Diolch am ymweld â Nature.com.Mae gan y fersiwn porwr rydych chi'n ei ddefnyddio gefnogaeth gyfyngedig i CSS. I gael y profiad gorau, rydym yn argymell eich bod yn defnyddio porwr wedi'i ddiweddaru (neu ddiffodd modd cydweddoldeb yn Internet Explorer). Yn y cyfamser, i sicrhau cefnogaeth barhaus, byddwn yn arddangos y wefan heb arddulliau a JavaScript.
Mae pwysigrwydd monitro samplau amgylcheddol wedi'i werthfawrogi'n fawr ers dechrau'r pandemig COVID-19, ac mae rhai ymdrechion monitro yn cael eu perfformio gan ddefnyddio'r safon aur, er bod technegau sy'n seiliedig ar qPCR yn ddrud. Gallai biosynhwyryddion DNA electrocemegol fod yn gost-effeithiol. ateb ar gyfer monitro samplau dŵr amgylcheddol mewn gwledydd incwm isel a chanolig.Yn y gwaith hwn, rydym yn dangos y darganfyddiad electrocemegol o amplicons a gafwyd o Phi6 phage wedi'u hynysu o samplau dŵr llyn pigog (sef dirprwy boblogaidd ar gyfer SARS-CoV-2), gan ddefnyddio ENIG i gwblhau electrodau PCB heb addasu wyneb.Roedd yr ymateb synhwyrydd electrocemegol wedi'i nodweddu'n drylwyr ar gyfer dau ddarn DNA o wahanol hyd ( \({117} \, \ hbox {bp} \) a \({503} \, \hbox {bp}\)), a'r effaith halwynau mewn cymysgeddau meistr PCR ar methylene glas (MB)-ryngweithiadau DNA. Mae ein canlyniadau yn dangos bod hyd darnau DNA yn pennu sensitifrwydd electrocemegol yn sylweddol ac yn dangos yn y gwaith hwn bod y gallu i ganfod amplicons hir heb gel puro cynhyrchion PCR yn bwysig ar gyfer mesur samplau dŵr yn y fan a'r lle.Mae datrysiad cwbl awtomataidd ar gyfer llwyth firaol yn argoeli'n dda.
Mae trosglwyddo firws a gludir gan ddŵr wedi'i adnabod fel perygl iechyd cyhoeddus ers y 1940au, gyda'r dystiolaeth gyntaf o drosglwyddo polio a hepatitis E1 a gludir gan ddŵr. Mae Sefydliad Iechyd y Byd (WHO) wedi dosbarthu nifer o bathogenau firaol a gludir gan ddŵr o arwyddocâd iechyd cymedrol i uchel2. mae dulliau canfod yn dibynnu ar dechnegau sy'n seiliedig ar safon aur qPCR, sy'n hynod sensitif a phenodol, ond mae angen personél medrus i brofi yn y labordy gan ddefnyddio offerynnau drud. Fodd bynnag, mewn gwledydd incwm isel a chanolig (LMICs) gydag adnoddau cyfyngedig, dynol mae profion sampl yn debygol o gael blaenoriaeth dros fonitro sampl dŵr amgylcheddol. a thrwy hynny eu hamddiffyn rhag effeithiau economaidd-gymdeithasol difrifol y pandemig firws.Gallai biosynhwyryddion electrocemegol cost-isel ar gyfer asidau niwclëig ddarparu datrysiad potensial addawol i'r angen hwn sydd heb ei ddiwallu. arwyneb a chroesi pan fo dilyniant paru yn bresennol yn y sampl. Yna gellir trosi hwn yn signal gan dechnegau electrocemegol amrywiol gan ddefnyddio cyfryngwyr rhydocs megis haearn potasiwm/fferocyanid.Methylene glas (MB) yw un moleciwl rhydocs-actif o'r fath, sydd wedi adroddwyd ei fod yn cydblethu i mewn i DNA llinyn dwbl (dsDNA) yn ogystal â'i rwymo mwy amhenodol i DNA un edefyn5,6. ffurfweddau synhwyrydd 5,6,7,8,9.Er bod y rhyngosod MB i DNA yn amhenodol, ac mae penodoldeb y synhwyrydd electrocemegol hwn yn dibynnu i raddau helaeth ar burdeb y paent preimio a ddefnyddir ar gyfer PCR neu ymhelaethiad isothermol, mae'n addas iawn ar gyfer gweithredu go iawn. -time electrochemical-seiliedig qPCR neu fflworoleuedd ymhelaethu isothermol fel dewis arall i fesur crynodiad DNA 9 .Mewn un gweithrediad o'r fath, Won et al.The wyneb electrodau aur ei addasu gyda 6-mercapto-1-hexanol (MCH) ar gyfer amser real mesur amplicons PCR gyda MB gan ddefnyddio foltammetreg pwls gwahaniaethol (DPV)9.Mewn achosion eraill, mae Ramirez et al.Canfod SARS-CoV-2 mewn dŵr gwastraff trwy adwaith RT-LAMP gan ddefnyddio MB gydag electrodau electrodau platinwm wedi'u hargraffu â sgrin hefyd wedi cael eu a ddefnyddir fel electrodau in situ mewn llwyfan PCR microfluidic a gynlluniwyd i electrochemically ganfod amplicons yn ystod adweithiau 8 .Mae pob un o'r astudiaethau hyn yn gofyn am addasu wyneb yr electrodau, gan awgrymu costau cynhyrchu a gweithredu cynyddol oherwydd gofynion storio arbennig ar gyfer sefydlogrwydd yr electrodau swyddogaethol hyn.
