Hvala vam što ste posjetili Nature.com. Verzija preglednika koju koristite ima ograničenu podršku za CSS. Za najbolje iskustvo, preporučujemo da koristite ažurirani preglednik (ili isključite način kompatibilnosti u Internet Exploreru). U međuvremenu, kako biste osigurali kontinuirana podrška, prikazat ćemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Važnost praćenja uzoraka životne sredine veoma je cijenjena od početka pandemije COVID-19, a neki napori u praćenju vrše se korištenjem zlatnog standarda, iako su tehnike zasnovane na qPCR skupe. Elektrohemijski DNK biosenzori bi mogli pružiti potencijalno isplativ rješenje za praćenje uzoraka vode iz okoliša u zemljama niskog i srednjeg dohotka. U ovom radu demonstriramo elektrohemijsku detekciju amplikona dobijenih iz Phi6 faga izolovanog iz uzoraka vode jezera (popularni surogat za SARS-CoV-2), koristeći ENIG za kompletiranje PCB elektroda bez modifikacije površine.sex.Odziv elektrohemijskog senzora je detaljno okarakterisan za dva fragmenta DNK različite dužine (\({117}\,\hbox {bp}\) i \({503}\,\hbox {bp}\)), i efekat soli u PCR master mešavinama na interakcije metilensko plavo (MB)-DNK. Naši rezultati pokazuju da dužina fragmenata DNK značajno određuje elektrohemijsku osetljivost i pokazuju u ovom radu da je sposobnost detekcije dugih amplikona bez prečišćavanja PCR proizvoda gelom važno za in situ mjerenje uzoraka vode.Potpuno automatizirano rješenje za virusno opterećenje je dobro.
Prenos virusa putem vode poznat je kao opasnost za javno zdravlje od 1940-ih, s prvim dokazima o prijenosu vodenim paralizom i hepatitisa E1. Svjetska zdravstvena organizacija (WHO) je klasificirala nekoliko virusnih patogena koji se prenose vodom od umjerenog do visokog zdravstvenog značaja2.Tradicionalni virus metode detekcije oslanjaju se na tehnike zasnovane na zlatnom standardu qPCR, koje su vrlo osjetljive i specifične, ali zahtijevaju kvalifikovano osoblje za testiranje u laboratoriji koristeći skupe instrumente. Međutim, u zemljama niskog i srednjeg dohotka (LMIC) s ograničenim resursima, ljudski testiranje uzoraka će vjerovatno imati prednost u odnosu na praćenje uzoraka vode iz okoliša. Stoga su potrebne alternativne metode niske cijene za održivo praćenje uzoraka vode i otpadnih voda u realnom vremenu u zemljama sa niskim i srednjim prihodima kao rana upozorenja na pojavu izbijanja bolesti, čime se štite od teških socioekonomskih uticaja pandemije virusa. Jeftini elektrohemijski biosenzori za nukleinske kiseline mogu pružiti obećavajuće potencijalno rešenje za ovu nezadovoljenu potrebu. Mnogi od ovih DNK biosenzora rade činjenicom da su komplementarni lanci DNK imobilisani na elektrodi površine i hibridiziraju kada je odgovarajuća sekvenca prisutna u uzorku. Ovo se zatim može pretvoriti u signal različitim elektrohemijskim tehnikama korištenjem redoks medijatora kao što je kalijum željezo/ferocijanid. Metilensko plavo (MB) je jedna takva redoks aktivna molekula, koja ima prijavljeno je da se interkaliraju u dvolančanu DNK (dsDNA) pored svog nespecifičnog vezivanja za jednolančanu DNK5,6. Interkalirajuća priroda MB za formiranje MB-DNK kompleksa čini ih popularnim izborom kao redoks medijatorima u nekoliko elektrohemijskih DNK konfiguracije senzora5,6,7,8,9. Iako je interkalacija MB u DNK nespecifična, a specifičnost ovog elektrohemijskog senzora u velikoj mjeri ovisi o čistoći prajmera koji se koristi za PCR ili izotermno pojačanje, on je vrlo pogodan za implementaciju stvarnog -vremenski elektrohemijski baziran qPCR ili fluorescentna izotermalna amplifikacija kao alternativa mjerenju koncentracije DNK 9 .U jednoj takvoj implementaciji, Won et al. Površina zlatnih elektroda je modificirana sa 6-merkapto-1-heksanolom (MCH) za realno vrijeme mjerenje PCR amplikona sa MB korištenjem diferencijalne pulsne voltametrije (DPV)9. U drugim slučajevima, Ramirez i ostali. Detekcija SARS-CoV-2 u otpadnoj vodi reakcijom RT-LAMP korištenjem MB sa elektrodama otisnutim ekranom. Platinaste elektrode su također koriste se kao in situ elektrode u mikrofluidnoj PCR platformi dizajniranoj da elektrohemijski detektuje amplikone tokom reakcija 8 .Sve ove studije zahtevaju modifikaciju površine elektroda, što podrazumeva povećane proizvodne i operativne troškove zbog posebnih zahteva za skladištenje za stabilnost ovih funkcionalizovanih elektroda.
