Gràcies per visitar Nature.com. La versió del navegador que utilitzeu té un suport limitat per a CSS. Per obtenir la millor experiència, us recomanem que utilitzeu un navegador actualitzat (o desactiveu el mode de compatibilitat a Internet Explorer). Mentrestant, per assegurar-vos suport continuat, mostrarem el lloc sense estils ni JavaScript.
La importància de controlar les mostres ambientals s'ha apreciat molt des de l'inici de la pandèmia de la COVID-19, i s'estan realitzant alguns esforços de monitorització amb l'estàndard d'or, tot i que les tècniques basades en qPCR són cares. Els biosensors electroquímics d'ADN podrien proporcionar un potencial rendible. solució per al seguiment de mostres d'aigua ambiental en països d'ingressos baixos i mitjans. En aquest treball, demostrem la detecció electroquímica d'amplicons obtinguts a partir del fag Phi6 aïllat de mostres d'aigua de llac amb puntes (un substitut popular del SARS-CoV-2), mitjançant ENIG. per completar elèctrodes de PCB sense modificació de la superfície.sexe. La resposta del sensor electroquímic es va caracteritzar a fons per a dos fragments d'ADN de diferents longituds (\({117}\,\hbox {bp}\) i \({503}\,\hbox {bp}\)), i el efecte de les sals en les mescles mestres de PCR sobre les interaccions blau de metilè (MB)-ADN. Els nostres resultats mostren que la longitud dels fragments d'ADN determina significativament la sensibilitat electroquímica i demostren en aquest treball que la capacitat de detectar amplicons llargs sense purificació de gel dels productes de PCR és important per a la mesura in situ de mostres d'aigua.Una solució totalment automatitzada per a la càrrega viral és un bon auguri.
La transmissió de virus transmesos per l'aigua es coneix com un perill per a la salut pública des de la dècada de 1940, amb les primeres evidències de transmissió per l'aigua de la poliomielitis i l'hepatitis E1. L'Organització Mundial de la Salut (OMS) ha classificat diversos patògens virals transmesos per l'aigua d'importància per a la salut de moderada a alta 2. Virus tradicional Els mètodes de detecció es basen en tècniques basades en qPCR estàndard d'or, que són molt sensibles i específiques, però requereixen personal qualificat per provar al laboratori amb instruments cars. No obstant això, als països d'ingressos baixos i mitjans (LMIC) amb recursos limitats, És probable que les proves de mostres tinguin prioritat sobre la vigilància ambiental de mostres d'aigua. Per tant, es necessiten mètodes alternatius de baix cost per a un seguiment sostenible i en temps real de les mostres d'aigua i aigües residuals als països d'ingressos baixos i mitjans com a alertes primerenques de brots de malalties emergents, protegint-los així dels greus impactes socioeconòmics de la pandèmia del virus. Els biosensors electroquímics de baix cost per als àcids nucleics podrien proporcionar una solució potencial prometedora a aquesta necessitat no satisfeta. Molts d'aquests biosensors d'ADN funcionen pel fet que les cadenes d'ADN complementàries estan immobilitzades a l'elèctrode. A continuació, es pot convertir en un senyal mitjançant diverses tècniques electroquímiques utilitzant mediadors redox com el ferro/ferrocianur de potassi. El blau de metilè (MB) és una d'aquestes molècules redox-activa, que té S'ha informat que s'intercalen en ADN de doble cadena (dsDNA) a més de la seva unió més inespecífica a l'ADN monocatenari5,6. La naturalesa d'intercalació dels MB per formar complexos MB-ADN els converteix en una opció popular com a mediadors redox en diversos ADN electroquímic. configuracions del sensor5,6,7,8,9.Tot i que la intercalació de MB amb ADN no és específica i l'especificitat d'aquest sensor electroquímic depèn en gran mesura de la puresa dels primers utilitzats per a la PCR o l'amplificació isotèrmica, és molt adequat per a la implementació real. qPCR basat en electroquímics en temps o amplificació isotèrmica de fluorescència com a alternativa a la mesura de la concentració d'ADN 9. En una d'aquestes implementacions, Won et al. La superfície dels elèctrodes d'or es va modificar amb 6-mercapto-1-hexanol (MCH) per a temps real. mesura d'amplicons de PCR amb MB mitjançant voltametria de pols diferencial (DPV)9. En altres casos, Ramírez et al. Detecció de SARS-CoV-2 en aigües residuals per reacció RT-LAMP mitjançant MB amb elèctrodes serigrafiats. També s'han realitzat elèctrodes de platí. s'utilitzen com a elèctrodes in situ en una plataforma de PCR microfluídica dissenyada per detectar electroquímicament amplicons durant les reaccions 8 . Tots aquests estudis requereixen una modificació superficial dels elèctrodes, la qual cosa implica un augment dels costos de producció i operació a causa dels requisits especials d'emmagatzematge per a l'estabilitat d'aquests elèctrodes funcionalitzats.