Sgematig y llif gwaith ar gyfer canfod electrocemegol o amplicons a gafwyd o ronynnau firaol crynodedig mewn samplau dŵr llyn.
Yn ddiweddar, gwnaethom ddangos synhwyro electrocemegol o amplicons SARS-CoV-2 gydag electrodau bwrdd cylched printiedig (PCB) cost isel yn seiliedig ar DPV a foltammetreg cylchol (CV) a achosir gan arsugniad o gyfadeiladau MB-DNA ar wyneb electrodau heb eu haddasu) newidiadau yn ystod oriau brig presennol11.Rydym yn adrodd bod darnau DNA hirach (N1-N2, \({943}\, \hbox) a ffurfiwyd gan ddefnyddio'r paent preimio ymlaen N1 ymlaen a N2 a argymhellir gan CDC o'i gymharu â darnau byrrach {bp}\)) yn dangos llinoledd gwell yn ymateb y synhwyrydd ( N1, \(72\,\hbox {bp}\)) wedi'i ffurfio gan ddefnyddio setiau paent preimio blaen N1 ac N1. Adroddir yr astudiaethau hyn gan ddefnyddio gwanediadau DNA a baratowyd mewn dŵr di-niwcleas. Defnyddiwyd y platfform hefyd i ganfod SARS-CoV -2 amplicons mewn samplau dŵr gwastraff efelychiedig (a geir trwy sbeicio cyfanswm samplau RNA gyda SARS-CoV-2 RNA). Gan fod RNA yn agored i gneifio yn ystod ynysu a phrosesu i lawr yr afon,12,13 mae'n anodd mwyhau darnau hirach gyda'r sampl heterogenaidd hwn. Felly, mae arddangosiad synhwyro electrocemegol o amplicon SARS-CoV-2 mewn dŵr gwastraff wedi'i gyfyngu i'r darn N1 byrrach \(72\,\hbox {bp}\).
Yn y gwaith hwn, buom yn ymchwilio i ymarferoldeb synhwyro electrocemegol ENIG PCB o phage Phi6 wedi'i grynhoi a'i ynysu o samplau dŵr llynnoedd (Ffig. 1). hefyd yn meddu ar bilen lipid a phrotein pigyn.Am y rhesymau hyn, mae bacteriophage Phi6 yn ddirprwy boblogaidd ar gyfer SARS-CoV-2 a firysau RNA pathogenig eraill wedi'u hamgáu14,15.RNA wedi'u hynysu o ronynnau phage fel templed ar gyfer synthesis cDNA ac yna PCR i gael dau ddarn DNA o 117 a 503 o barau sylfaen o hyd. O ystyried yr her o fwyhau \(943\,\hbox {bp}\) darnau N1-N2 yn ein gwaith blaenorol, rydym yn targedu darnau hyd canolraddol (\(117) \, \hbox {bp}\) a \(503 \,\hbox {bp}\)), yn seiliedig ar y paent preimio sydd ar gael. Astudiwyd ymateb y synhwyrydd electrocemegol yn systematig dros ystod crynodiad eang (\({10}\,{) \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) to \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) Ar gyfer y ddau ddarn yn presenoldeb MB, mae effaith halen ar ymateb y synhwyrydd wedi'i nodweddu a'i groes-ddilysu gan fesuriadau sbectroffotometrig. Mae prif gyfraniadau'r gwaith hwn fel a ganlyn:
Mae hyd darn DNA a phresenoldeb halen yn y sampl yn effeithio'n gryf ar sensitifrwydd.Mae ein canlyniadau'n dangos bod gweithgaredd electrocemegol yn dibynnu ar wahanol fecanweithiau o ryngweithio MB, DNA, a'r synhwyrydd yn yr ymateb folwmetrig, yn dibynnu ar grynodiad a hyd DNA, gyda darnau hirach yn dangos sensitifrwydd uwch, er bod halen yn cael effaith negyddol ar ryngweithio electrostatig rhwng MB a DNA.
Crynodiad DNA sy'n pennu mecanwaith rhyngweithiad MB-DNA mewn electrodau heb eu haddasu Dangoswn fod gwahanol fecanweithiau rhyngweithiad MB-DNA yn dibynnu ar grynodiad DNA. {l}}}\), gwelsom fod yr ymateb cerrynt electrocemegol yn cael ei bennu'n bennaf gan arsugniad MB-DNA ar yr electrod, tra ar grynodiadau is Mewn crynodiadau DNA uchel, penderfynwyd yr ymateb cerrynt electrocemegol gan ataliad sterig rhydocs gweithgaredd oherwydd mewnosodiad MB rhwng parau sylfaen DNA.
Synhwyro Electrocemegol Seiliedig ar PCB ENIG o Asidau Niwcleig Feirysol mewn Samplau o Ddŵr Llyn Dilyswyd yr arsylwadau trwy ganfod electrocemegol o ddarnau DNA a ychwanegwyd Phi6 \(503\,\hbox {bp}\) a gafwyd o samplau dŵr o Lyn Powai, Campws IIT Mumbai Ffage canlyniad.
Cost gweithredu isel a'r potensial ar gyfer integreiddio i systemau monitro cwbl awtomataidd, oligonucleotides neu aptamers ar electrodau ag oes silff hirach.