Šema toka rada za elektrohemijsku detekciju amplikona dobijenih iz koncentrisanih virusnih čestica u uzorcima vode jezera.
Nedavno smo demonstrirali elektrohemijsko sensiranje SARS-CoV-2 amplikona sa jeftinim elektrodama na štampanoj ploči (PCB) baziranim na DPV i cikličkoj voltametriji (CV) indukovanoj adsorpcijom kompleksa MB-DNK na površini nemodifikovanih elektroda) promenama u piku struja11.Izvještavamo da su duži DNK fragmenti (N1-N2, \({943}\, \hbox) formirani korištenjem N1 naprijed i N2 reverznih prajmera koje preporučuje CDC u poređenju sa kraćim fragmentima {bp}\)) pokazali bolju linearnost u odgovoru senzora ( N1, \(72\,\hbox {bp}\)) formiran korištenjem N1 naprijed i N1 reverznih prajmera. Ove studije su objavljene korištenjem razblaženja DNK pripremljene u vodi bez nukleaza. Platforma je također korištena za otkrivanje SARS-CoV -2 amplikona u simuliranim uzorcima otpadne vode (dobijenim dodavanjem uzoraka ukupne RNK sa SARS-CoV-2 RNA). Budući da je RNK podložna smicanju tokom izolacije i dalje obrade, 12,13 teško je amplificirati duže fragmente ovim heterogenim uzorkom. Stoga je demonstracija elektrohemijskog sensiranja SARS-CoV-2 amplikona u otpadnoj vodi ograničena na kraći \(72\,\hbox {bp}\) N1 fragment.
U ovom radu smo istražili izvodljivost elektrohemijskog sensinga na bazi ENIG PCB-a faga Phi6 koncentriranog i izolovanog iz uzoraka vode jezera (slika 1). Phi6 fagi su uporedivi po veličini (80-100 nm) sa SARS-CoV-2 i također imaju lipidnu membranu i šiljasti protein. Iz ovih razloga, bakteriofag Phi6 je popularan surogat za SARS-CoV-2 i druge omotane patogene RNK viruse14,15. RNK izolirana iz čestica faga korištena je kao šablon za sintezu cDNK, a zatim PCR za dobijanje dva DNK fragmenta dužine 117 i 503 para baza. S obzirom na izazov amplifikacije \(943\,\hbox {bp}\) N1-N2 fragmenata u našem prethodnom radu, ciljamo fragmente srednje dužine (\(117 \,\hbox {bp}\) i \(503 \,\hbox {bp}\)), na osnovu dostupnih prajmera. Elektrohemijski odgovor senzora je sistematski proučavan u širokom rasponu koncentracija (\({10}\,{ \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) do \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) Za oba fragmenta u prisustvo MB, efekat soli na odziv senzora je okarakterisan i unakrsno potvrđen spektrofotometrijskim merenjima. Glavni doprinosi ovog rada su sledeći:
Dužina fragmenta DNK i prisustvo soli u uzorku snažno utiču na osetljivost.Naši rezultati pokazuju da elektrohemijska aktivnost zavisi od različitih mehanizama interakcije MB, DNK i senzora u voltametrijskom odgovoru, u zavisnosti od koncentracije i dužine DNK, pri čemu duži fragmenti pokazuju veću osetljivost, iako sol negativno utiče na elektrostatičke interakcije između MB i DNK.