Esquema del flux de treball per a la detecció electroquímica d'amplicons obtinguts a partir de partícules virals concentrades en mostres d'aigua del llac.
Recentment hem demostrat la detecció electroquímica d'amplicons SARS-CoV-2 amb elèctrodes de placa de circuit imprès (PCB) de baix cost basats en DPV i voltametria cíclica (CV) induïda per l'adsorció de complexos d'ADN MB a la superfície d'elèctrodes no modificats) canvis en el pic. actual11.Informem que els fragments d'ADN més llargs (N1-N2, \({943}\, \hbox) formats mitjançant els primers N1 directes i N2 inversos recomanats pels CDC en comparació amb fragments més curts {bp}\)) van mostrar una millor linealitat en la resposta del sensor. (N1, \(72\,\hbox {bp}\))) format mitjançant conjunts d'imprimadors N1 directe i N1 invers. Aquests estudis es reporten utilitzant dilucions d'ADN preparades en aigua lliure de nucleases. La plataforma també es va utilitzar per detectar SARS-CoV. -2 amplicons en mostres simulades d'aigües residuals (obtinguts mitjançant l'addició de mostres d'ARN total amb ARN SARS-CoV-2). Atès que l'ARN és susceptible de tallar-se durant l'aïllament i el processament aigües avall,12,13 és difícil amplificar fragments més llargs amb aquesta mostra heterogènia. Per tant, la demostració de la detecció electroquímica de l'amplicó SARS-CoV-2 a les aigües residuals es limita al fragment N1 més curt \(72\,\hbox {bp}\).
En aquest treball, hem investigat la viabilitat de la detecció electroquímica basada en PCB d'ENIG del fag Phi6 concentrat i aïllat de mostres d'aigua del llac (Fig. 1). Els fags Phi6 tenen una mida comparable (80-100 nm) al SARS-CoV-2 i També tenen una membrana lipídica i una proteïna d'espiga. Per aquests motius, el bacteriòfag Phi6 és un substitut popular del SARS-CoV-2 i altres virus d'ARN patògens amb embolcall14,15. L'ARN aïllat de partícules de fags es va utilitzar com a plantilla per a la síntesi d'ADNc seguit de PCR per obtenir dos fragments d'ADN de 117 i 503 parells de bases de longitud. Donat el repte d'amplificar \(943\,\hbox {bp}\) fragments N1-N2 en el nostre treball anterior, ens orientem a fragments de longitud intermèdia (\(117 \,\hbox {bp}\) i \(503 \,\hbox {bp}\)), basats en els primers disponibles. La resposta del sensor electroquímic es va estudiar sistemàticament en un ampli rang de concentracions (\({10}\,{ \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) a \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) Per als dos fragments de La presència de MB, l'efecte de la sal sobre la resposta del sensor s'ha caracteritzat i validat creuat mitjançant mesures espectrofotomètriques. Les principals contribucions d'aquest treball són les següents:
La longitud del fragment d'ADN i la presència de sal a la mostra afecten fortament la sensibilitat.Els nostres resultats mostren que l'activitat electroquímica depèn de diferents mecanismes d'interacció del MB, l'ADN i el sensor en la resposta voltamètrica, depenent de la concentració i la longitud d'ADN, amb fragments més llargs mostren una sensibilitat més alta, tot i que la sal té un efecte negatiu en les interaccions electrostàtiques entre MB i ADN.
La concentració d'ADN determina el mecanisme d'interacció MB-ADN en elèctrodes no modificats Demostrem que diferents mecanismes d'interacció MB-ADN depenen de la concentració d'ADN. A concentracions d'ADN per sota d'una petita quantitat de \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), vam observar que la resposta de corrent electroquímica estava determinada principalment per l'adsorció d'ADN-MB a l'elèctrode, mentre que a concentracions més baixes. A concentracions elevades d'ADN, la resposta de corrent electroquímica estava determinada per la inhibició estèrica de redox. activitat deguda a la inserció de MB entre parells de bases d'ADN.
Detecció electroquímica basada en PCB ENIG d'àcids nucleics virals en mostres d'aigua del llac Les observacions es van validar mitjançant la detecció electroquímica de fragments d'ADN afegits amb Phi6 \(503\,\hbox {bp}\) obtinguts de mostres d'aigua del llac Powai, campus de l'IIT de Bombai Fag resultat.
Baix cost d'implementació i potencial d'integració en sistemes de monitorització totalment automatitzats, oligonucleòtids o aptàmers en elèctrodes amb una vida útil més llarga.