Mae Phage Phi6 yn firws dsRNA wedi'i amgáu o'r teulu Cytoviridae sy'n heintio Pseudomonas syringae. Mae genom Phi6 phage yn bodoli ar ffurf 3 darn: S (\(2.95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4.07) \,\hbox {Kb}\)) ac L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\))16,17.Gan fod y phage Phi6 yn heintio straen Pseudomonas BSL-1 nad yw'n bathogenaidd, mae'n ddiogel i'w ddefnyddio a gellir eu tyfu'n hawdd yn y labordy. Prynwyd Phage Phi6 a'i gwesteiwr Pseudomonas syringae o Ganolfan Gyfeirio Felix d'Herelle ar gyfer Firysau Bacteraidd, Prifysgol Laval, Canada (rhifau catalog y ganolfan gyfeirio yw HER-102 a HER-1102, yn y drefn honno) Cafodd .Phi6 phage a'i gwesteiwr eu hadfywio yn unol â chyfarwyddiadau'r ganolfan gyfeirio. Cafodd Phage Phi6 ei buro gan lysis plât ac elution i gael titers terfynol gyda \(\tua 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { ml}}\) (unedau ffurfio plac/ mililitrau). Cafodd RNA ei ynysu o ronynnau ffag wedi'u puro gan ddefnyddio Pecyn Puro Cyfanswm RNA Cyffredinol GenElute™ (Sigma-Aldrich) yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Yn gryno, ataliad phage Phi6 wedi'i buro\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) wedi'i lysu a'r lysate wedi'i lwytho ar golofn troellog i ganiatáu i RNA rwymo i'r golofn resin . Yna caiff yr RNA ei guddio yn y datrysiad elution \({ 50}\,{{\upmu\hbox {l}}}\) a ddarperir gan y cit. Amcangyfrifwch grynodiad RNA drwy amsugnedd yn \(260\,\hbox {nm}\). RNA wedi'i storio mewn aliquots yn \(260\,\hbox {nm}\). ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) nes ei ddefnyddio ymhellach.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) Pecyn Synthesis iScript cDNA (Bio -Rad Labordai) fel templed ar gyfer synthesis cDNA gan ddilyn cyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Yn gryno, mae adwaith synthesis cDNA yn cynnwys 3 cham: preimio ar \({25}\,{^{\circ}\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min}}\) , trawsgrifiad cefn o \({20}\,{\hbox {min}}\) yn \({46}\,{^{\circ }\hbox {C}}\), a'r cefn Mae'r recordydd yn \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) ar gyfer \({1}\,{\hbox {min) }}\). Wrth gael ei redeg ar gel agarose 1%, dangosodd y cDNA dri band yn cyfateb i'r tri darn RNA disgwyliedig (data heb ei ddangos). Defnyddiwyd y paent preimio canlynol i fwyhau dau ddarn DNA o 117 a 503 bp o hyd, defnyddio cDNA fel templed ar gyfer PCR mewn beiciwr thermol miniPCR® mini8:
Mae'r paent preimio ar gyfer \(117\,\hbox {bp}\) a \(503\,\hbox {bp}\) yn cyfateb i 1476-1575 niwcleotidau'r segment M a 458-943 niwcleotidau'r segment L, yn y drefn honno asid .Cafodd pob cynnyrch PCR chwyddedig ei electrofforesi ar geliau agarose 1%, a chafodd DNA targed chwyddedig ei buro gan ddefnyddio Pecyn Echdynnu Gel GeneJET (Thermo Fisher Scientific).
Defnyddiwyd llyn ar gampws IIT Mumbai (Llyn Powai, Powai, Mumbai) i ychwanegu gronynnau ffag. Cafodd dŵr y llyn ei hidlo trwy bilen \({5}\,{\upmu\hbox{m}}\) i'w dynnu gronynnau crog, ac yna ychwanegwyd Phi6 phage.Ychwanegwyd \({1}\,{\hbox {ml}}\) o \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} \) i \( {100} \ ,{\hbox {ml}}\) hidlo dŵr llyn, yn \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\).Aliquot bach oedd a gadwyd yn ôl ar gyfer mesur llwyth firaol trwy assay.We plac profi dau ddull gwahanol i ganolbwyntio gronynnau firws Phi6 pigog: (1) y dull arsugniad-dyddodiad alwminiwm hydrocsid,19 sydd wedi'i ddilysu ar gyfer y crynodiad o nifer o amlen firysau RNA o samplau amgylcheddol, a (2) ) Addaswyd y dull crynodiad firws polyethylen glycol (PEG) o Flood et al.20 .Gan y canfuwyd bod effeithlonrwydd adfer y dull seiliedig ar PEG yn well na'r dull alwminiwm hydrocsid, defnyddiwyd y dull seiliedig ar PEG i grynhoi gronynnau Phi6 o samplau dŵr llyn.
