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L'impurtanza di monitorà i campioni ambientali hè stata assai apprezzata da u principiu di a pandemia di COVID-19, è certi sforzi di monitoraghju sò stati realizati utilizendu u standard d'oru, anche se e tecniche basate in qPCR sò caru. suluzione per u monitoraghju di campioni d'acqua ambientale in i paesi à redditu bassu è mediu. In questu travagliu, dimustremu a rilevazione elettrochimica di ampliconi ottenuti da u fago Phi6 isolatu da campioni d'acqua di lacu spiked (un surrogatu populari per SARS-CoV-2), utilizendu ENIG per compie l'elettrodi PCB senza mudificazione di a superficia.sessu. A risposta di u sensoru elettrochimicu hè stata completamente carattarizata per dui frammenti di DNA di diverse lunghezze (\({117}\,\hbox {bp}\) è \({503}\,\hbox {bp}\)), è u L'effettu di i sali in i mischi maestri di PCR nantu à l'interazzione blu di metilene (MB)-DNA. I nostri risultati mostranu chì a durata di i frammenti di DNA determina significativamente a sensibilità elettrochimica è dimustranu in questu travagliu chì a capacità di detectà amplicons longu senza purificazione di gel di i prudutti PCR hè. impurtante per a misura in situ di campioni d'acqua.Una soluzione cumplettamente automatizata per a carica virale hè bona.
A trasmissione di virus di l'acqua hè stata cunnisciuta cum'è un periculu per a salute publica dapoi l'anni 1940, cù a prima evidenza di trasmissione di poliomielite è hepatitis E1. L'Organizazione Mondiale di a Salute (OMS) hà classificatu parechji patogeni virali di l'acqua di significatu moderatu à altu per a salute 2.Virus tradiziunale. i metudi di rilevazione s'appoghjanu nantu à e tecniche basate in qPCR standard d'oru, chì sò assai sensibili è specifiche, ma necessitanu un persunale qualificatu per pruvà in u laboratoriu cù strumenti caru. A prova di campionu hè prubabile di piglià a precedenza annantu à u monitoraghju di campioni di l'acqua ambientale. Per quessa, i metudi alternativi à pocu costu sò necessarii per un monitoraghju sustenibile, in tempu reale, di campioni d'acqua è d'acqua residuale in i paesi à redditu bassu è mediu cum'è avvisi precoci di epidemie emergenti di malatie, proteggendu cusì da l'impatti socioeconomichi severi di a pandemia di virus. I biosensori elettrochimichi à pocu costu per l'acidi nucleici puderanu furnisce una soluzione potenziale promettente à questa necessità insoddisfatta. Molti di questi biosensori di DNA funzionanu da u fattu chì i filamenti di DNA cumplementari sò immobilizzati nantu à l'elettrodu. superficia è hybridize quandu una sequenza currispundente hè prisente in u sample.This pò esse cunvertisce in un signalu da diverse tecniche elettrochimichi cù mediatori redox cum'è ferru di potassiu / ferrocyanide.Methylene blue (MB) hè una tale molecula redox-attiva, chì hà hè statu signalatu per intercalate in DNA a doppia fila (dsDNA) in più di a so legame più non specificu à DNA monofilamentu 5,6. A natura intercalante di MB per furmà complexi MB-DNA li rende una scelta populari cum'è mediatori redox in parechji DNA elettrochimici. cunfigurazioni di sensori5,6,7,8,9.Anchi se l'intercalazione di MB à l'ADN ùn hè micca specificu, è a specificità di stu sensoru elettrochimicu dipende largamente da a purità di i primers utilizati per a PCR o l'amplificazione isotermica, hè bè adattatu per implementà reali. -time qPCR basata in elettrochimichi o amplificazione isotermica di fluorescenza cum'è una alternativa à a misurazione di a cuncentrazione di DNA 9 .In una tali implementazione, Won et al.A superficia di l'elettrodi d'oru hè stata mudificata cù 6-mercapto-1-hexanol (MCH) per real-time misurazione di l'ampliconi di PCR cù MB utilizendu voltammometria di impulsu differenziale (DPV) 9.In altri casi, Ramirez et al.Detection di SARS-CoV-2 in acque di scarico da a reazione RT-LAMP usendu MB cù elettrodi stampati. utilizatu cum'è elettrodi in situ in una piattaforma di PCR microfluidica cuncepita per detectà electrochemically amplicons durante e reazzioni 8 .Tutti sti studii necessanu mudificazione di a superficia di l'elettrodi, chì implicanu l'aumentu di a produzzione è di i costi operativi per via di esigenze di almacenamento speciale per a stabilità di sti elettrodi funziunalitati.