El fag Phi6 és un virus dsRNA embolicat de la família Cytoviridae que infecta Pseudomonas syringae. El genoma del fag Phi6 existeix en forma de 3 fragments: S (\(2,95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4,07 \,\hbox {Kb}\)) i L (\ (6,37\ ,\hbox{Kb}\))16,17.Com que el fag Phi6 infecta una soca de Pseudomonas BSL-1 no patògena, és segur d'utilitzar i es pot cultivar fàcilment al laboratori. El phage Phi6 i el seu hoste Pseudomonas syringae es van comprar al Centre de referència de virus bacterians Felix d'Herelle, Universitat de Laval, Canadà (els números de catàleg del centre de referència són HER-102 i HER-1102, respectivament) El fag Phi6 i el seu hoste es van reviure segons les indicacions del centre de referència. El fag Phi6 es va purificar mitjançant lisi de plaques i elució per obtenir títols finals amb \(\uns 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { ml}}\) (unitats formadores de placa/mil·lilitres). L'ARN es va aïllar de partícules de fags purificats mitjançant el kit de purificació d'ARN total universal GenElute™ (Sigma-Aldrich) segons les instruccions del fabricant. Breument, una suspensió Phi6 de fag purificada\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) es va lisar i el lisat es va carregar en una columna de rotació per permetre que l'ARN s'unís a la columna de resina. Després, l'ARN s'elueix a la solució d'elució \({ 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) proporcionada pel kit. Estimar la concentració d'ARN per absorbància a \(260\,\hbox {nm}\). L'ARN es va emmagatzemar en alíquotes a \ ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) fins a un nou ús.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) El kit de síntesi d'ADNc iScript (Bio -Rad Laboratories) es va utilitzar com a plantilla per a la síntesi d'ADNc seguint les instruccions del fabricant. Breument, una reacció de síntesi d'ADNc consta de 3 passos: cebament a \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min} }\) , transcripció inversa de \({20}\,{\hbox {min}}\) a \({46}\,{^{\circ }\hbox {C}}\), i al revés La gravadora està a \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) per a \({1}\,{\hbox {min }}\).Quan es va executar amb un gel d'agarosa a l'1%, l'ADNc va mostrar tres bandes corresponents als tres fragments d'ARN esperats (dades no mostrades). Els primers següents es van utilitzar per amplificar dos fragments d'ADN de 117 i 503 pb de longitud, utilitzant cDNA com a plantilla per a la PCR en un termociclador miniPCR® mini8:
Els cebadors per a \(117\,\hbox {bp}\) i \(503\,\hbox {bp}\) corresponen a 1476-1575 nucleòtids del segment M i 458-943 nucleòtids del segment L, respectivament àcid .Tots els productes de PCR amplificats es van electroforitzar en gels d'agarosa a l'1% i es va purificar l'ADN objectiu amplificat mitjançant el kit d'extracció de gel GeneJET (Thermo Fisher Scientific).
Es va utilitzar un llac del campus de l'IIT Mumbai (Powai Lake, Powai, Bombai) per afegir partícules de fags. L'aigua del llac es va filtrar a través d'una membrana \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) per eliminar-la. partícules en suspensió i després es va afegir el fag Phi6. Afegiu \({1}\,{\hbox {ml}}\) de \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} \) a \( {100}\ ,{\hbox {ml}}\) aigua del llac filtrada, en \({4}\,{^{\cercle}\hbox {C}}\). Es va fer una petita alíquota reservat per a la mesura de la càrrega viral mitjançant assaig de placa. Hem provat dos mètodes diferents per concentrar partícules de virus Phi6 amb punta: (1) el mètode d'adsorció-precipitació d'hidròxid d'alumini, 19 que s'ha validat per a la concentració de diversos virus d'ARN embolcallat de mostres ambientals, i (2) ) El mètode de concentració de virus basat en polietilenglicol (PEG) es va adaptar de Flood et al.20 .Com que es va trobar que l'eficiència de recuperació del mètode basat en PEG era millor que la del mètode d'hidròxid d'alumini, es va utilitzar el mètode basat en PEG per concentrar partícules Phi6 de mostres d'aigua del llac.