Roedd y dull PEG a ddefnyddiwyd fel a ganlyn: Ychwanegwyd PEG 8000 a \(\hbox {NaCl}\) at samplau dŵr llyn pigfain Phi6 i gael 8 % PEG 8000 a \(0.2\,\hbox {M} \) \( \ hbox {NaCl} \). Deorwyd samplau ar siglwr \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), yna wedi'i allgyrchu yn \(4700 \,\hbox {g}\) yw \({45}\,{\hbox {min}}\). Taflwch y supernatant ac ailddechrau'r belen yn \({1}\, {\hbox {ml}}\) yn yr un uwchnatur. Perfformiwyd yr holl arbrofion sbeicio a chrynhoad firws mewn triphlyg.Ar ôl crynodiad, neilltuwyd aliquot bach ar gyfer mesur effeithlonrwydd adfer trwy assay plac. Cafodd RNA ei ynysu fel y disgrifiwyd yn flaenorol ac yn aneglur mewn byffer elution a gyflenwir gan git\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\). Gan y bydd y crynodiad RNA yn amrywio o sampl i sampl yn driphlyg, bydd y \({2}\,{\upmu \) hbox {l}}\) o RNA yn cael ei ddefnyddio ar gyfer y tri waeth beth yw ei grynodiad cDNA synthesis o samplau.cDNA synthesis ei berfformio fel y disgrifiwyd yn flaenorol.\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNA ei ddefnyddio fel templed ar gyfer \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR am 35 cylchred i ymhelaethu \(117\,\hbox {bp}\) a \(503\,\hbox { bp}\) darnau. Cynrychiolir y samplau hyn fel “1:1″, hy heb ei wanhau. Sefydlwyd rheolydd dim-templed (NTC) fel rheolydd negyddol, tra sefydlwyd cDNA wedi'i syntheseiddio gan ddefnyddio RNA wedi'i ynysu o phage puro fel templed ar gyfer rheolaeth bositif (PC). Perfformiwyd PCR meintiol (qPCR) mewn offeryn RT-PCR Stratagene Mx3000P gan ddefnyddio Cymysgedd Meistr Gwyrdd QPCR Gwyrdd SYBR Ultra-Cyflym (Agilent Technologies) Brilliant III (Agilent Technologies). Disgrifiwyd y trothwy cylchred (Ct) ar gyfer pob sampl.Yn ogystal, roedd y samplau gwanedig yn \({1}\,{\upmu\hbox {l}}\) gan ddefnyddio cDNA wedi'i wanhau 1:100 mewn dŵr llyn wedi'i hidlo fel \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR am 35 o gylchoedd. Cynrychiolir y samplau hyn fel "1:100″.
Mae'r electrodau PCB yn cael eu ffugio gan ddefnyddio proses cost isel Electroless Nickel Trochi Aur (ENIG) sydd ar gael yn fasnachol heb fod angen platio aur ychwanegol. Manylir ar fanylebau electrod PCB ENIG yn ein work11.For ENIG blaenorol electrodau, dulliau glanhau electrod traddodiadol megis Ni argymhellir hydoddiant piranha neu foltammetreg cylchol asid sylffwrig oherwydd gallant achosi plicio'r haen aur denau (trwch \(\ approx\) \(100\,\hbox {nm}\)) ac amlygu'r haenau copr gwaelodol sy'n dueddol o fod. i gyrydiad 21, 22, 23, 24, 25.Felly, glanhewch yr electrodau gyda lliain di-lint wedi'i wlychu ag IPA. Cafodd y sampl i'w brofi ei ddeor â \({50}\,{\upmu\hbox {M} }\) MB yn \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({1}\,{\hbox {h}}\) i'w fewnosod yn hawdd.Yn ein gwaith blaenorol , gwelsom fod sensitifrwydd a llinoledd y synhwyrydd wedi'u gwella trwy gynyddu'r crynodiad MB 11 . Yn seiliedig ar optimeiddio a adroddwyd yn ein gwaith cynharach, fe wnaethom ddefnyddio \({50}\,{\upmu\hbox {M}}\) MB crynodiadau i wreiddio DNA yn yr astudiaeth hon.Gellir cyflawni darganfyddiad electrocemegol o DNA dwbl-sownd (ds-DNA) gan ddefnyddio intercalators anionig neu cationig. ar y llaw arall, mae angen amserau deori byrrach ar ryngosodwyr cationig fel MB, tua \({1}\,{\hbox {h}}\) ar gyfer canfod ds-DNA6 yn electrocemegol. Mae pob mesuriad yn golygu dosbarthu'r sampl i'w brofi ar y electrod\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), yna glanhau â chlwt wedi'i wlychu gan yr IPA, cyn bwrw ymlaen â sampl arall.Profwyd un mesuriad.Pob sampl ar 5 electrod gwahanol oni nodir yn wahanol. Perfformiwyd mesuriadau DPV a CV gan ddefnyddio potentiostat PalmSens Sensit Smart, a defnyddiwyd meddalwedd PSTrace ar gyfer cyfluniad potentiostat a chaffael data, gan gynnwys cyfrifiadau cyfredol brig. Defnyddir y gosodiadau canlynol ar gyfer mesuriadau DPV a CV:
DPV: Amser Ecwilibriwm = \(8\,\hbox {s}\), Voltage Step = \(3\,\hbox {mV}\), Pulse Voltage = \(25\,\hbox {mV}\), hyd curiad y galon = \(50\,\hbox {ms}\), scan rate = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: Amser Ecwilibriwm = \(8\,\hbox {s}\), Voltage Step = \(3\,\hbox {mV}\), Sweep Rate = \({300}\,\hbox {mV/ s }\)
Ceryntau brig a gafwyd o foltamogramau o DNA wedi'u cymhlethu â \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