Koncentracija DNK određuje mehanizam interakcije MB-DNK u nemodificiranim elektrodama. Pokazali smo da različiti mehanizmi interakcije MB-DNK zavise od koncentracije DNK. Pri koncentracijama DNK ispod male količine \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox) {l}}}\), uočili smo da je elektrohemijski strujni odgovor uglavnom određen adsorpcijom MB-DNK na elektrodi, dok je pri nižim koncentracijama Pri visokim koncentracijama DNK, odgovor elektrokemijske struje određen steričnom inhibicijom redoks-a aktivnost zbog umetanja MB između baznih parova DNK.
Elektrohemijsko ispitivanje virusnih nukleinskih kiselina u uzorcima vode jezera bazirano na ENIG PCB-a Opažanja su potvrđena elektrohemijskom detekcijom Phi6-dodatih fragmenata DNK \(503\,\hbox {bp}\) dobijenih iz uzoraka vode iz jezera Powai, IIT Mumbai Campus Rezultat fag.
Niska cijena implementacije i mogućnost integracije u potpuno automatizirane sisteme za praćenje, oligonukleotidi ili aptameri na elektrodama sa dužim vijekom trajanja.
Phi6 Phi6 je omotani dsRNA virus iz porodice Cytoviridae koji inficira Pseudomonas syringae. Genom Phi6 faga postoji u obliku 3 fragmenta: S (\(2.95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4.07) \,\hbox {Kb}\)) i L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\))16,17. Pošto Phi6 fag inficira nepatogeni soj BSL-1 Pseudomonas, siguran je za upotrebu i može se lako uzgajati u laboratoriji. Phage Phi6 i njegov domaćin Pseudomonas syringae kupljeni su od Referentnog centra za bakterijske viruse Felix d'Herelle, Univerziteta Laval, Kanada (kataloški brojevi referentnog centra su HER-102 i HER-1102, respektivno) .Phi6 fag i njegov domaćin su oživljeni prema uputama referentnog centra. Fag Phi6 je pročišćen lizom ploče i elucijom da bi se dobio konačni titar sa \(\oko 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { ml}}\) (jedinice koje formiraju plak/mililitre).RNA je izolirana iz pročišćenih čestica faga korištenjem GenElute™ Universal Total RNA Purification Kit (Sigma-Aldrich) prema uputama proizvođača. Ukratko, suspenzija pročišćenog faga Phi6\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) je lizirano i lizat je stavljen na spin kolonu kako bi se omogućilo RNK da se veže za kolonu smole. RNK se zatim eluira u otopini za eluiranje \({ 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) dobijen u kompletu. Procijenite koncentraciju RNK prema apsorbanciji na \(260\,\hbox {nm}\).RNA je pohranjena u alikvotima u \ ({-80}\,{^{\circ}\hbox {C}}\) do dalje upotrebe.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) iScript komplet za sintezu cDNK (Bio -Rad Laboratories) je korišćen kao šablon za sintezu cDNK prema uputstvima proizvođača. Ukratko, reakcija sinteze cDNK se sastoji od 3 koraka: prajming na \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min} }\) , obrnuta transkripcija \({20}\,{\hbox {min}}\) na \({46}\,{^{\circ }\hbox {C}}\), i obrnuto Diktafon je u \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) za \({1}\,{\hbox {min }}\). Kada se radi na 1% agaroznom gelu, cDNK je pokazala tri trake koje odgovaraju očekivana tri RNA fragmenta (podaci nisu prikazani). Sljedeći prajmeri su korišteni za amplifikaciju dva fragmenta DNK dužine 117 i 503 bp, koristeći cDNK kao šablon za PCR u miniPCR® mini8 termalnom ciklusu:
Prajmeri za \(117\,\hbox {bp}\) i \(503\,\hbox {bp}\) odgovaraju 1476-1575 nukleotida M segmenta i 458-943 nukleotida L segmenta, odnosno kiselih Svi pojačani PCR proizvodi su podvrgnuti elektroforezi na 1% agaroznih gelova, a amplificirana ciljna DNK je pročišćena korištenjem GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Fisher Scientific).
