeigt). Die folgenden Primer wurden verwendet, um zwei DNA-Fragmente mit einer Länge von 117 und 503 bp zu amplifizieren, Verwendung von cDNA als Template für PCR in einem miniPCR® mini8 Thermocycler:
Die Primer für \(117\,\hbox {bp}\) und \(503\,\hbox {bp}\) entsprechen 1476-1575 Nukleotiden des M-Segments und 458-943 Nukleotiden des L-Segments, jeweils Säure .Alle amplifizierten PCR-Produkte wurden auf 1 % Agarosegelen einer Elektrophorese unterzogen, und die amplifizierte Ziel-DNA wurde unter Verwendung des GeneJET-Gelextraktionskits (Thermo Fisher Scientific) gereinigt.
Ein See auf dem Campus des IIT Mumbai (Powai Lake, Powai, Mumbai) wurde verwendet, um Phagenpartikel hinzuzufügen. Das Seewasser wurde zum Entfernen durch eine \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\)-Membran gefiltert suspendierte Partikel, und dann wurde der Phi6-Phage hinzugefügt. Fügen Sie \({1}\,{\hbox {ml}}\) von \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} hinzu. \) zu \( {100}\ ,{\hbox {ml}}\) gefiltertem Seewasser, in \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\). Ein kleines Aliquot war reserviert für die Messung der Viruslast durch Plaque-Assay. Wir haben zwei verschiedene Methoden getestet, um gespikte Phi6-Viruspartikel zu konzentrieren: (1) die Aluminiumhydroxid-Adsorptions-Präzipitationsmethode,19 die für die Konzentration mehrerer umhüllter RNA-Viren aus Umweltproben validiert wurde, und (2) ) Die auf Polyethylenglykol (PEG) basierende Viruskonzentrationsmethode wurde von Flood et al.20. Da festgestellt wurde, dass die Rückgewinnungseffizienz der PEG-basierten Methode besser ist als die der Aluminiumhydroxid-Methode, wurde die PEG-basierte Methode verwendet, um Phi6-Partikel aus Seewasserproben zu konzentrieren.
Die verwendete PEG-Methode war wie folgt: PEG 8000 und \(\hbox {NaCl}\) wurden zu mit Phi6 versetzten Seewasserproben gegeben, um 8 % PEG 8000 und \(0,2\,\hbox {M} \) \( \ hbox {NaCl}\).Proben wurden auf einem Schüttler inkubiert\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), dann zentrifugiert bei \(4700 \,\hbox {g}\) ist \({45}\,{\hbox {min}}\). Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in \({1}\, {\hbox {ml}}\) im gleichen Überstand. Alle Spiking- und Viruskonzentrationsexperimente wurden dreifach durchgeführt. Nach der Konzentration wurde ein kleines Aliquot für die Messung der Wiederfindungseffizienz durch Plaque-Assay reserviert. RNA wurde wie zuvor beschrieben isoliert und eluiert im Kit-gelieferten Elutionspuffer\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\). hbox {l}}\) RNA wird für alle drei verwendet, unabhängig von ihrer Konzentration. cDNA-Synthese von Proben. Die cDNA-Synthese wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt wurde als Template für \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR für 35 Zyklen verwendet, um \(117\,\hbox {bp}\) und \(503\,\hbox { bp}\)-Fragmente. Diese Proben sind als "1:1", dh ohne Verdünnung, dargestellt. Als Negativkontrolle wurde eine No-Template-Kontrolle (NTC) angesetzt, während eine cDNA, die unter Verwendung von aus gereinigtem Phagen isolierter RNA synthetisiert wurde, angesetzt wurde als Matrize für eine positive Kontrolle (PC). Quantitative PCR (qPCR) wurde in einem Stratagene Mx3000P RT-PCR-Gerät unter Verwendung von Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies) durchgeführt. Die Reaktionen wurden wie zuvor in dreifacher Ausführung angesetzt beschrieben. Die Zyklusschwelle (Ct) wurde für alle Proben aufgezeichnet. Außerdem wurden die verdünnten Proben unter Verwendung von cDNA 1:100 verdünnt in gefiltertem Seewasser als \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) verwendet \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR für 35 Zyklen. Diese Proben werden als „1:100″ dargestellt.