Cafwyd foltamogramau DPV a CV ar electrodau ENIG PCB \({50}\,{\upmu\hbox {M}}\) MB wedi'i gymhlethu â DNA (mewn crynodiadau o 10–\({20}\,{\hbox {ng) }/{ \upmu \hbox {l}}}\) hy 0.13–\({0.26}\,{\upmu \hbox {M}}\) ar gyfer \(117\,\hbox {bp}\ ) a 0.03 –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) ar gyfer \(503\,\hbox {bp}\)).Dangosir foltamogramau cynrychioliadol yn Ffigur S1 yn y Wybodaeth Atodol. Mae Ffigur 2 yn dangos y canlyniadau o fesuriadau DPV a CV (cerrynt brig) gan ddefnyddio cynhyrchion PCR wedi'u puro gel.Compared i fesuriadau CV, mae mesuriadau DPV yn dangos sensitifrwydd uwch (cyfredol fel swyddogaeth crynodiad DNA) oherwydd bod y ceryntau capacitive cefndir mewn mesuriadau CV yn cuddio ceryntau Faradaic 26 .Y data ar gyfer pob blwch yn y boxplot yn cynnwys mesuriadau o 5 electrod.Mae pob mesuriad yn defnyddio'r un set o electrodau i osgoi gwallau mesur oherwydd amrywiad electrod-i-electrod. Gwelsom duedd gynyddol mewn ceryntau brig mesuredig DPV a CV ar gyfer crynodiadau is o DNA , hirach ( \(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ o'i gymharu â \(117) ) fragment.Mae hyn yn gyson â'r duedd ddisgwyliedig o arsugniad electrod a adroddwyd yn ein gwaith blaenorol. arsugniad y cymhleth MB-DNA yn hwyluso trosglwyddo tâl ar yr electrod, sy'n cyfrannu at gynnydd y cerrynt brig. Mae astudiaethau eraill wedi dangos effaith maint a dilyniant oligonucleotide ar MB-DNA intercalation27,28,29,30.The guanine -cytosine (GC) cynnwys y ddau amplicon (\(117\,\hbox {bp}\) a \(503\,\hbox {bp}\)) tua 50%, sy'n nodi bod y sylw Mae'r gwahaniaeth yn ddyledus i hyd amplicon. Fodd bynnag, ar gyfer crynodiadau DNA uwch (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), ar gyfer \(503\,\hbox {bp} \) a \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) ar gyfer \(117\,\hbox {bp}\)), rydym yn arsylwi dau ymhelaethiad The mae ceryntau brig yr is-subs yn cael eu lleihau mewn mesuriadau DPV a CV. Mae hyn oherwydd bod MB yn dirlawn ac yn rhyngosod rhwng parau sylfaen o DNA, gan arwain at ataliad sterig o weithgaredd rhydocs y grŵp reducible yn MB31,32.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \, \hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV。
Mae halwynau sy'n bresennol mewn cymysgeddau meistr PCR yn ymyrryd â rhyngweithiadau electrostatig rhwng MB a DNA, felly trwy ychwanegu \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) gyda \({50} \,{\ upmu \hbox {M}}\) Cynnyrch MB wedi'i buro â gel i astudio effaith halen ar ryngweithio MB-DNA. Fel y dangosir yn Ffigur 3, arsylwyd ar gyfer crynodiadau DNA uwch (\(>{2}\,{\) hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) a \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu\hbox { l}}}\) ar gyfer \(117\,\hbox {bp} \)), mewn DPV a CV Nid oedd ychwanegu halen yn effeithio'n sylweddol ar y mesuriadau (gweler Ffigur S2 yn y Wybodaeth Atodol am foltamogramau cynrychioliadol). Fodd bynnag, ar crynodiadau DNA is, ychwanegu halen yn lleihau sensitifrwydd yn fawr, gan arwain at unrhyw newid sylweddol yn y cerrynt gyda DNA crynodiad. Effeithiau negyddol tebyg o halen ar MB-DNA rhyngweithiadau a intercalation wedi cael eu hadrodd yn flaenorol gan ymchwilwyr eraill33,34.\(\hbox { Mg}^{2+}\) cationau yn rhwymo i asgwrn cefn ffosffad negatif DNA, a thrwy hynny yn rhwystro'r rhyngweithiad electrostatig rhwng MB a DNA.Ar grynodiadau DNA uwch, mae ataliad sterig o MBs rhydocs-weithredol yn arwain at geryntau brig is, felly rhyngweithiadau electrostatig ddim yn effeithio'n sylweddol ar ymateb y synhwyrydd. Y pwynt allweddol yw bod y biosynhwyrydd hwn yn fwy addas i ganfod crynodiadau DNA uwch (yn anaml \({\hbox {ng}/{\upmu\hbox {l}}}\) neu uwch), ar gyfer prosesu samplau dŵr amgylcheddol yn llawn awtomataidd, lle efallai na fydd puro gel o gynhyrchion PCR yn ymarferol.
Arwynebedd o dan y gromlin amsugno ar gyfer yr amrediad tonfedd 600–700 \(\hbox {nm}\) ar gyfer crynodiadau amrywiol o DNA wedi'i gymhlethu â \({50}\,{\upmu\hbox {M}}\) MB: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) gyda a heb halen (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) gyda a heb halen (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/) {\upmu \hbox {l}}}\) Crynodiad DNA sy'n cyfateb i \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) samplau MB Dim DNA.