Schematicu di u flussu di travagliu per a rilevazione elettrochimica di ampliconi ottenuti da particelle virali cuncentrate in campioni d'acqua di lavu.
Recentemente avemu dimustratu a sensazione elettrochimica di l'ampliconi SARS-CoV-2 cù elettrodi di circuitu stampatu (PCB) à pocu costu basati in DPV è voltammetria ciclica (CV) indotta da l'adsorption di complexi MB-DNA nantu à a superficia di l'elettrodi micca modificati) cambiamenti in piccu. attuale 11.Riportemu chì i frammenti di DNA più longu (N1-N2, \({943}\, \hbox) furmati utilizendu i primers N1 forward è N2 inversi raccomandati da CDC cumparatu cù frammenti più brevi {bp}\)) anu mostratu una linearità megliu in a risposta di u sensoru. (N1, \(72\,\hbox {bp}\)) furmati cù set di primer N1 avanti è inversu N1. Questi studii sò riportati cù diluzioni di DNA preparate in acqua senza nucleasi. A piattaforma hè stata ancu usata per detect SARS-CoV. -2 ampliconi in campioni simulati d'acqua residuale (ottenuti da spiking di campioni di RNA totali cù SARS-CoV-2 RNA). Siccomu l'RNA hè suscettibile à a cisura durante l'isolamentu è u processu downstream, 12,13 hè difficiule d'amplificà frammenti più longu cù questa mostra eterogenea. Dunque, a dimostrazione di a sensazione elettrochimica di l'ampliconu SARS-CoV-2 in l'acqua residuale hè limitata à u fragmentu N1 più curtu \(72\,\hbox {bp}\).
In questu travagliu, avemu investigatu a fattibilità di l'ENIG PCB-based electrochemical sensing di phage Phi6 cuncintratu è isolatu da i campioni d'acqua di u lavu (Fig. 1). Phi6 phages sò paragunabili in grandezza (80-100 nm) à SARS-CoV-2 è anu ancu una membrana lipidica è una proteina spike. Per questi motivi, u bacteriophage Phi6 hè un surrogatu populari per SARS-CoV-2 è altri virus RNA patogeni invucati14,15.RNA isolatu da particelle di fagi hè stata utilizata com'è mudellu per a sintesi di cDNA seguita da PCR per ottene dui frammenti di DNA di 117 è 503 coppie di basi in lunghezza.Datu a sfida di amplifying \(943\,\hbox {bp}\) frammenti N1-N2 in u nostru travagliu precedente, avemu destinatu frammenti di lunghezza intermedia (\(117). \,\hbox {bp}\) è \(503 \,\hbox {bp}\)), basatu annantu à i primers dispunibili. A risposta di u sensoru elettrochimicu hè stata studiata sistematicamente nantu à una larga gamma di cuncentrazione (\({10}\,{ \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) a \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) Per entrambi i frammenti in a prisenza di MB, l'effettu di u sali nantu à a risposta di u sensoru hè stata carattarizata è cunvalidata da e misurazioni spettrofotometriche. I cuntributi principali di stu travagliu sò i seguenti:
A lunghezza di u fragmentu di DNA è a prisenza di u sali in a mostra affettanu assai a sensibilità.I nostri risultati mostranu chì l'attività elettrochimica dipende da diversi miccanismi di l'interazzione di MB, DNA, è u sensoru in a risposta voltammetric, secondu a cuncentrazione di DNA è a lunghezza, cù più longu Fragmenti mostranu sensibilità più altu, ancu s'è u sali hà un effettu negativu nantu à l'interazzione elettrostatica trà MB è DNA.
A cuncentrazione di DNA determina u mecanismu di l'interazzione MB-DNA in elettrodi micca modificati Dimustramu chì i diversi meccanismi di l'interazione MB-DNA dipendenu da a cuncentrazione di DNA. {l}}}\), avemu osservatu chì a risposta di corrente elettrochimica era principalmente determinata da l'adsorption di MB-DNA nantu à l'elettrodu, mentre chì à concentrazioni più bassu À cuncentrazioni elevate di DNA, a risposta di corrente elettrochimica era determinata da l'inibizione sterica di redox. attività dovuta à l'inserzione di MB trà coppie di basi di DNA.