El mètode PEG utilitzat va ser el següent: es van afegir PEG 8000 i \(\hbox {NaCl}\) a mostres d'aigua del llac amb espiga Phi6 per obtenir un 8% de PEG 8000 i \(0,2\,\hbox {M} \) \( \ hbox {NaCl}\).Les mostres es van incubar en un agitador\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), després centrifugat a \(4700 \,\hbox {g}\) és \({45}\,{\hbox {min}}\). Descartar el sobrenedant i tornar a suspendre el pellet a \({1}\, {\hbox {ml}}\) en el mateix sobrenedant. Tots els experiments de concentració de virus i de concentració es van realitzar per triplicat. Després de la concentració, es va reservar una petita alíquota per mesurar l'eficiència de recuperació mitjançant assaig de placa. L'ARN es va aïllar tal com es va descriure anteriorment i es va eluir al tampó d'elució subministrat pel kit\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\). Com que la concentració d'ARN variarà d'una mostra a una altra per triplicat, el \({2}\,{\upmu \ hbox {l}}\) d'ARN s'utilitza per als tres, independentment de la seva concentració. Síntesi d'ADNc de les mostres. La síntesi d'ADNc es va realitzar tal com es va descriure anteriorment.\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) ADNc es va utilitzar com a plantilla per a \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR durant 35 cicles per amplificar \ (117\,\hbox {bp}\) i \(503\,\hbox { bp}\) fragments. Aquestes mostres es representen com "1:1", és a dir, sense dilució. Es va establir un control sense plantilla (NTC) com a control negatiu, mentre que es va establir un ADNc sintetitzat mitjançant ARN aïllat del fag purificat. com a plantilla per a un control positiu (PC). La PCR quantitativa (qPCR) es va realitzar en un instrument Stratagene Mx3000P RT-PCR mitjançant Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies). Les reaccions es van configurar per triplicat com anteriorment. Es va registrar el llindar del cicle (Ct) per a totes les mostres. A més, les mostres diluïdes van ser \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) utilitzant ADNc diluït 1:100 en aigua filtrada del llac com a \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR durant 35 cicles. Aquestes mostres es representen com "1:100".
Els elèctrodes de PCB es fabriquen mitjançant un procés d'immersió d'or de níquel electroless (ENIG) de baix cost disponible comercialment sense necessitat d'un revestiment d'or addicional. Les especificacions dels elèctrodes de PCB d'ENIG es detallen al nostre treball anterior. No es recomana la solució de piranha ni la voltametria cíclica d'àcid sulfúric, ja que poden provocar la pelació de la fina capa d'or (gruix \(\aprox\) \(100\,\hbox {nm }\)) i exposar les capes de coure subjacents propenses. a la corrosió 21, 22, 23, 24, 25. Per tant, netegeu els elèctrodes amb un drap sense pelusa humitejat amb IPA. La mostra a provar es va incubar amb \({50}\,{\upmu \hbox {M} }\) MB a \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) per facilitar la inserció. En el nostre treball anterior , vam observar que la sensibilitat i la linealitat del sensor es van millorar augmentant la concentració de MB 11. A partir de les optimitzacions informades en el nostre treball anterior, vam utilitzar \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB concentracions per incrustar l'ADN en aquest estudi. La detecció electroquímica d'ADN de doble cadena (ds-DNA) es pot aconseguir mitjançant intercaladors aniònics o catiònics. Tot i que els intercaladors aniònics detecten l'ADN amb millor selectivitat, requereixen una incubació durant la nit, donant lloc a temps de detecció més llargs. d'altra banda, els intercaladors catiònics com el MB requereixen temps d'incubació més curts, aproximadament \({1}\,{\hbox {h}}\) per a la detecció electroquímica de ds-DNA6. Cada mesura implica dispensar la mostra a provar a la elèctrode\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), després netejar amb un drap humitejat amb IPA, abans de procedir amb una altra mostra.una mesura. Cada mostra es va provar en 5 elèctrodes diferents tret que s'indiqui el contrari. Les mesures de DPV i CV es van realitzar amb un potentiòstat PalmSens Sensit Smart i es va utilitzar el programari PSTrace per a la configuració del potenciòstat i l'adquisició de dades, inclosos els càlculs de corrent màxima. S'utilitzen els paràmetres següents per a mesures DPV i CV:
DPV: Temps d'equilibri = \(8\,\hbox {s}\), Pas de tensió = \(3\,\hbox {mV}\), Tensió de pols = \(25\,\hbox {mV}\), durada del pols = \(50\,\hbox {ms}\), velocitat d'exploració = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: Temps d'equilibri = \(8\,\hbox {s}\), Pas de tensió = \(3\,\hbox {mV}\), Velocitat d'escombrat = \({300}\,\hbox {mV/ s }\)
Corrents màxims obtinguts a partir de voltamogrames d'ADN complexats amb \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