I wirio'r canlyniadau uchod ymhellach, fe wnaethom berfformio mesuriadau optegol gan ddefnyddio sbectrophotometer UV/Vis (Thermo Scientific Multiskan GO), defnyddiwyd y samplau \({50}\,{{\upmu\hbox {l}}}\) ar gyfer pob un. Mesur.Mae'r llofnod amsugno yn gostwng gyda chrynodiad DNA cynyddol, fel y gwelir o duedd yr ardal o dan y gromlin amsugno ar gyfer yr amrediad tonfedd \(600\,\hbox {nm}\) i \(700\,\hbox { nm}\), fel y dangosir yn Ffig. 4 (sbectrwm amsugno a ddangosir yn Ffig. S3 mewn Gwybodaeth Atodol). Ar gyfer samplau gyda chrynodiadau DNA yn llai na \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu\hbox). {l}}}\), nid oedd unrhyw wahaniaeth sylweddol yn y nifer a gymerodd samplau sy'n cynnwys DNA a samplau MB yn unig (ar gyfer \(503\,\hbox {bp}\) a \(117\,\hbox {bp}\). ) darnau o hyd), sy'n nodi absenoldeb ataliad steric o redox-active MB.Ar grynodiadau DNA uwch, gwelsom ostyngiad graddol yn y signal amsugnedd a nodwyd gostyngiad llai mewn amsugnedd ym mhresenoldeb halen. Priodolwyd y canlyniadau hyn i foleciwlaidd rhyngweithiadau ac ataliad steric â phentyrru sylfaen mewn hybridau DNA. Mae ein canlyniadau yn gyson ag adroddiadau yn y llenyddiaeth ar astudiaethau sbectrosgopig o rynggyfnewidiad MB-DNA sy'n cysylltu hypochromaticity â lefelau egni is yn \(\pi\)-\(\pi ^*\ ) trawsnewidiadau electronig oherwydd rhyngosod Haenau 36, 37, 38.
Electrofforesis gel agarose o phage Phi6: cynhyrchion PCR o hyd \(117\,\hbox {bp}\) a \(503\,\hbox {bp}\) o samplau dŵr llyn.M-DNA marciwr;Rheolaeth NTC-dim-templed, paent preimio sy'n cynnwys amplicons cyfatebol;rheolaeth bositif PC;Samplau dŵr llyn pigog 1, 2, 3 heb ei wanhau (1:1) mewn band triphlyg. Mae band i'w weld yn \(\tua 50\,\hbox {bp}\) oherwydd oligoniwcleotidau nas defnyddiwyd yn y \(503\,\). hbox {bp}\) lôn.
Fe wnaethom werthuso defnyddioldeb y synhwyrydd gan ddefnyddio samplau dŵr Powai Lake wedi'u pigo â phage Phi6. Roedd y crynodiadau RNA wedi'u hynysu o samplau dŵr pigyn ffag yn amrywio o 15.8–\({19.4}\,{\upmu\hbox {g}/\hbox { ml}}\), tra bod y rheini wedi'u hynysu rhag ataliadau phage puredig Amcangyfrifwyd bod yr RNA yn \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) gydag effeithlonrwydd adfer o tua 1 Cafodd %.RNA ei drawsgrifio i'r chwith i cDNA a'i ddefnyddio fel templed ar gyfer PCR a qPCR. Cadarnhawyd maint y cynnyrch gan electrofforesis gel agarose (Ffigur 5) cyn profi gyda'r sensor.Nid yw'r samplau hyn wedi'u puro â gel ac felly maent yn cynnwys holl gydrannau PCR fel yn ogystal â'r amplicons o ddiddordeb.Dangoswyd bod y gwerthoedd Ct a gofnodwyd yn ystod qPCR (Tabl 1) yn cydberthyn â'r crynodiad o RNA wedi'i ynysu o'r samplau dŵr pigog cyfatebol. Mae gwerth Ct yn datgelu nifer y cylchoedd sydd eu hangen ar gyfer y signal fflwroleuol i yn fwy na'r trothwy neu'r cefndir signal.Higher gwerthoedd Ct yn nodi crynodiadau templed is ac i'r gwrthwyneb.The Ct gwerthoedd y samplau NTC oedd mor uchel ag expected.The gwahaniaeth mewn \(\tua 3\) Ct gwerthoedd rhwng mae'r rheolaeth gadarnhaol a'r sampl prawf yn dangos ymhellach fod gan bob sampl prawf dempled o tua 1% o'i gymharu â'r rheolaeth gadarnhaol. Rydym wedi trafod yn flaenorol bod amplicons hirach yn arwain at well sensitifrwydd.Mae ehangu darnau hirach wedi'u hynysu o samplau amgylcheddol heterogenaidd yn heriol o ystyried yr anfanteision Fodd bynnag, gyda'n protocol cyfoethogi firws a'n protocol ymhelaethu PCR, roeddem yn gallu chwyddo'r darn \(503\,\hbox {bp}\) yn llwyddiannus ar gyfer synhwyro electrocemegol.