Sensazione elettrochimica basata in PCB ENIG di acidi nucleici virali in campioni d'acqua di laghi L'osservazioni sò state validate da a rilevazione elettrochimica di frammenti di DNA Phi6-added \(503\,\hbox {bp}\) ottenuti da campioni d'acqua da Powai Lake, IIT Mumbai Campus Risultatu phage.
Bassu costu di implementazione è potenziale per l'integrazione in sistemi di monitoraghju cumplettamente automatizzati, oligonucleotidi o aptameri nantu à elettrodi cù una durata di conservazione più longa.
Phage Phi6 hè un virus dsRNA involucatu di a famiglia Cytoviridae chì infetta Pseudomonas syringae. U genoma di Phi6 phage esiste in forma di 3 frammenti: S (\(2.95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4.07) \,\hbox {Kb}\)) è L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\))16,17.Siccomu u fago Phi6 infetta una ceppa BSL-1 Pseudomonas non patogena, hè sicuru d'utilizà è pò esse facilmente cultivatu in u laboratoriu. Phage Phi6 è u so host Pseudomonas syringae sò stati acquistati da u Felix d'Herelle Reference Center for Bacterial Viruses, Laval University, Canada (i numeri di catalogu di u centru di riferimentu sò HER-102 è HER-1102, rispettivamente) .Phi6 phage è u so òspite sò stati rianimati cum'è urdinatu da u centru di riferimentu. Phage Phi6 hè stata purificata da a lisi di piastra è l'eluzione per ottene titoli finali cù \(\circa 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { ml}}\) (unità formanti placche / millilitri). L'ARN hè statu isolatu da particelle di fagi purificati cù u GenElute™ Universal Total RNA Purification Kit (Sigma-Aldrich) secondu l'istruzzioni di u fabricatore. In breve, una sospensione Phi6 di fagi purificata \ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) hè stata lisata è u lisatu hè statu caricatu nantu à una colonna di spin per permette à l'RNA di ligà à a colonna di resina. 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) forniti da u kit. Estimate a cuncentrazione di RNA per assorbanza à \(260\,\hbox {nm}\). L'ARN hè statu almacenatu in aliquote in \ ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) finu à un ulteriore usu.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) U Kit di sintesi cDNA iScript (Bio -Rad Laboratories) hè stata utilizata com'è mudellu per a sintesi di cDNA in seguitu à l'istruzzioni di u fabricatore. In breve, una reazione di sintesi di cDNA hè custituita da 3 passi: priming at \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min} }\), trascrizione inversa di \({20}\,{\hbox {min}}\) à \({46}\,{^{\circ }\hbox {C}}\), è inversa U registratore hè in \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) per \({1}\,{\hbox {min }}\).Quandu eseguitu nantu à un gel d'agarose 1%, l'ADNc hà mostratu trè bande chì currispondenu à i trè frammenti di RNA previsti (dati micca mostrati). I seguenti primers sò stati utilizati per amplificà dui frammenti di DNA di 117 è 503 bp in lunghezza, utilizendu cDNA cum'è mudellu per PCR in un termociclatore miniPCR® mini8:
I primers per \(117\,\hbox {bp}\) è \(503\,\hbox {bp}\) currispondenu à 1476-1575 nucleotidi di u segmentu M è 458-943 nucleotidi di u segmentu L, rispettivamente acidu .Tutti i prudutti PCR amplificati sò stati electrophoresed nantu à 1% agarose gels, è l'ADN di destinazione amplificatu hè stata purificata cù u GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Fisher Scientific).