Die PCB-Elektroden werden mit einem handelsüblichen, kostengünstigen Electroless Nickel Immersion Gold (ENIG)-Verfahren hergestellt, ohne dass eine zusätzliche Vergoldung erforderlich ist Piranha-Lösung oder zyklische Schwefelsäure-Voltammetrie werden nicht empfohlen, da sie ein Ablösen der dünnen Goldschicht (Dicke \(\approx\) \(100\,\hbox {nm }\)) verursachen und die darunter liegenden Kupferschichten freilegen können, die anfällig sind vor Korrosion 21, 22, 23, 24, 25. Reinigen Sie deshalb die Elektroden mit einem fusselfreien, mit IPA angefeuchteten Tuch. Die zu untersuchende Probe wurde mit \({50}\,{\upmu \hbox {M} }\) MB in \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) zum einfachen Einfügen. In unserer bisherigen Arbeit , beobachteten wir, dass die Empfindlichkeit und Linearität des Sensors durch Erhöhen der MB-Konzentration 11 verbessert wurden. Basierend auf Optimierungen, die in unserer früheren Arbeit berichtet wurden, verwendeten wir \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB Konzentrationen zum Einbetten von DNA in dieser Studie. Der elektrochemische Nachweis von doppelsträngiger DNA (ds-DNA) kann mit anionischen oder kationischen Interkalatoren erreicht werden. Obwohl anionische Interkalatoren DNA mit besserer Selektivität detektieren, erfordern sie eine Inkubation über Nacht, was zu längeren Detektionszeiten führt Andererseits erfordern kationische Interkalatoren wie MB kürzere Inkubationszeiten, etwa \({1}\,{\hbox {h}}\) für den elektrochemischen Nachweis von ds-DNA6. Bei jeder Messung wird die zu testende Probe auf die aufgetragen Elektrode\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), dann mit einem mit IPA angefeuchteten Lappen reinigen, bevor Sie mit einer weiteren Probe fortfahren.eine Messung. Jede Probe wurde an 5 verschiedenen Elektroden getestet, sofern nicht anders angegeben. DPV- und CV-Messungen wurden mit einem PalmSens Sensit Smart-Potentiostaten durchgeführt, und die PSTrace-Software wurde für die Potentiostatenkonfiguration und Datenerfassung, einschließlich Spitzenstromberechnungen, verwendet. Die folgenden Einstellungen werden verwendet für DPV- und CV-Messungen:
DPV: Gleichgewichtszeit = \(8\,\hbox {s}\), Spannungsschritt = \(3\,\hbox {mV}\), Impulsspannung = \(25\,\hbox {mV}\) , Pulsdauer = \(50\,\hbox {ms}\), Abtastrate = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: Gleichgewichtszeit = \(8\,\hbox {s}\), Spannungsschritt = \(3\,\hbox {mV}\), Sweeprate = \({300}\,\hbox {mV/ s }\)
Spitzenströme erhalten aus Voltammogrammen von DNA komplexiert mit \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
DPV- und CV-Voltammogramme wurden auf ENIG-PCB-Elektroden \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB erhalten, die mit DNA komplexiert waren (bei Konzentrationen von 10–\({20}\,{\ hbox {ng }/{\upmu \hbox {l}}}\) also 0,13–\({0,26}\,{\upmu \hbox {M}}\) für \(117\,\hbox {bp}\ ) und 0,03 –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) für \(503\,\hbox {bp}\)). Repräsentative Voltammogramme sind in Abbildung S1 in den ergänzenden Informationen dargestellt. Abbildung 2 zeigt die Ergebnisse von DPV- und CV-Messungen (Spitzenstrom) mit gelgereinigten PCR-Produkten. Im Vergleich zu CV-Messungen zeigen DPV-Messungen eine höhere Empfindlichkeit (Strom als Funktion der DNA-Konzentration), da die kapazitiven Hintergrundströme bei CV-Messungen Faradaysche Ströme verbergen 26 .Die Daten Für jede Box im Boxplot sind Messungen von 