Jezero u kampusu IIT Mumbai (Powai Lake, Powai, Mumbai) korišteno je za dodavanje čestica faga. Voda iz jezera je filtrirana kroz \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) membranu da bi se uklonila suspendovane čestice, a zatim je dodan Phi6 fag. Dodajte \({1}\,{\hbox {ml}}\) od \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} \) do \( {100}\ ,{\hbox {ml}}\) filtrirane vode jezera, u \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\). Mali alikvot je bio rezervirano za mjerenje virusnog opterećenja pomoću testa plaka. Testirali smo dvije različite metode za koncentriranje čestica virusa Phi6 sa šiljcima: (1) metodu adsorpcije-precipitacije aluminijum hidroksida,19 koja je potvrđena za koncentraciju nekoliko virusa sa omotačem RNA iz uzoraka okoliša, i (2) ) Metoda koncentracije virusa na bazi polietilen glikola (PEG) prilagođena je od Flood et al.20. Pošto je utvrđeno da je efikasnost oporavka metode bazirane na PEG-u bolja od one metode aluminij hidroksida, metoda zasnovana na PEG-u je korištena za koncentriranje čestica Phi6 iz uzoraka vode jezera.
Korištena PEG metoda je sljedeća: PEG 8000 i \(\hbox {NaCl}\) dodani su uzorcima jezerske vode sa Phi6 šiljcima da se dobije 8% PEG 8000 i \(0,2\,\hbox {M} \) \( \ hbox {NaCl}\).Uzorci su inkubirani na šejkeru\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), zatim centrifugiran na \(4700 \,\hbox {g}\) je \({45}\,{\hbox {min}}\). Odbacite supernatant i resuspendirajte pelet u \({1}\, {\hbox {ml}}\) u istom supernatantu. Svi eksperimenti sa dodatkom i koncentracijom virusa izvedeni su u tri primjerka. Nakon koncentracije, mali alikvot je rezerviran za mjerenje efikasnosti oporavka pomoću analize plaka. RNK je izolirana kako je prethodno opisano i eluirana u puferu za eluiranje koji se isporučuje u kompletu\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\). Budući da će koncentracija RNK varirati od uzorka do uzorka u tri primjerka, \({2}\,{\upmu \ hbox {l}}\) RNK se koristi za sva tri bez obzira na njegovu koncentraciju cDNK sinteza uzoraka. Sinteza cDNK je izvedena kako je prethodno opisano.\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNK je korišten kao šablon za \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR za 35 ciklusa za amplificiranje \ (117\,\hbox {bp}\) i \(503\,\hbox { bp}\) fragmenti. Ovi uzorci su predstavljeni kao “1:1″, tj. bez razrjeđivanja. Kontrola bez šablona (NTC) je postavljena kao negativna kontrola, dok je postavljena cDNA sintetizirana korištenjem RNK izolovane iz pročišćenog faga kao šablon za pozitivnu kontrolu (PC). Kvantitativni PCR (qPCR) je izveden u Stratagene Mx3000P RT-PCR instrumentu koristeći Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies). Reakcije su postavljene u tri primjerka kao i ranije opisano. Prag ciklusa (Ct) je zabilježen za sve uzorke. Osim toga, razrijeđeni uzorci su \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) korištenjem cDNK razrijeđene 1:100 u filtriranoj jezerskoj vodi kao \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR za 35 ciklusa. Ovi uzorci su predstavljeni kao “1:100″.