Mae Ffigur 6 yn dangos canlyniadau synhwyrydd electrocemegol yr amplicon darn \(503\,\hbox {bp}\), gan ddefnyddio cDNA heb ei wanhau fel templed (1:1) a cDNA gwanedig 100-plyg fel templed (1:100 ) a gyflawnir PCR , o'i gymharu â NTC a PC (gweler Ffigur S4 yn Gwybodaeth Atodol ar gyfer foltamogramau cynrychioliadol).Mae pob blwch yn y boxplot yn Ffigur 6 yn cynnwys mesuriadau o dri sampl ar 5 electrod. Defnyddiwyd yr un electrodau i fesur pob sampl er mwyn osgoi gwallau oherwydd electrod -i-electrod variation.Compared i CV mesuriadau, mesuriadau DPV dangos cydraniad gwell i wahaniaethu profion a samplau PC o NTCs oherwydd, fel y crybwyllwyd yn flaenorol, cerrynt Faradaic yn cael eu cuddio oherwydd cefndir ceryntau capacitive yn y last.For amplicons hirach, gwelsom fod arweiniodd y rheolaeth negyddol (NTC) at gerrynt brig CV a DPV uwch o gymharu â'r rheolaeth gadarnhaol, tra bod samplau prawf positif a heb eu gwanhau yn dangos uchder brig cerrynt DPV tebyg. Roedd y gwerthoedd cymedrig a chanolrifol mesuredig ar gyfer pob un heb ei wanhau (1:1). ) sampl prawf a PC gellir eu datrys yn glir o'r allbwn synhwyrydd ar gyfer y sampl NTC, tra bod y penderfyniad ar gyfer y sampl gwanhau 1:100 yn llai amlwg.Ar gyfer gwanhau 100-plyg o cDNA, ni wnaethom arsylwi unrhyw fandiau yn ystod electrofforesis gel (lonydd heb eu dangos yn Ffigur 5), ac roedd y ceryntau brig DPV a CV cyfatebol yn debyg i'r rhai a ddisgwylir ar gyfer NTC. rheolaeth ysgogodd ymateb electrocemegol o'r synhwyrydd PCB oherwydd arsugniad MB rhad ac am ddim ar yr electrod a rhyngweithiad y MB gyda'r primer oligonucleotide un-sownd.Therefore, bob tro y profir sampl, rhaid rhedeg rheolaeth negyddol a cerrynt brig y sampl prawf o'i gymharu â'r cerrynt brig a gafwyd gan y rheolydd negyddol i gyflawni mesuriad gwahaniaethol (cymharol)39,40 i ddosbarthu'r sampl prawf yn bositif neu'n negyddol.
(a) DPV, a (b) cerrynt brig CV ar gyfer canfod darnau mewn samplau dŵr llynnoedd yn electrocemegol. rheolaethau cadarnhaol (PC).
Mae ein canfyddiadau yn dangos gwahanol fecanweithiau sy'n effeithio ar berfformiad synwyryddion electrocemegol ar gyfer apliconau o wahanol hyd ar gyfer gwahanol DNAs, gyda chrynodiadau wedi'u gwirio gan fesuriadau optegol gan ddefnyddio sbectrophotometer UV/Vis. Gellir canfod \(500\,\hbox {bp}\) gyda sensitifrwydd uwch ac nad yw presenoldeb halen yn y sampl yn gwneud Crynodiad DNA Sensitifrwydd sy'n effeithio ar sensitifrwydd uwch (yn anaml \({\hbox {ng}/{\upmu) \hbox {l}}}\).Gwelsom fod DPV yn darparu datrysiad gwell, gan fod y cerrynt capacitive cefndir hefyd yn effeithio ar fesuriad CV, gan ei wneud yn llai sensitif.
Mae ymhelaethu ar ddarnau hirach yn dibynnu ar gyfanrwydd yr RNA genomig firaol. Mae nifer o astudiaethau wedi dangos nad yw ymhelaethu ar ddarnau hirach bob amser yn effeithlon oherwydd diraddio RNA yn yr amgylchedd a'r potensial ar gyfer splicing yn ystod ynysu11,41,42,43,44 . Gwelsom fod y dull crynodiad firws PEG-seiliedig yn fwy effeithiol wrth ganolbwyntio phage Phi-6 wedi'i sbeicio mewn samplau dŵr llyn na'r dull crynodiad firws alwminiwm hydrocsid-seiliedig. Profodd y gallu i ganfod darnau DNA hir i oresgyn yr angen am amlblecs PCR i ymhelaethu ar nifer o dempledi hyd byrrach a lleihau'r posibilrwydd o draws-benodoledd.
Mae samplau biolegol yn brin, felly mae angen dylunio biosynhwyrydd sy'n gofyn am ychydig iawn o samplau i'w profi. Dim ond \({5}\,{{\upmu\hbox{l}}} sydd ei angen ar yr electrodau PCB ENIG a ddefnyddiwyd yn yr astudiaeth hon. ) samplau i'w profi i gwmpasu ardal effeithiol yr electrodau.Additionally, gellir ailddefnyddio'r un electrod ar ôl glanhau cyn dosbarthu'r sampl nesaf. a chemegol a ddefnyddir yn gyffredin. Gan fod pob electrod yn costio tua $0.55 (neu INR 40) i'w gynhyrchu, gall y biosynhwyrydd hwn fod yn ddewis cost-effeithiol i dechnolegau canfod presennol. Mae Tabl 2 yn dangos cymhariaeth o'r gwaith hwn gyda synwyryddion eraill a adroddwyd yn y llenyddiaeth am gyfnod hir Darnau DNA mewn samplau heterogenaidd.
O ystyried bod protocolau canfod electrocemegol sy'n seiliedig ar MB yn dibynnu ar benodolrwydd PCR, cyfyngiad mawr ar y dull hwn yw'r potensial ar gyfer mwyhau amhenodol mewn samplau heterogenaidd megis dŵr gwastraff a dŵr llyn neu ddefnyddio paent preimio purdeb isel. dulliau canfod electrocemegol ar gyfer canfod DNA o gynhyrchion PCR heb eu puro gan ddefnyddio electrodau ENIG PCB heb eu haddasu, mae angen deall yn well y gwallau a gyflwynwyd gan dNTPs a paent preimio nas defnyddiwyd, ac i wneud y gorau o amodau adwaith a phrotocolau assay. Paramedrau ffisiocemegol ychwanegol megis pH, tymheredd, a biolegol efallai y bydd angen mesur y galw am ocsigen (BOD) o'r sampl dŵr hefyd er mwyn gwella cywirdeb y mesuriad.