5 Elektroden enthalten. Alle Messungen verwenden denselben Elektrodensatz, um Messfehler aufgrund von Schwankungen von Elektrode zu Elektrode zu vermeiden , länger (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ im Vergleich zu \(117) )-Fragment Die Adsorption des MB-DNA-Komplexes erleichtert den Ladungstransfer auf der Elektrode, was zur Erhöhung des Spitzenstroms beiträgt. Andere Studien haben die Wirkung der Oligonukleotidgröße und -sequenz auf die MB-DNA-Interkalation gezeigt27,28,29,30. Das Guanin -Cytosin (GC)-Gehalt der beiden Amplikons (\(117\,\hbox {bp}\) und \(503\,\hbox {bp}\)) betrug ungefähr 50 %, was darauf hinweist, dass die Beobachtung auf die Differenz zurückzuführen ist zur Amplikonlänge. Für höhere DNA-Konzentrationen (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), für \(503\,\hbox {bp} \) und \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) für \(117\,\hbox {bp}\)), beobachten wir zwei Amplifikationen The Spitzenströme der Subs werden sowohl bei DPV- als auch bei CV-Messungen reduziert. Dies liegt daran, dass MB gesättigt ist und zwischen Basenpaare der DNA interkaliert, was zu einer sterischen Hemmung der Redoxaktivität der reduzierbaren Gruppe in MB führt31,32.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV。
In PCR-Mastermixen vorhandene Salze stören die elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen MB und DNA, sodass durch Hinzufügen von \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) mit \({50} \,{\ upmu \hbox {M}}\) MB-Gel-gereinigtes Produkt, um die Wirkung von Salz auf die MB-DNA-Wechselwirkung zu untersuchen. Wie in Abbildung 3 gezeigt, beobachteten wir, dass für höhere DNA-Konzentrationen (\(>{2}\,{\ hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) und \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) für \(117\,\hbox {bp} \)), in DPV und CV Die Zugabe von Salz beeinflusste die Messungen nicht signifikant (siehe Abbildung S2 in den ergänzenden Informationen für repräsentative Voltammogramme). Bei niedrigeren DNA-Konzentrationen reduziert die Zugabe von Salz die Empfindlichkeit stark, was zu keiner signifikanten Änderung des Stroms mit der DNA-Konzentration führt. Ähnliche negative Auswirkungen von Salz auf MB-DNA-Interaktionen und Interkalation wurden zuvor von anderen Forschern berichtet33,34.\(\hbox { Mg}^{2+}\)-Kationen binden an das negative Phosphatrückgrat der DNA und behindern dadurch die elektrostatische Wechselwirkung zwischen MB und DNA. Bei höheren DNA-Konzentrationen führt die sterische Hemmung redoxaktiver MBs zu niedrigeren Spitzenströmen, also zu elektrostatischen Wechselwirkungen beeinflussen die Sensorantwort nicht wesentlich. Der entscheidende Punkt ist, dass dieser Biosensor besser geeignet ist, höhere DNA-Konzentrationen (selten \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) oder höher) zu erkennen, für die vollautomatische Verarbeitung von Umweltwasserproben, bei denen eine Gelreinigung von PCR-Produkten möglicherweise nicht durchführbar ist.
Fläche unter der Absorptionskurve für den Wellenlängenbereich 600–700 \(\hbox {nm}\) für verschiedene Konzentrationen von DNA komplexiert mit \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) mit und ohne Salz (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) mit und ohne Salz (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) DNA-Konzentrationen entsprechend \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB-Proben Keine DNA.