PCB elektrode se proizvode korištenjem komercijalno dostupnog jeftinog procesa Electroless Nickel Immersion Gold (ENIG) bez potrebe za dodatnim pozlaćenjem. Specifikacije ENIG PCB elektroda su detaljno opisane u našem prethodnom radu11. Za ENIG PCB elektrode, tradicionalne metode čišćenja elektroda kao što su otopina pirane ili ciklična voltametrija sumporne kiseline se ne preporučuju jer mogu uzrokovati ljuštenje tankog zlatnog sloja (debljine \(\približno\) \(100\,\hbox {nm }\)) i otkriti podložne slojeve bakra koji su skloni do korozije 21, 22, 23, 24, 25. Zbog toga očistite elektrode krpom koja ne ostavlja dlačice navlaženom IPA. Uzorak koji se testira je inkubiran sa \({50}\,{\upmu \hbox {M}) }\) MB u \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) za jednostavno umetanje. U našem prethodnom radu , primijetili smo da su osjetljivost i linearnost senzora poboljšani povećanjem koncentracije MB 11 . Na osnovu optimizacija prijavljenih u našem ranijem radu, koristili smo \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB koncentracije za ugradnju DNK u ovu studiju. Elektrohemijska detekcija dvolančane DNK (ds-DNK) može se postići upotrebom anionskih ili kationskih interkalatora. Iako anjonski interkalatori detektuju DNK sa boljom selektivnošću, zahtijevaju inkubaciju preko noći, što rezultira dužim vremenom detekcije. s druge strane, kationski interkalatori kao što je MB zahtijevaju kraće vrijeme inkubacije, otprilike \({1}\,{\hbox {h}}\) za elektrohemijsku detekciju ds-DNA6. Svako mjerenje uključuje doziranje uzorka koji se testira na elektroda\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), zatim čišćenje krpom navlaženom IPA, prije nego što nastavite s drugim uzorkom.jedno mjerenje. Svaki uzorak je testiran na 5 različitih elektroda osim ako nije drugačije navedeno. DPV i CV mjerenja su obavljena pomoću PalmSens Sensit Smart potenciostata, a softver PSTrace je korišten za konfiguraciju potenciostata i prikupljanje podataka, uključujući proračune vršne struje. Koriste se sljedeće postavke za DPV i CV mjerenja:
DPV: vrijeme ravnoteže = \(8\,\hbox {s}\), korak napona = \(3\,\hbox {mV}\), pulsni napon = \(25\,\hbox {mV}\) , trajanje pulsa = \(50\,\hbox {ms}\), brzina skeniranja = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: vrijeme ravnoteže = \(8\,\hbox {s}\), korak napona = \(3\,\hbox {mV}\), brzina sweep = \({300}\,\hbox {mV/ s }\)
Vršne struje dobijene iz voltamograma DNK kompleksirane sa \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
DPV i CV voltamogrami su dobijeni na ENIG PCB elektrodama \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB kompleksiranim sa DNK (u koncentracijama od 10–\({20}\,{\ hbox {ng }/{\upmu \hbox {l}}}\) tj. 0,13–\({0,26}\,{\upmu \hbox {M}}\) za \(117\,\hbox {bp}\ ) i 0,03 –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) za \(503\,\hbox {bp}\)).Reprezentativni voltamogrami su prikazani na slici S1 u Dodatnim informacijama. Slika 2 prikazuje rezultate mjerenja DPV i CV (vršna struja) korištenjem PCR proizvoda pročišćenih gelom. U poređenju sa mjerenjima CV, mjerenja DPV pokazuju veću osjetljivost (struja kao funkcija koncentracije DNK) jer pozadinske kapacitivne struje u CV mjerenjima skrivaju Faradeove struje 26 . Podaci za svaku kutiju u boxplot-u sadrži mjerenja sa 5 elektroda. Sva mjerenja koriste isti set elektroda kako bi se izbjegle greške u mjerenju zbog varijacija od elektrode do elektrode. Primijetili smo trend rasta u DPV i CV izmjerenim vršnim strujama za niže koncentracije DNK , duži (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ u poređenju sa \(117) ) fragmentom. adsorpcija kompleksa MB-DNK olakšava prijenos naboja na elektrodi, što doprinosi povećanju vršne struje. Druge studije su pokazale utjecaj veličine i sekvence oligonukleotida na interkalaciju MB-DNK27,28,29,30.Gvanin -sadržaj citozina (GC) u dva amplikona (\(117\,\hbox {bp}\) i \(503\,\hbox {bp}\)) bio je približno 50%, što ukazuje da je zapažanje razlika zbog do dužine amplikona. Međutim, za veće koncentracije DNK (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), za \(503\,\hbox {bp} \) i \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) za \(117\,\hbox {bp}\)), opažamo dva pojačanja vršne struje sub-a su smanjene u oba mjerenja DPV i CV. To je zato što MB zasićuje i interkalira između baznih parova DNK, što rezultira steričnom inhibicijom redoks aktivnosti reducibilne grupe u MB31,32.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV。