I gloi, rydym yn cynnig synhwyrydd electrocemegol PCB ENIG cost isel ar gyfer canfod firws mewn samplau amgylcheddol (dŵr llyn). electrodau gydag oes silff hirach a dim gofynion storio penodol ac felly'n addas ar gyfer datblygu datrysiadau mesur gyda phrosesu sampl awtomataidd yn cael ei ddefnyddio mewn LMICs. Mae'r biosynhwyrydd yn defnyddio llifynnau rhydocs DNA-intercalating (MB) rhad i ganfod yn gyflym amplicons targed.Y mwyhadur amhenodol sy'n gyffredin mewn samplau amgylcheddol yn lleihau penodoldeb y dull synhwyro hwn oherwydd rhwymiad nonspecific MBs i oligonucleotides sengl a dwbl-sownd. a dylid dehongli ceryntau brig DPV a gafwyd o'r samplau a brofwyd mewn perthynas â'r ymatebion a gafwyd o'r rheolaeth negyddol (NTC) ar gyfer pob prawf. Gellir integreiddio'r dyluniadau a'r dulliau synhwyrydd electrocemegol a gyflwynir yn y gwaith hwn ag awtosamplers i ddatblygu awtomataidd ac isel. - ateb cost a all gasglu a dadansoddi samplau a throsglwyddo canlyniadau yn ôl i'r labordy yn ddi-wifr.
Cashdollar, J. & Wymer, L. Dulliau ar gyfer crynodiad cychwynnol o firysau o samplau dŵr: adolygiad a meta-ddadansoddiad o astudiaethau diweddar.J.Cais.micro-organeb.115, tt. 1-11 (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL Firysau a gludir gan ddŵr: Rhwystrau i ddŵr yfed diogel.PLoS Pathogens.11, E1004867 (2015).
Shrestha, S. et al. Epidemioleg dŵr gwastraff ar gyfer gwyliadwriaeth cost-effeithiol ar raddfa fawr o COVID-19 mewn gwledydd incwm isel a chanolig: heriau a chyfleoedd.Water 13, 2897 (2021).
Palecek, E. & Bartosik, M. Asid niwclëig electrochemistry.Chemical.Rev.112, 3427–3481 (2012).
Tani, A., Thomson, AJ & Butt, JN Methylene glas fel gwahaniaethwr electrogemegol o oligonucleotides un a dwy-sownd ansymudol ar swbstradau aur.Dadansoddwr 126, 1756-1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ Cymhariaeth o Ryngolyddion Cation ac Anion ar gyfer Trawsnewid Hybrideiddio DNA Electrocemegol trwy Drosglwyddo Electronau Ystod Hir.Electrochemistry.comminicate.6, 648-654 (2004).
Wong, EL & Gooding, JJ Trosglwyddiad gwefr trwy DNA: biosensor.anus.Chemical DNA electrocemegol detholus.78, 2138–2144 (2006).
Fang, TH et al.Real-amser dyfais PCR microfluidic gyda detection.biological electrochemical synhwyro cydamserol.Bioelectronics.24, 2131–2136 (2009).
Astudiaeth fecanwaith Win, BY et al.Signaling a gwirio perfformiad system PCR amser real electrocemegol yn seiliedig ar ryngweithio glas methylene â DNA.Analyst 136, 1573-1579 (2011).
Ramirez-Chavarria, RG et al.Loop-mediated isothermal ymhelaethu yn seiliedig ar electrochemical synhwyrydd ar gyfer canfod sars-cov-2 mewn dŵr gwastraff samples.J.Amgylchedd.Chemical.Britain.10, 107488 (2022).
Kumar, M. et al.Electrochemical synhwyro o SARS-CoV-2 amplicons gyda PCB electrodes.The synhwyrydd yn activated.B Cemeg.343, 130169 (2021).
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. & Yoshida, H. Canfod RNA SARS-CoV-2 yn effeithlon yn y ffracsiwn solet o wastewater.science.general environment.763, 144587 (2021).
Alygizakis, N. et al.Dulliau Dadansoddol ar gyfer Canfod SARS-CoV-2 mewn Dŵr Gwastraff: Protocol a Safbwyntiau'r Dyfodol.TraC trending anal.Chemical.134, 116125 (2020).
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. & Kashtan, N. Goroesiad y bacteriophage amlenedig Phi6 (surrogate ar gyfer SARS-CoV-2) mewn defnynnau poer anweddedig a adneuwyd ar arwynebau gwydr.science.Rep.10, 1–10 (2020).
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ Dyfalbarhad amgylcheddol dirprwy SARS-CoV-2 (Phi6) mewn amoeba.J.Iechyd Dŵr 20, 83 (2021).
Mindich, L. Pecynnu manwl gywir o dri darn genomig o bacterioffag RNA dwy-sownd\(\varphi\)6.microorganism.Moore.biology.Rev.63, 149–160 (1999).
Pirttimaa, MJ & Bamford, Strwythur eilaidd y DH RNA phage \ (\varphi\)6 pecynnu rhanbarth.RNA 6, 880-889 (2000).
Bonilla, N. et al.Phages on the Tap – Protocol cyflym ac effeithlon ar gyfer paratoi stociau labordy o bacteriophages.PeerJ 4, e2261 (2016).
Amser postio: Mai-27-2022