Un lagu in u campus IIT Mumbai (Powai Lake, Powai, Mumbai) hè stata utilizata per aghjunghje particelle di fagi. L'acqua di u lavu hè stata filtrata attraversu una membrana \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) per caccià. particelle sospese, è dopu hè statu aghjuntu u fago Phi6. Aghjunghje \({1}\,{\hbox {ml}}\) di \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} \) à \( {100}\ ,{\hbox {ml}}\) acqua di u lavu filtrata, in \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\).Una piccula aliquota hè stata riservatu per a misurazione di a carica virali per analisi di placca. Avemu pruvatu dui metudi diffirenti per cuncentrazione di particelle di virus Phi6 spiked: (1) u metudu di adsorption-precipitation di l'idrossidu d'aluminiu,19 chì hè statu validatu per a cuncentrazione di parechji virus RNA involucati da campioni ambientali, è (2) ) U metudu di cuncentrazione di virus basatu in polyethylene glycol (PEG) hè statu adattatu da Flood et al.20 .Siccomu l'efficienza di ricuperazione di u metudu basatu in PEG hè stata trovata megliu cà quella di u metudu di l'idrossidu d'aluminiu, u metudu di l'idrossidu d'aluminiu hè stata utilizata per cuncentrazione di particeddi Phi6 da i campioni d'acqua di u lavu.
U metudu PEG utilizatu era u seguitu: PEG 8000 è \(\hbox {NaCl}\) sò stati aghjuntu à i campioni d'acqua di lacu di Phi6-spiked per ottene 8% PEG 8000 è \(0,2\,\hbox {M} \) \( \ hbox {NaCl}\).I campioni sò stati incubati nantu à un agitatore \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), poi centrifugata à \(4700 \,\hbox {g}\) hè \({45}\,{\hbox {min}}\). Scartare u surnatante è risuspende u pellet in \({1}\, {\hbox {ml}}\) in u stessu supernatante. Tutti l'esperimenti di spiking è di cuncentrazione di virus sò stati realizati in triplicate. Dopu a cuncentrazione, una piccula aliquota hè stata riservata per a misurazione di l'efficienza di ricuperazione per analisi di plaque. in un tampone d'eluzione fornitu da u kit\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\).Siccomu a cuncentrazione di RNA varierà da un campione à l'altru in triplicatu, u \({2}\,{\upmu \ hbox {l}}\) di RNA hè utilizatu per tutti i trè, indipendentemente da a so cuncentrazione sintesi di cDNA di campioni. A sintesi di cDNA hè stata realizata cum'è descritta prima.\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNA hè stata utilizata cum'è mudellu per \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR per 35 cicli per amplificà \ (117\,\hbox {bp}\) è \(503\,\hbox { bp}\) frammenti. Questi campioni sò rapprisintati cum'è "1: 1", vale à dì senza diluzione. Un cuntrollu senza mudellu (NTC) hè statu stallatu cum'è un cuntrollu negativu, mentre chì un cDNA sintetizatu cù l'ARN isolatu da u fago purificatu hè statu stallatu. cum'è mudellu per un cuntrollu pusitivu (PC). A PCR quantitativa (qPCR) hè stata realizata in un strumentu Stratagene Mx3000P RT-PCR cù Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies). descritta.U sogliu di u ciclu (Ct) hè statu registratu per tutti i campioni.In più, i campioni diluiti eranu \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) utilizendu cDNA diluitu 1:100 in l'acqua di u lavu filtrata cum'è \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR per 35 cicli. Questi campioni sò rapprisintati cum'è "1:100".
L'elettrodi di PCB sò fabbricati utilizendu un prucessu d'immersione d'oru di nichel elettroless (ENIG) à pocu costu dispunibule in cumerciu senza a necessità di una placatura d'oru supplementaria. E specificazioni di l'elettrodi di PCB ENIG sò dettagliate in u nostru travagliu precedente11. A suluzione di piranha o a voltammetria ciclica à l'acidu sulfuricu ùn sò micca cunsigliatu perchè ponu causà sbucciatura di a strata d'oru sottile (spessore \(\approx\) \(100\,\hbox {nm }\)) è espone i strati di rame sottostanti chì sò propensi. à a corrosione 21, 22, 23, 24, 25. Per quessa, pulite l'elettrodi cun un pannu senza pelucchi inumidito cù IPA. U campione da pruvà hè statu incubatu cù \({50}\,{\upmu \hbox {M} }\) MB in \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) per un inserimentu faciule. In u nostru travagliu precedente , avemu osservatu chì a sensibilità è a linearità di u sensoru hè stata migliurata da l'aumentu di a concentrazione di MB 11 .Basatu nantu à l'ottimisazioni riportati in u nostru travagliu prima, avemu usatu \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB concentrazioni per incrustà l'ADN in stu studiu. A rilevazione elettrochimica di DNA a doppia fila (ds-DNA) pò esse ottenuta utilizendu intercalatori anionici o cationici. Ancu se l'intercalatori anionici rilevanu DNA cù una selettività megliu, necessitanu incubazione di notte, chì devendenu tempi di rilevazione più longu. da l'altra banda, intercalatori cationici cum'è MB necessitanu tempi d'incubazione più brevi, circa \({1}\,{\hbox {h}}\) per a rilevazione elettrochimica di ds-DNA6. elettrodo\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), poi pulisce con un panno imbevuto di IPA, prima di procedere con un'altra mostra.una misurazione. Ogni mostra hè stata pruvata nantu à 5 elettrodi diffirenti, salvu chì ùn sia micca dichjaratu altrimenti. E misurazioni DPV è CV sò state realizate cù un potentiostat PalmSens Sensit Smart, è u software PSTrace hè stata utilizata per a cunfigurazione di potentiostat è l'acquisizione di dati, cumpresi i calculi di corrente di punta. per misure DPV è CV:
DPV: Tempu d'Equilibriu = \(8\,\hbox {s}\), Passu di Tensione = \(3\,\hbox {mV}\), Tensione di Impulsu = \(25\,\hbox {mV}\) , durata di l'impulsu = \(50\,\hbox {ms}\), frequenza di scansione = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: Tempu di Equilibriu = \(8\,\hbox {s}\), Passu di Tensione = \(3\,\hbox {mV}\), Velocità di Sweep = \({300}\,\hbox {mV/s }\)
Le correnti di picco ottenute da voltammogrammi di DNA complessati con \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
I voltammogrammi DPV è CV sò stati ottenuti nantu à elettrodi ENIG PCB \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB complexati cù DNA (à concentrazioni di 10–\({20}\,{\ hbox {ng). }/{\upmu \hbox {l}}}\) vale a dire 0,13–\({0,26}\,{\upmu \hbox {M}}\) per \(117\,\hbox {bp}\ ) è 0,03 –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) per \(503\,\hbox {bp}\)). Voltammogrammi rappresentativi sò mostrati in Figura S1 in Informazioni Supplementari. A Figura 2 mostra i risultati. di e misurazioni di DPV è CV (currente di punta) utilizendu i prudutti di PCR purificati da gel. Paragunatu à e misurazioni di CV, e misurazioni di DPV mostranu una sensibilità più alta (corrente in funzione di a cuncentrazione di DNA) perchè i currenti capacitivi di fondo in e misurazioni CV ocultanu i currenti Faradaic 26 .The data. per ogni scatula in u boxplot cuntene misurazioni da 5 elettrodi. Tutte e misurazioni utilizanu u stessu set di elettrodi per evità errori di misurazione per via di a variazione di l'elettrodu à l'elettrodu. Avemu osservatu una tendenza crescente in DPV è CV misurati i currenti picchi per cuncentrazioni più bassu di DNA. , più longu (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ paragunatu à \(117) ) fragment.Questu hè coherente cù a tendenza prevista di l'adsorzione di l'elettrodi rappurtata in u nostru travagliu precedente. l'adsorption di u cumplessu MB-DNA facilita u trasferimentu di carica nantu à l'elettrodu, chì cuntribuisci à l'aumentu di u piccu current.Altri studii anu dimustratu l'effettu di a dimensione di l'oligonucleotide è a sequenza nantu à l'intercalation MB-DNA27,28,29,30.The guanine. -cytosine (GC) cuntenutu di i dui amplicons (\(117\,\hbox {bp}\) è \(503\,\hbox {bp}\)) era circa 50%, chì indicanu chì l'osservazione A diferenza hè dovuta. Tuttavia, per concentrazioni di DNA più elevate (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), per \(503\,\hbox {bp} \) è \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) per \(117\,\hbox {bp}\)), observemu duie amplificazioni. I currenti picchi di i subs sò ridotti in e misurazioni di DPV è CV. Questu hè perchè MB satura è intercalate trà coppie di basi di DNA, risultatu in l'inhibizione sterica di l'attività redox di u gruppu reducible in MB31,32.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