Um die obigen Ergebnisse weiter zu verifizieren, führten wir optische Messungen mit einem UV/Vis-Spektrophotometer (Thermo Scientific Multiskan GO) durch, die Proben \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) wurden jeweils verwendet Messung. Die Absorptionssignatur nimmt mit zunehmender DNA-Konzentration ab, wie aus dem Trend der Fläche unter der Absorptionskurve für den Wellenlängenbereich \(600\,\hbox {nm}\) bis \(700\,\hbox { nm}\), wie in Abb. 4 gezeigt (Absorptionsspektrum in Abb. S3 in den ergänzenden Informationen). Für Proben mit DNA-Konzentrationen von weniger als \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), gab es keinen signifikanten Unterschied in der Aufnahme zwischen DNA-haltigen und reinen MB-Proben (für \(503\,\hbox {bp}\) und \(117\,\hbox {bp}\ Fragmente der Länge )), was auf das Fehlen einer sterischen Hemmung von redoxaktivem MB hinweist. Bei höheren DNA-Konzentrationen beobachteten wir eine allmähliche Abnahme des Absorptionssignals und stellten eine geringere Abnahme der Absorption in Gegenwart von Salz fest. Diese Ergebnisse wurden molekularen zugeschrieben Wechselwirkungen und sterische Hemmung mit Basenstapelung in DNA-Hybriden. Unsere Ergebnisse stimmen mit Berichten in der Literatur über spektroskopische Studien zur MB-DNA-Interkalation überein, die Hypochromatizität mit reduzierten Energieniveaus in \(\pi\)–\(\pi ^*\ ) elektronische Übergänge aufgrund von Interkalationsschichten 36, 37, 38.
Agarose-Gelelektrophorese des Phagen Phi6: PCR-Produkte der Länge \(117\,\hbox {bp}\) und \(503\,\hbox {bp}\) aus Seewasserproben. M-DNA-Marker;NTC-no-Template-Kontrolle, Primer, die entsprechende Amplikons enthalten;PC-Positivkontrolle;1, 2, 3-unverdünnte (1:1) gespikte Seewasserproben in dreifacher Ausfertigung. Eine Bande ist bei \(\about 50\,\hbox {bp}\) aufgrund von unbenutzten Oligonukleotiden in \(503\,\ hbox {bp}\) Spur.
Wir bewerteten den Nutzen des Sensors anhand von Wasserproben aus Powai Lake, die mit Phi6-Phagen gespickt waren. ml}}\), während die aus gereinigten Phagensuspensionen isolierte RNA auf \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) mit einer Wiederfindungseffizienz von ungefähr 1 geschätzt wurde %.RNA wurde revers in cDNA transkribiert und als Matrize für PCR und qPCR verwendet. Die Produktgröße wurde durch Agarose-Gelelektrophorese (Abbildung 5) vor dem Testen mit dem Sensor bestätigt. Diese Proben sind nicht gelgereinigt und enthalten daher alle Komponenten der PCR als sowie die interessierenden Amplikons. Die während der qPCR aufgezeichneten Ct-Werte (Tabelle 1) korrelierten mit der Konzentration der RNA, die aus den entsprechenden dotierten Wasserproben isoliert wurde. Der Ct-Wert zeigt die Anzahl der Zyklen, die für das Fluoreszenzsignal erforderlich sind Schwellen- oder Hintergrundsignal überschreiten. Höhere Ct-Werte weisen auf niedrigere Templatkonzentrationen hin und umgekehrt. Die Ct-Werte der NTC-Proben waren so hoch wie erwartet. Der Unterschied in \(\ungefähr 3\) Ct-Werten zwischen die Positivkontrolle und die Testprobe weisen ferner darauf hin, dass jede Testprobe im Vergleich zur Positivkontrolle etwa 1 % Template enthält. Wir haben bereits besprochen, dass längere Amplikons zu einer besseren Empfindlichkeit führen. Die Amplifikation längerer Fragmente, die aus heterogenen Umweltproben isoliert wurden, ist angesichts der Nachteile eine Herausforderung mit geringer Viruskonzentration und RNA-Abbau. Mit unserem Virusanreicherungs- und PCR-Amplifikationsprotokoll konnten wir das \(503\,\hbox {bp}\)-Fragment jedoch erfolgreich für die elektrochemische Erfassung amplifizieren.