Soli prisutne u PCR master mješavinama ometaju elektrostatičke interakcije između MB i DNK, pa dodavanjem \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) sa \({50} \,{\ upmu \hbox {M}}\) MB gel-pročišćeni proizvod za proučavanje uticaja soli na interakciju MB-DNK. Kao što je prikazano na slici 3, primijetili smo da za veće koncentracije DNK (\(>{2}\,{\ hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) i \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) za \(117\,\hbox {bp} \)), u DPV i CV Dodavanje soli nije značajno utjecalo na mjerenja (vidi sliku S2 u Dodatnim informacijama za reprezentativne voltamograme). Međutim, na niže koncentracije DNK, dodavanje soli uvelike smanjuje osjetljivost, što rezultira bez značajne promjene struje s koncentracijom DNK. Slične negativne efekte soli na interakcije i interkalaciju MB-DNK ranije su prijavili drugi istraživači33,34.\(\hbox { Mg}^{2+}\) kationi se vezuju za negativnu fosfatnu kičmu DNK, čime ometaju elektrostatičku interakciju između MB i DNK. Pri višim koncentracijama DNK, sterična inhibicija redoks aktivnih MB-ova rezultira nižim vršnim strujama, pa elektrostatičke interakcije ne utiču značajno na reakciju senzora. Ključna stvar je da je ovaj biosenzor pogodniji za detekciju viših koncentracija DNK (rijetko \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) ili više), za potpuno automatizovanu obradu uzoraka vode iz životne sredine, gde prečišćavanje PCR proizvoda gelom možda nije izvodljivo.
Područje ispod krivulje apsorpcije za opseg talasnih dužina 600–700 \(\hbox {nm}\) za različite koncentracije DNK kompleksirane sa \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) sa i bez soli (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) sa i bez soli (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) Koncentracije DNK koje odgovaraju \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB uzorci Nema DNK.
Da bismo dodatno potvrdili gore navedene rezultate, izvršili smo optička mjerenja pomoću UV/Vis spektrofotometra (Thermo Scientific Multiskan GO), za svaki su korišteni uzorci \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\). Mjerenje. Signatura apsorpcije opada sa povećanjem koncentracije DNK, kao što se može vidjeti iz trenda područja ispod apsorpcione krive za opseg talasnih dužina \(600\,\hbox {nm}\) do \(700\,\hbox { nm}\), kao što je prikazano na slici 4 (apsorpcioni spektar prikazan na slici S3 u Dodatnim informacijama). Za uzorke sa koncentracijom DNK manjom od \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), nije bilo značajne razlike u usvajanju između uzoraka koji sadrže DNK i uzoraka koji sadrže samo MB (za \(503\,\hbox {bp}\) i \(117\,\hbox {bp}\) ) dužine fragmenata), što ukazuje na odsustvo sterične inhibicije redoks aktivnog MB. Pri višim koncentracijama DNK, uočili smo postupno smanjenje signala apsorpcije i primijetili manje smanjenje apsorbancije u prisustvu soli. Ovi rezultati su pripisani molekularnom interakcije i sterična inhibicija sa slaganjem baza u hibridima DNK. Naši rezultati su u skladu sa izvještajima u literaturi o spektroskopskim studijama interkalacije MB-DNK koje povezuju hipokromatičnost sa smanjenim nivoima energije u \(\pi\)–\(\pi ^*\ ) elektronski prijelazi zbog interkalacije Slojevi 36, 37, 38.
Agarozna gel elektroforeza faga Phi6: PCR proizvodi dužine \(117\,\hbox {bp}\) i \(503\,\hbox {bp}\) iz uzoraka vode jezera. M-DNA marker;NTC-no-template kontrola, prajmeri koji sadrže odgovarajuće amplikone;PC pozitivna kontrola;1, 2, 3-nerazrijeđeni (1:1) uzorci vode jezera u tri primjerka. Traka je vidljiva na \(\oko 50\,\hbox {bp}\) zbog neiskorištenih oligonukleotida u \(503\,\ hbox {bp}\) traka.