I sali presenti in i mischi maestri di PCR interferiscenu cù l'interazzioni elettrostatiche trà MB è DNA, cusì aghjunghje \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) cù \({50} \,{\ upmu \hbox {M}}\) Pruduttu purificatu in gel MB per studià l'effettu di u sali nantu à l'interazzione MB-DNA. Cum'è mostra in a Figura 3, avemu osservatu chì per concentrazioni di DNA più elevate (\(>{2}\,{\ hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) è \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) per \(117\,\hbox {bp} \)), in DPV è CV L'aghjunzione di u sali ùn hà micca affettatu significativamente e misurazioni (vede a Figura S2 in Informazioni supplementari per voltammogrammi rappresentativi). cuncintrazioni di DNA più bassu, l'aghjunzione di u sali riduce assai a sensibilità, chì ùn hè micca un cambiamentu significativu in u currente cù a concentrazione di DNA. Effetti negativi simili di u sali nantu à l'interazzione MB-DNA è l'intercalazione sò stati rappurtati prima da altri ricercatori33,34.\(\hbox { I cationi Mg}^{2+}\) si leganu à a spina fosfatata negativa di l'ADN, impedendu cusì l'interazzione elettrostatica trà MB è DNA. A concentrazioni di DNA più elevate, l'inibizione sterica di MBs redox-attivi risulta in correnti picchi più bassi, cusì interazzioni elettrostatiche. ùn affettanu micca significativamente a risposta di u sensoru. U puntu chjave hè chì stu biosensore hè megliu adattatu per detectà cuncentrazioni di DNA più altu (raramente \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) o più altu), per un processu cumplettamente automatizatu di campioni d'acqua ambientale, induve a purificazione di gel di i prudutti PCR ùn pò esse fattibile.
Area sotto la curva di assorbimento per la gamma di lunghezze d'onda 600–700 \(\hbox {nm}\) per varie concentrazioni di DNA complessato con \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) cù e senza sale (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) cù e senza sale (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) concentrazioni di DNA corrispondenti a \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB campioni No DNA.
Per verificà ulteriormente i risultati sopra, avemu realizatu misure ottiche cù un spettrofotometru UV / Vis (Thermo Scientific Multiskan GO), i campioni \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) sò stati utilizati per ogni Misurazione. A firma di assorbimentu diminuisce cù l'aumentu di a cuncentrazione di DNA, cum'è pò esse vistu da a tendenza di l'area sottu a curva di assorbimentu per a gamma di lunghezze d'onda \(600\,\hbox {nm}\) à \(700\,\hbox {). nm}\), cum'è mostra in Fig. 4 (spettru di assorbimentu mostratu in Fig. S3 in Supplementary Information). {l}}}\), ùn ci era micca una differenza significativa in l'assorbimentu trà i campioni chì cuntenenu DNA è solu MB (per \(503\,\hbox {bp}\) è \(117\,\hbox {bp}\). ) frammenti di lunghezza), chì indicanu l'absenza di inibizione sterica di MB redox-attivu. À cuncentrazioni di DNA più altu, avemu osservatu una diminuzione graduale di u signale di assorbanza è nutatu una diminuzione minore di l'absorbanza in a presenza di sal. interazzione è inibizione sterica cù stacking di basi in ibridi di DNA. I nostri risultati sò coerenti cù i rapporti in a literatura nantu à studii spettroscopici di intercalazione MB-DNA chì associanu l'ipocromaticità cù livelli di energia ridotti in \(\pi\)–\(\pi ^*\ ) transizioni elettroniche per via di l'intercalazione Layers 36, 37, 38.
Elettroforesi di gel d'agarose di phage Phi6: prudutti PCR di lunghezza \(117\,\hbox {bp}\) è \(503\,\hbox {bp}\) da samples d'acqua di u lavu. Marcatore M-DNA;cuntrollu NTC-no-template, primers chì cuntenenu amplicons currispundenti;cuntrollu pusitivu di PC;1, 2, 3-undiluted (1: 1) campioni d'acqua di u lavu in triplicate. Una banda hè visibile à \(\circa 50\,\hbox {bp}\) per via di oligonucleotidi inutilizati in u \(503\,\). hbox {bp}\) corsia.