Es van obtenir voltamogrames DPV i CV en elèctrodes ENIG PCB \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB complexats amb ADN (a concentracions de 10–\({20}\,{\ hbox {ng). }/{\upmu \hbox {l}}}\) és a dir, 0,13–\({0,26}\,{\upmu \hbox {M}}\) per a \(117\,\hbox {bp}\ ) i 0,03 –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) per a \(503\,\hbox {bp}\)). Els voltamogrames representatius es mostren a la figura S1 a la informació complementària. La figura 2 mostra els resultats. de mesures de DPV i CV (corrent màxima) utilitzant productes de PCR purificats amb gel. En comparació amb les mesures de CV, les mesures de DPV mostren una sensibilitat més alta (corrent en funció de la concentració d'ADN) perquè els corrents capacitius de fons en les mesures de CV amaguen corrents faradaiques 26 .Les dades per a cada caixa del diagrama de caixa conté mesures de 5 elèctrodes. Totes les mesures utilitzen el mateix conjunt d'elèctrodes per evitar errors de mesura a causa de la variació d'elèctrode a elèctrode. Hem observat una tendència creixent en els corrents màxims mesurats DPV i CV per a concentracions més baixes d'ADN , més llarg (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ en comparació amb \(117) ) fragment. Això és coherent amb la tendència esperada d'adsorció d'elèctrodes informada en el nostre treball anterior. l'adsorció del complex MB-DNA facilita la transferència de càrrega a l'elèctrode, la qual cosa contribueix a l'augment del corrent de pic. Altres estudis han demostrat l'efecte de la mida i la seqüència dels oligonucleòtids en la intercalació de l'ADN MB27,28,29,30.La guanina El contingut de -citosina (GC) dels dos amplicons (\(117\,\hbox {bp}\) i \(503\,\hbox {bp}\)) era aproximadament del 50%, cosa que indica que l'observació La diferència es deu a la longitud de l'amplicó. No obstant això, per a concentracions d'ADN més altes (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), per a \(503\,\hbox {bp} \) i \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) per a \(117\,\hbox {bp}\)), observem dues amplificacions El els corrents màxims dels subs es redueixen tant en les mesures de DPV com de CV. Això es deu al fet que el MB satura i s'intercala entre parells de bases d'ADN, donant lloc a la inhibició estèrica de l'activitat redox del grup reductible en MB31,32.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
Les sals presents a les mescles mestres de PCR interfereixen amb les interaccions electrostàtiques entre MB i ADN, de manera que afegint \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) amb \({50} \,{\ upmu \hbox {M}}\) Producte purificat amb gel MB per estudiar l'efecte de la sal sobre la interacció MB-ADN. Tal com es mostra a la figura 3, vam observar que per a concentracions d'ADN més altes (\(>{2}\,{\ hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) i \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) per a \(117\,\hbox {bp} \)), en DPV i CV L'addició de sal no va afectar significativament les mesures (vegeu la figura S2 a la informació complementària per als voltamogrames representatius). concentracions d'ADN més baixes, l'addició de sal redueix considerablement la sensibilitat, la qual cosa resulta en cap canvi significatiu en el corrent amb la concentració d'ADN. Altres investigadors han informat anteriorment d'efectes negatius similars de la sal sobre les interaccions i la intercalació d'ADN MB-ADN33,34.\(\hbox { Els cations Mg}^{2+}\) s'uneixen a l'esquelet de fosfat negatiu de l'ADN, dificultant així la interacció electrostàtica entre MB i ADN. A concentracions més altes d'ADN, la inhibició estèrica dels MB actius redox produeix corrents pic més baixes, de manera que les interaccions electrostàtiques no afecten significativament la resposta del sensor. El punt clau és que aquest biosensor és més adequat per detectar concentracions d'ADN més altes (rarament \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) o superior), per al processament totalment automatitzat de mostres d'aigua ambiental, on la purificació en gel dels productes de PCR pot no ser factible.
Àrea sota la corba d'absorció per a l'interval de longitud d'ona 600–700 \(\hbox {nm}\) per a diverses concentracions d'ADN complexat amb \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) amb i sense sal (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) amb i sense sal (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) Concentracions d'ADN corresponents a \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) mostres de MB Sense ADN.
Per verificar encara més els resultats anteriors, vam realitzar mesures òptiques mitjançant un espectrofotòmetre UV/Vis (Thermo Scientific Multiskan GO), les mostres \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) es van utilitzar per a cadascuna. Mesura. La signatura d'absorció disminueix amb l'augment de la concentració d'ADN, com es pot veure a la tendència de l'àrea sota la corba d'absorció per al rang de longitud d'ona \(600\,\hbox {nm}\) a \(700\,\hbox { nm}\), tal com es mostra a la figura 4 (espectre d'absorció que es mostra a la figura S3 a la informació suplementària). Per a mostres amb concentracions d'ADN inferiors a \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), no hi va haver cap diferència significativa en l'absorció entre les mostres que contenen ADN i només MB (per a \(503\,\hbox {bp}\) i \(117\,\hbox {bp}\) ) de longitud), que indica l'absència d'inhibició estèrica del MB actiu redox. A concentracions d'ADN més altes, vam observar una disminució gradual del senyal d'absorbància i vam observar una disminució menor de l'absorbància en presència de sal. Aquests resultats es van atribuir a la funció molecular. interaccions i inhibició estèrica amb l'apilament de bases en híbrids d'ADN. Els nostres resultats són coherents amb els informes de la literatura sobre estudis espectroscòpics d'intercalació MB-ADN que associen hipocromaticitat amb nivells d'energia reduïts en \(\pi\)–\(\pi ^*\ ) transicions electròniques degudes a la intercalació Capes 36, 37, 38.