Abbildung 6 zeigt die Ergebnisse des elektrochemischen Sensors des \(503\,\hbox{bp}\)-Fragment-Amplikons, beide unter Verwendung von unverdünnter cDNA als Matrize (1:1) und 100-fach verdünnter cDNA als Matrize (1:100), durchgeführte PCR , im Vergleich zu NTC und PC (siehe Abbildung S4 in den ergänzenden Informationen für repräsentative Voltammogramme). Jedes Kästchen im Boxplot in Abbildung 6 enthält Messungen von drei Proben an 5 Elektroden. Dieselben Elektroden wurden verwendet, um alle Proben zu messen, um Fehler aufgrund der Elektrode zu vermeiden -zu-Elektrode-Variation. Im Vergleich zu CV-Messungen zeigen DPV-Messungen eine bessere Auflösung, um Test- und PC-Proben von NTCs zu unterscheiden, da, wie bereits erwähnt, faradaysche Ströme aufgrund kapazitiver Hintergrundströme in letzteren verborgen sind. Bei längeren Amplikons haben wir dies beobachtet Die Negativkontrolle (NTC) führte zu höheren CV- und DPV-Spitzenströmen im Vergleich zur Positivkontrolle, während positive und unverdünnte Testproben ähnliche Spitzenhöhen der DPV-Spitzenströme zeigten. Die gemessenen Mittel- und Medianwerte für jede unverdünnte (1:1 ) Testprobe und PC können vom Sensorausgang für die NTC-Probe klar aufgelöst werden, während die Auflösung für die 1:100 verdünnte Probe weniger ausgeprägt ist. Bei einer 100-fachen Verdünnung von cDNA haben wir während der Gelelektrophorese keine Banden beobachtet (Spuren in Abbildung 5 nicht gezeigt), und die entsprechenden DPV- und CV-Spitzenströme waren ähnlich denen, die für NTC erwartet wurden. Die Ergebnisse für das \(117\,\hbox {bp}\)-Fragment sind in den ergänzenden Informationen gezeigt Die Kontrolle induzierte aufgrund der Adsorption von freiem MB an der Elektrode und der Wechselwirkung des MB mit dem einzelsträngigen Primer-Oligonukleotid eine elektrochemische Reaktion vom PCB-Sensor Spitzenstrom der Testprobe verglichen mit dem Spitzenstrom der Negativkontrolle, um eine differentielle (relative) Messung zu erreichen39,40 um die Testprobe als positiv oder negativ zu klassifizieren.
(a) DPV und (b) CV-Spitzenstrom für den elektrochemischen Nachweis von \(503\,\hbox {bp}\)-Fragmenten in Seewasserproben. Die Testproben wurden dreifach gemessen und mit Nicht-Matrizen-Kontrollen (NTC) und verglichen positive Kontrollen (PC).
Unsere Ergebnisse veranschaulichen verschiedene Mechanismen, die die Leistung elektrochemischer Sensoren für Amplikons unterschiedlicher Länge für verschiedene DNAs beeinflussen, wobei die Konzentrationen durch optische Messungen mit einem UV/Vis-Spektrophotometer verifiziert wurden. Unsere Beobachtungen unterstreichen die Erkenntnis, dass längere DNA-Fragmente bis zu \(\approx\) \(500\,\hbox {bp}\) mit höherer Empfindlichkeit nachgewiesen werden kann und dass das Vorhandensein von Salz in der Probe keinen Einfluss auf die höhere Empfindlichkeit hat (selten \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) und höher). Darüber hinaus untersuchten wir die Wirkung verschiedener Arten von Proben, darunter gelgereinigte Amplikons mit und ohne Salzzusatz und die Zugabe von Seewasserproben bei DPV- und CV-Messungen.Wir haben festgestellt, dass DPV eine bessere Auflösung bietet, da der kapazitive Hintergrundstrom auch die CV-Messung beeinflusst und sie weniger empfindlich macht.