Avemu evaluatu l'utilità di u sensoru utilizendu campioni d'acqua di u lavu Powai spiked with Phi6 phage. A cuncentrazione di RNA isolata da campioni d'acqua phage-spiked variava da 15.8–\({19.4}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox { ml}}\), mentre chì quelli isolati da sospensioni di fagi purificati L'ARN hè statu stimatu à esse \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) cù una efficienza di ricuperazione di circa 1 %.RNA hè statu trascrittu inversamente in cDNA è utilizatu com'è mudellu per PCR è qPCR. A dimensione di u produttu hè stata cunfirmata da l'elettroforesi di gel d'agarose (Figura 5) prima di pruvà cù u sensor. cum'è l'amplicons d'interessu. I valori Ct registrati durante a qPCR (Table 1) sò stati dimustrati per correlate cù a cuncentrazione di RNA isolata da i campioni d'acqua spike. supera u sogliu o u signale di fondo. I valori di Ct più elevati indicanu concentrazioni di mudelli più bassi è vice versa. I valori Ct di i campioni NTC eranu alti cum'è s'aspittava. A diferenza in \(\circa 3\) valori Ct trà u cuntrollu pusitivu è a mostra di teste indicanu ancu chì ogni mostra di teste hà apprussimatamente 1% di mudellu cumparatu cù u cuntrollu pusitivu. Avemu discututu prima chì l'amplicons più longu portanu à una sensibilità megliu. di bassa cuncentrazione virali è degradazione di l'ARN. Tuttavia, cù u nostru arricchimentu di virus è u protokollu di amplificazione PCR, avemu pussutu amplificà cù successu u fragmentu \(503\,\hbox {bp}\) per a sensazione elettrochimica.
A Figura 6 mostra i risultati di u sensoru elettrochimicu di l'amplicone di fragmentu \(503\,\hbox {bp}\), tramindui cù l'ADNc non diluitu cum'è mudellu (1:1) è l'ADNc diluitu 100 volte cum'è mudellu (1:100) realizatu PCR. , Paragunatu à NTC è PC (vede a Figura S4 in l'Informazioni Supplementari per voltammograms rapprisentanti).Ogni scatula in u boxplot in Figura 6 cuntene misurazioni da trè campioni à l'elettrodi 5. I stessi elettrodi sò stati utilizati per misurà tutti i campioni per evità l'errori dovuti à l'elettrodu. -to-electrode variation.Compared to CV measurements, misure DPV mostranu una risuluzione megliu per distinguish test and PC samples from NTCs perchè, cum'è l'annunziava prima, i currenti Faradaic sò oculati per via di currenti capacitivi di fondo in l'ultime. Per amplicons più longu, avemu osservatu chì u cuntrollu negativu (NTC) hà risultatu in correnti di punta CV è DPV più altu in quantu à u cuntrollu pusitivu, mentre chì i campioni di teste pusitivi è senza diluzione mostranu altezze di picchi simili di correnti di punta DPV. I valori medii è mediani misurati per ogni senza diluzione (1: 1). ) a prova di prova è u PC pò esse chjaramente risolta da l'output di u sensoru per a mostra NTC, mentre chì a risoluzione per a mostra diluita 1: 100 hè menu pronunzia. (corrie micca mostrate in a Figura 5), è i currenti di punta DPV è CV currispondenti eranu simili à quelli previsti per NTC. I risultati per u fragmentu \(117\,\hbox {bp}\) sò mostrati in Informazioni supplementari. U negativu. U cuntrollu induva una risposta elettrochimica da u sensor PCB per via di l'adsorption di MB liberu nantu à l'elettrodu è l'interazzione di u MB cù l'oligonucleotide primariu unicu filatu. corrente di punta di a mostra di prova paragunata à a corrente di punta ottenuta da u cuntrollu negativu per ottene una misurazione differenziale (relativa)39,40 per classificà a mostra di prova cum'è pusitiva o negativa.
(a) DPV, è (b) CV di punta di corrente per a rilevazione elettrochimica di frammenti \(503\,\hbox {bp}\) in campioni d'acqua di u lavu. I campioni di prova sò stati misurati in triplicatu è paragunati à nisun cuntrollu di mudellu (NTC) è cuntrolli pusitivi (PC).
I nostri scuperti illustranu diversi meccanismi chì affettanu a prestazione di sensori elettrochimici per ampliconi di diverse lunghezze per diversi DNA, cun concentrazioni verificate da misure ottiche utilizendu un spettrofotometru UV / Vis. I nostri osservazioni sottolineanu l'intuizione chì i frammenti di DNA più longu finu à \(\approx\) \(500\,\hbox {bp}\) pò esse rilevatu cù una sensibilità più alta è chì a prisenza di sali in u campione ùn hè micca Sensibilità A concentrazione di DNA chì affetta a sensibilità più alta (raramente \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) è sopra). In più, avemu investigatu l'effettu di sfarenti tippi di campioni, cumpresi ampliconi purificati in gel cù è senza sali aghjuntu, è l'aghjunzione di campioni d'acqua di u lavu in misure DPV è CV.Avemu osservatu chì DPV hà furnitu una risoluzione megliu, postu chì a corrente capacitiva di fondo affetta ancu a misura CV, facendu menu sensibile.