Electroforesi en gel d'agarosa del fag Phi6: productes de PCR de longitud \(117\,\hbox {bp}\) i \(503\,\hbox {bp}\) a partir de mostres d'aigua del llac. Marcador M-DNA;Control NTC sense plantilla, cebadors que contenen amplicons corresponents;control positiu de PC;1, 2, 3-sense diluir (1:1) mostres d'aigua del llac per triplicat. És visible una banda a \(\uns 50\,\hbox {bp}\) a causa dels oligonucleòtids no utilitzats al \(503\,\). carril hbox {bp}\).
Vam avaluar la utilitat del sensor utilitzant mostres d'aigua del llac Powai carregades amb el fag Phi6. Les concentracions d'ARN aïllades de mostres d'aigua amb picades de fags oscil·laven entre 15,8–\({19,4}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox { ml}}\), mentre que aquells aïllats de suspensions de fags purificats es va estimar que l'ARN era \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) amb una eficiència de recuperació d'aproximadament 1 El %.RNA es va transcriure inversament a l'ADNc i es va utilitzar com a plantilla per a PCR i qPCR. La mida del producte es va confirmar mitjançant electroforesi en gel d'agarosa (figura 5) abans de provar amb el sensor. Aquestes mostres no estan purificades en gel i, per tant, contenen tots els components de la PCR com a així com els amplicons d'interès. Es va demostrar que els valors de Ct registrats durant la qPCR (taula 1) es correlacionen amb la concentració d'ARN aïllat de les mostres d'aigua amb picades corresponents. El valor de Ct revela el nombre de cicles necessaris perquè el senyal fluorescent superen el llindar o el senyal de fons. Els valors de Ct més alts indiquen concentracions de plantilla més baixes i viceversa. Els valors de Ct de les mostres de NTC eren tan alts com s'esperava. La diferència de valors de Ct \(\aproximadament 3\) entre el control positiu i la mostra de prova indiquen a més que cada mostra de prova té aproximadament un 1% de plantilla en comparació amb el control positiu. Anteriorment hem comentat que els amplicons més llargs donen lloc a una millor sensibilitat. L'amplificació de fragments més llargs aïllats de mostres ambientals heterogènies és un repte donats els desavantatges. de baixa concentració viral i degradació de l'ARN. No obstant això, amb el nostre protocol d'enriquiment de virus i d'amplificació per PCR, vam poder amplificar amb èxit el fragment \(503\,\hbox {bp}\) per a la detecció electroquímica.
La figura 6 mostra els resultats del sensor electroquímic de l'amplicó del fragment \(503\,\hbox {bp}\), ambdós utilitzant ADNc no diluït com a plantilla (1:1) i ADNc diluït 100 vegades com a plantilla (1:100) realitzada per PCR. , en comparació amb NTC i PC (vegeu la figura S4 a la informació complementària per a voltamogrames representatius). Cada caixa del diagrama de caixa de la figura 6 conté mesures de tres mostres a 5 elèctrodes. Es van utilitzar els mateixos elèctrodes per mesurar totes les mostres per evitar errors a causa de l'elèctrode. En comparació amb les mesures de CV, les mesures de DPV mostren una millor resolució per distingir les mostres de prova i de PC de les NTC perquè, com s'ha esmentat anteriorment, els corrents Faradaic s'amaguen a causa dels corrents capacitius de fons en aquests últims. Per a amplicons més llargs, vam observar que el control negatiu (NTC) va donar lloc a corrents de pic CV i DPV més altes en relació amb el control positiu, mentre que les mostres de prova positives i no diluïdes van mostrar altures pics similars de corrents pics de DPV. Els valors mitjans i mitjans mesurats per a cada no diluït (1:1). ) la mostra de prova i el PC es poden resoldre clarament a partir de la sortida del sensor per a la mostra NTC, mentre que la resolució de la mostra diluïda 1:100 és menys pronunciada. Per a una dilució de 100 vegades d'ADNc, no vam observar cap banda durant l'electroforesi en gel. (carrils no mostrats a la figura 5) i els corrents màxims DPV i CV corresponents eren similars als esperats per a NTC. Els resultats del fragment \(117\,\hbox {bp}\) es mostren a Informació suplementària. El negatiu El control va induir una resposta electroquímica del sensor de PCB a causa de l'adsorció de MB lliure a l'elèctrode i la interacció del MB amb l'oligonucleòtid de cebador monocatenari. Per tant, cada vegada que es prova una mostra, s'ha d'executar un control negatiu i corrent màxim de la mostra de prova en comparació amb el corrent màxim obtingut pel control negatiu per aconseguir una mesura diferencial (relativa)39,40 per classificar la mostra de prova com a positiva o negativa.