Die Amplifikation längerer Fragmente hängt von der Integrität der viralen genomischen RNA ab. Mehrere Studien haben gezeigt, dass die Amplifikation längerer Fragmente aufgrund des Abbaus der RNA in der Umgebung und der Möglichkeit des Spleißens während der Isolierung nicht immer effizient ist11,41,42,43,44 .Wir beobachteten, dass die PEG-basierte Viruskonzentrationsmethode bei der Konzentration von Phagen Phi-6, die in Seewasserproben versetzt wurden, effektiver war als die Aluminiumhydroxid-basierte Viruskonzentrationsmethode. Die Fähigkeit, lange DNA-Fragmente nachzuweisen, erwies sich als Überwindung der Anforderung für Multiplex-PCR um mehrere Vorlagen mit kürzerer Länge zu amplifizieren und die Möglichkeit einer Kreuzspezifität zu verringern.
Biologische Proben sind knapp, daher muss ein Biosensor entwickelt werden, der nur minimale Proben zum Testen benötigt. Die in dieser Studie verwendeten ENIG-PCB-Elektroden erforderten nur \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ ) Proben zum Testen, um den wirksamen Bereich der Elektroden abzudecken. Darüber hinaus kann dieselbe Elektrode nach der Reinigung vor der Abgabe der nächsten Probe wiederverwendet werden. Amplifizierte Proben erfordern keine Zugabe von anderen Chemikalien als Methylenblau, was kostengünstig ist und häufig verwendete Chemikalie. Da jede Elektrode etwa 0,55 $ (oder 40 INR) in der Herstellung kostet, kann dieser Biosensor eine kostengünstige Alternative zu bestehenden Detektionstechnologien sein. Tabelle 2 zeigt einen Vergleich dieser Arbeit mit anderen Sensoren, über die seit langem in der Literatur berichtet wird DNA-Fragmente in heterogenen Proben.
Angesichts der Tatsache, dass MB-basierte elektrochemische Nachweisprotokolle auf der Spezifität der PCR beruhen, ist eine wesentliche Einschränkung dieser Methode das Potenzial für eine unspezifische Amplifikation in heterogenen Proben wie Abwasser und Seewasser oder die Verwendung von Primern mit geringer Reinheit elektrochemische Nachweismethoden für den DNA-Nachweis von ungereinigten PCR-Produkten unter Verwendung von unmodifizierten ENIG-PCB-Elektroden, ist es notwendig, Fehler besser zu verstehen, die durch nicht verwendete dNTPs und Primer eingeführt werden, und Reaktionsbedingungen und Assay-Protokolle zu optimieren. Zusätzliche physikalisch-chemische Parameter wie pH, Temperatur und biologische Der Sauerstoffbedarf (BSB) der Wasserprobe muss möglicherweise ebenfalls gemessen werden, um die Genauigkeit der Messung zu verbessern.
Zusammenfassend schlagen wir einen kostengünstigen elektrochemischen ENIG-PCB-Sensor zum Virusnachweis in Umweltproben (Seewasser) vor. Im Gegensatz zu immobilisierten Oligonukleotidelektroden oder kundenspezifischen Substraten für die DNA-Erkennung, die eine kryogene Lagerung erfordern, um die Empfindlichkeit aufrechtzuerhalten,53,54 verwendet unsere Technik unmodifiziertes PCB Elektroden mit längerer Haltbarkeit und ohne spezifische Lageranforderungen und daher geeignet für die Entwicklung von Messlösungen mit automatisierter Probenverarbeitung, die in LMICs eingesetzt werden. Der Biosensor verwendet kostengünstige DNA-interkalierende Redoxfarbstoffe (MB) zum schnellen Nachweis von Ziel-Amplikons. Die unspezifische Amplifikation Die in Umweltproben übliche verringert die Spezifität dieses Sensorverfahrens aufgrund der unspezifischen Bindung von MBs an einzel- und doppelsträngige Oligonukleotide. Daher hängt die Spezifität dieses Tests von der Optimierung von Primern und PCR-Reaktionsbedingungen ab. Darüber hinaus ist der CV und DPV-Spitzenströme, die von den getesteten Proben erhalten wurden, sollten relativ zu den Antworten interpretiert werden, die von der Negativkontrolle (NTC) für jeden Test erhalten wurden kostengünstige Lösung, die Proben sammeln und analysieren und die Ergebnisse drahtlos an das Labor zurücksenden kann .