L'amplificazione di frammenti più longu dipende da l'integrità di l'RNA genomicu virali. Diversi studii anu dimustratu chì l'amplificazione di frammenti più longu ùn hè micca sempre efficace per via di a degradazione di l'RNA in l'ambiente è u putenziale di splicing durante l'isolamentu11,41,42,43,44. .Avemu osservatu chì u metudu di cuncentrazione di virus basatu in PEG era più efficau in a cuncentrazione di phage Phi-6 spiked in mostri d'acqua di u lavu cà u metudu di cuncentrazione di virus basatu in idrossidu d'aluminiu. per amplificà parechje mudelli di lunghezza più corta è riduce a pussibilità di specificità croce.
I campioni biologichi sò scarsi, cusì ci hè bisognu di cuncepisce un biosensore chì richiede campioni minimi per a prova. ) campioni per a prova per copre l'area efficace di l'elettrodi. In più, u stessu elettrodu pò esse riutilizatu dopu a pulizia prima di dispensà a prossima mostra. I campioni amplificati ùn necessitanu micca l'aghjunzione di qualsiasi sustanzi chimichi altru ch'è u blu di metilenu, chì hè un prezzu di prezzu. Siccomu ogni elettrodu custa circa $ 0.55 (o INR 40) per a fabricazione, stu biosensore pò esse una alternativa à u costu di i tecnulugii di deteczione esistenti. A Tabella 2 mostra un paragone di stu travagliu cù altri sensori rappurtati in a literatura per longu. Frammenti di DNA in campioni eterogenei.
Siccomu i protokolli di rilevazione elettrochimica basati in MB si basanu nantu à a specificità di a PCR, una limitazione maiò di stu metudu hè u potenziale per l'amplificazione non specifica in campioni eterogenei, cum'è l'acqua residuale è l'acqua di u lavu o l'usu di primers di bassa purezza. metudi di rilevazione elettrochimica per a rilevazione di DNA di i prudutti PCR senza purificazione chì utilizanu elettrodi ENIG PCB senza modificazioni, hè necessariu capisce megliu l'errori introdutti da dNTP è primers inutilizati, è per ottimisà e cundizioni di reazione è i protocoli di analisi. A dumanda d'ossigenu (BOD) di a mostra d'acqua pò ancu esse misurata per migliurà a precisione di a misurazione.
In cunclusioni, prupunemu un sensore elettrochimicu ENIG PCB à pocu costu per a rilevazione di virus in campioni ambientali (acqua di lago). A cuntrariu di l'elettrodi oligonucleotidi immobilizzati o sustrati persunalizati per a rilevazione di DNA chì necessitanu un almacenamentu criogenicu per mantene a sensibilità, 53,54 a nostra tecnica usa PCB senza modificazione. elettrodi cù una durata di conservazione più longa è senza esigenze di almacenamentu specifichi è dunque adattati per u sviluppu di soluzioni di misurazione cù un processu automatizatu di campionu implementatu in LMICs. U biosensore utilizza coloranti redox (MB) intercalanti di DNA di prezzu per a rilevazione rapida di amplicons target. L'amplificazione non specifica. cumunu in i campioni ambientali riduce a specificità di stu metudu di sensazione per via di u ligame non specificu di MB à oligonucleotidi mono è doppiu filamentu. Per quessa, a specificità di sta prova dipende da l'ottimisazione di i primi è di e cundizioni di reazione PCR. è i currenti di punta DPV ottenuti da i campioni testati devenu esse interpretati relative à e risposte ottenute da u cuntrollu negativu (NTC) per ogni test. I disinni è i metudi di sensori elettrochimici presentati in stu travagliu ponu esse integrati cù autosamplers per sviluppà un sistema completamente automatizatu è bassu. - Soluzione di costu chì pò raccoglie è analizà i campioni è trasmette in wireless i risultati à u laboratoriu.
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