(a) DPV i (b) corrent màxima CV per a la detecció electroquímica de fragments \(503\,\hbox {bp}\) en mostres d'aigua del llac. Les mostres de prova es van mesurar per triplicat i es van comparar amb cap control de plantilla (NTC) i controls positius (PC).
Les nostres troballes il·lustren diferents mecanismes que afecten el rendiment dels sensors electroquímics per a amplicons de diferents longituds per a diferents ADN, amb concentracions verificades mitjançant mesures òptiques mitjançant un espectrofotòmetre UV/Vis. Les nostres observacions subratllen la visió que els fragments d'ADN més llargs fins a \(\aprox\) \(500\,\hbox {bp}\) es pot detectar amb una sensibilitat més alta i que la presència de sal a la mostra no. \hbox {l}}}\) i superior). A més, vam investigar l'efecte de diferents tipus de mostres, inclosos els amplicons purificats amb gel amb i sense sal afegida, i l'addició de mostres d'aigua del llac en mesures de DPV i CV.Hem observat que el DPV proporciona una millor resolució, ja que el corrent capacitiu de fons també afecta la mesura del CV, fent-la menys sensible.
L'amplificació de fragments més llargs depèn de la integritat de l'ARN genòmic viral. Diversos estudis han demostrat que l'amplificació de fragments més llargs no sempre és eficient a causa de la degradació de l'ARN a l'entorn i el potencial d'empalmament durant l'aïllament11,41,42,43,44 .Vam observar que el mètode de concentració de virus basat en PEG era més eficaç per concentrar el fag Phi-6 augmentat en mostres d'aigua del llac que el mètode de concentració de virus basat en hidròxid d'alumini. La capacitat de detectar fragments d'ADN llargs va demostrar superar el requisit de PCR múltiple. per amplificar múltiples plantilles de longitud més curta i reduir la possibilitat d'especificitat creuada.
Les mostres biològiques són escasses, per la qual cosa cal dissenyar un biosensor que requereixi mostres mínimes per a la prova. Els elèctrodes de PCB ENIG utilitzats en aquest estudi només necessitaven \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ ) mostres per provar per cobrir l'àrea efectiva dels elèctrodes. A més, el mateix elèctrode es pot reutilitzar després de netejar abans de dispensar la següent mostra. Les mostres amplificades no requereixen l'addició de cap producte químic que no sigui el blau de metilè, que és un producte econòmic Com que cada elèctrode costa uns 0,55 dòlars (o 40 INR) de fabricació, aquest biosensor pot ser una alternativa rendible a les tecnologies de detecció existents. La taula 2 mostra una comparació d'aquest treball amb altres sensors que es descriuen a la literatura durant molt de temps. Fragments d'ADN en mostres heterogènies.
Atès que els protocols de detecció electroquímica basats en MB es basen en l'especificitat de la PCR, una limitació important d'aquest mètode és el potencial d'amplificació inespecífica en mostres heterogènies, com ara aigües residuals i aigües de llac o utilitzant primers de baixa puresa. Per millorar la sensibilitat de mètodes de detecció electroquímica per a la detecció d'ADN de productes de PCR no purificats utilitzant elèctrodes de PCB ENIG no modificats, és necessari entendre millor els errors introduïts per dNTPs i cebadors no utilitzats, i optimitzar les condicions de reacció i els protocols d'assaig. Paràmetres fisicoquímics addicionals com el pH, la temperatura i els biològics També és possible que s'hagi de mesurar la demanda d'oxigen (DBO) de la mostra d'aigua per millorar la precisió de la mesura.