Cashdollar, J. & Wymer, L. Methoden zur anfänglichen Konzentration von Viren aus Wasserproben: eine Überprüfung und Metaanalyse neuerer Studien.J.Application.microorganism.115, S. 1-11 (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL Durch Wasser übertragene Viren: Barrieren für sicheres Trinkwasser.PLoS Pathogens.11, E1004867 (2015).
Shrestha, S. et al. Abwasserepidemiologie für eine kostengünstige groß angelegte Überwachung von COVID-19 in Ländern mit niedrigem und mittlerem Einkommen: Herausforderungen und Chancen. Water 13, 2897 (2021).
Palecek, E. & Bartosik, M. Nucleic acid electrochemistry.Chemical.Rev.112, 3427–3481 (2012).
Tani, A., Thomson, AJ & Butt, JN Methylenblau als elektrochemischer Diskriminator von einzel- und doppelsträngigen Oligonukleotiden, die auf Goldsubstraten immobilisiert sind. Analyst 126, 1756–1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ Comparison of Cation and Anion Intercalators for Electrochemical Transduction of DNA Hybridization by Long-Range Electron Transfer.Electrochemistry.comminicate.6, 648–654 (2004).
Wong, EL & Gooding, JJ Ladungstransfer durch DNA: ein selektiver elektrochemischer DNA-Biosensor.anus.Chemical.78, 2138–2144 (2006).
Fang, TH et al.Real-time PCR microfluidic device with concurrent electrochemical detection.biological sensor.Bioelectronics.24, 2131–2136 (2009).
Win, BY et al.Studie des Signalisierungsmechanismus und Leistungsüberprüfung eines elektrochemischen Echtzeit-PCR-Systems basierend auf der Wechselwirkung von Methylenblau mit DNA.Analyst 136, 1573–1579 (2011).
Ramirez-Chavarria, RG et al.Loop-mediated isotherm amplification-based Electrochemical Sensor for Detection of sars-cov-2 in wastewater probes.J.Environment.Chemical.Britain.10, 107488 (2022).
Kumar, M. et al. Elektrochemische Erfassung von SARS-CoV-2-Amplikons mit PCB-Elektroden. Der Sensor wird aktiviert. B Chemistry.343, 130169 (2021).
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. & Yoshida, H. Effizienter Nachweis von SARS-CoV-2-RNA in der festen Fraktion von Abwasser.Wissenschaft.Allgemeine Umgebung.763, 144587 (2021).
Alygizakis, N. et al.Analytical Methods for SARS-CoV-2 Detection in Wastewater: Protocol and Future Perspectives.TraC trending anal.Chemical.134, 116125 (2020).
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. & Kashtan, N. Überleben des umhüllten Bakteriophagen Phi6 (ein Ersatz für SARS-CoV-2) in verdunsteten Speicheltröpfchen, die auf Glasoberflächen abgelagert werden.science.Rep.10, 1–10 (2020).
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ Umweltpersistenz eines SARS-CoV-2-Surrogates (Phi6) in freilebenden Amöben.J.Wassergesundheit 20, 83 (2021).
Mindich, L. Precise packaging of three genomic fragments of double-stranded RNA bacteriophage\(\varphi\)6.microorganism.Moore.biology.Rev.63, 149–160 (1999).
Pirttimaa, MJ & Bamford, Sekundärstruktur der Verpackungsregion des DH-RNA-Phagen\(\varphi\)6.RNA 6, 880–889 (2000).
Bonilla, N. et al.Phages on the Tap – A fast and efficiency Protocol for Preparation Laboratory Stocks of Bakteriophages.PeerJ 4, e2261 (2016).
Postzeit: 27. Mai 2022