En conclusió, proposem un sensor electroquímic ENIG PCB de baix cost per a la detecció de virus en mostres ambientals (aigua del llac). A diferència dels elèctrodes d'oligonucleòtids immobilitzats o substrats personalitzats per a la detecció d'ADN que requereixen emmagatzematge criogènic per mantenir la sensibilitat,53,54 la nostra tècnica utilitza PCB no modificat. elèctrodes amb una vida útil més llarga i sense requisits d'emmagatzematge específics i, per tant, adequats per al desenvolupament de solucions de mesura amb processament de mostres automatitzat desplegat en LMICs. El biosensor utilitza colorants redox (MB) d'intercalació d'ADN econòmics per a la detecció ràpida d'amplicons objectiu. L'amplificació inespecífica comú en mostres ambientals redueix l'especificitat d'aquest mètode de detecció a causa de la unió inespecífica de MBs a oligonucleòtids de cadena simple i doble. Per tant, l'especificitat d'aquesta prova depèn de l'optimització dels cebadors i les condicions de la reacció de PCR. A més, el CV i els corrents pics de DPV obtinguts a partir de les mostres provades s'han d'interpretar en relació amb les respostes obtingudes del control negatiu (NTC) per a cada prova. Els dissenys i mètodes de sensors electroquímics que es presenten en aquest treball es poden integrar amb mostrejos automàtics per desenvolupar - solució de costos que pot recollir i analitzar mostres i transmetre sense fil els resultats al laboratori.
Cashdollar, J. & Wymer, L. Mètodes per a la concentració inicial de virus a partir de mostres d'aigua: una revisió i metaanàlisi d'estudis recents.J.Aplicació.microorganisme.115, pàgs. 1-11 (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL Waterborne viruses: Barriers to safe drinking water.PLoS Pathogens.11, E1004867 (2015).
Shrestha, S. et al.Epidemiologia d'aigües residuals per a una vigilància rendible a gran escala de COVID-19 als països d'ingressos baixos i mitjans: reptes i oportunitats. Water 13, 2897 (2021).
Palecek, E. & Bartosik, M. Nucleic acid electrochemistry.Chemical.Rev.112, 3427–3481 (2012).
Tani, A., Thomson, AJ i Butt, JN Blau de metilè com a discriminador electroquímic d'oligonucleòtids de cadena simple i doble immobilitzat sobre substrats d'or. Analista 126, 1756–1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ Comparació d'intercaladors de cations i anions per a la transducció electroquímica de la hibridació de l'ADN per transferència d'electrons a llarg abast.Electrochemistry.comminicate.6, 648–654 (2004).
Wong, EL i Gooding, JJ Transferència de càrrega a través de l'ADN: un biosensor d'ADN electroquímic selectiu.anus.Chemical.78, 2138–2144 (2006).
Fang, TH et al.Dispositiu microfluídic de PCR en temps real amb detecció electroquímica concurrent.sensor biològic.Bioelectronics.24, 2131–2136 (2009).
Win, BY et al. Estudi del mecanisme de senyalització i verificació del rendiment d'un sistema electroquímic de PCR en temps real basat en la interacció del blau de metilè amb l'ADN. Analyst 136, 1573–1579 (2011).
Ramirez-Chavarria, RG et al.Sensor electroquímic basat en amplificació isotèrmica mediat per bucle per a la detecció de sars-cov-2 en mostres d'aigües residuals.J.Environment.Chemical.Britain.10, 107488 (2022).
Kumar, M. et al.Detecció electroquímica dels amplicons SARS-CoV-2 amb elèctrodes de PCB. El sensor està activat.B Chemistry.343, 130169 (2021).
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. i Yoshida, H. Detecció eficient de l'ARN SARS-CoV-2 a la fracció sòlida de wastewater.science.general environment.763, 144587 (2021).
Alygizakis, N. et al.Analytical Methods for SARS-CoV-2 Detection in Wastewater: Protocol and Future Perspectives.TraC trending anal.Chemical.134, 116125 (2020).
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. i Kashtan, N. Supervivència del bacteriòfag envoltat Phi6 (un substitut del SARS-CoV-2) en gotes de saliva evaporades dipositades sobre superfícies de vidre.ciència.Rep.10, 1–10 (2020).
Dey, R., Dlusskaya, E. i Ashbolt, NJ Persistència ambiental d'un substitut del SARS-CoV-2 (Phi6) en ameba de vida lliure.J.Salut de l'aigua 20, 83 (2021).
Mindich, L. Embalatge precís de tres fragments genòmics de bacteriòfag d'ARN de doble cadena\(\varphi\)6.microorganism.Moore.biology.Rev.63, 149–160 (1999).
Pirtimaa, MJ & Bamford, Estructura secundària de la regió d'envasament del fago DH RNA\(\varphi\)6.RNA 6, 880–889 (2000).
Bonilla, N. et al.Phages on the Tap - Un protocol ràpid i eficaç per a la preparació d'existències de laboratori de bacteriòfags. PeerJ 4, e2261 (2016).
Hora de publicació: 27-maig-2022