Procijenili smo korisnost senzora koristeći uzorke vode iz jezera Powai sa dodacima Phi6 faga. Koncentracije RNK izolovane iz uzoraka vode sa fagom kretale su se u rasponu od 15,8–\({19,4}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox { ml}}\), dok je za one izolovane iz pročišćenih suspenzija faga procijenjeno da je RNK \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) sa efikasnošću oporavka od približno 1 %.RNA je reverzno transkribirana u cDNK i korištena kao šablon za PCR i qPCR. Veličina proizvoda je potvrđena elektroforezom agaroznog gela (Slika 5) prije testiranja senzorom. Ovi uzorci nisu pročišćeni gelom i stoga sadrže sve komponente PCR-a kao kao i amplikone od interesa. Pokazalo se da vrijednosti Ct zabilježene tokom qPCR-a (Tabela 1) koreliraju s koncentracijom RNK izolovane iz odgovarajućih uzoraka vode sa šiljcima. Vrijednost Ct otkriva broj ciklusa potrebnih da bi fluorescentni signal premašuju prag ili pozadinski signal. Više Ct vrijednosti ukazuju na niže koncentracije šablona i obrnuto. Ct vrijednosti NTC uzoraka bile su onoliko visoke koliko se očekivalo. Razlika u \(\približno 3\) Ct vrijednosti između pozitivna kontrola i test uzorak dalje pokazuju da svaki test uzorak ima približno 1% šablona u poređenju sa pozitivnom kontrolom. Prethodno smo raspravljali da duži amplikoni dovode do bolje osjetljivosti. Amplifikacija dužih fragmenata izolovanih iz heterogenih uzoraka okoliša je izazovna s obzirom na nedostatke niske koncentracije virusa i razgradnje RNK. Međutim, sa našim protokolom obogaćivanja virusom i PCR amplifikacijskog protokola, uspjeli smo uspješno amplificirati \(503\,\hbox {bp}\) fragment za elektrohemijski sensing.
Slika 6 prikazuje rezultate elektrohemijskog senzora amplikona \(503\,\hbox {bp}\) fragmenta, oba koristeći nerazrijeđenu cDNK kao šablon (1:1) i 100 puta razrijeđenu cDNK kao šablon (1:100) izveden PCR , u poređenju sa NTC i PC (pogledajte Sliku S4 u Dodatnim informacijama za reprezentativne voltamograme). Svaka kutija u dijagramu okvira na slici 6 sadrži mjerenja iz tri uzorka na 5 elektroda. Iste elektrode su korištene za mjerenje svih uzoraka kako bi se izbjegle greške zbog elektroda -varijacija na elektrodu. U poređenju sa CV mjerenjima, DPV mjerenja pokazuju bolju rezoluciju za razlikovanje testnih i PC uzoraka od NTC-a jer su, kao što je prethodno spomenuto, Faradaic struje skrivene zbog pozadinskih kapacitivnih struja u potonjem. Za duže amplikone uočili smo da negativna kontrola (NTC) je rezultirala većim CV i DPV vršnim strujama u odnosu na pozitivnu kontrolu, dok su pozitivni i nerazrijeđeni testni uzorci pokazali slične visine vršnih struja DPV. Izmjerene srednje i srednje vrijednosti za svaki nerazrijeđeni (1:1) ) test uzorak i PC mogu se jasno razlučiti iz izlaza senzora za NTC uzorak, dok je rezolucija za razrijeđeni uzorak 1:100 manje izražena. Za 100-struko razrjeđivanje cDNK, nismo uočili nikakve trake tokom gel elektroforeze (trake koje nisu prikazane na slici 5), a odgovarajuće DPV i CV vršne struje bile su slične onima koje se očekuju za NTC. Rezultati za fragment \(117\,\hbox {bp}\) prikazani su u Dodatnim informacijama. Negativni kontrola je izazvala elektrohemijski odgovor PCB senzora zbog adsorpcije slobodnog MB na elektrodi i interakcije MB sa jednolančanim prajmer oligonukleotidom. Stoga, svaki put kada se uzorak testira, mora se izvršiti negativna kontrola i vršna struja testnog uzorka u poređenju sa vršnom strujom dobijenom negativnom kontrolom kako bi se postiglo diferencijalno (relativno) mjerenje39,40 kako bi se test uzorak klasificirao kao pozitivan ili negativan.
(a) DPV i (b) CV vršna struja za elektrohemijsku detekciju fragmenata \(503\,\hbox {bp}\) u uzorcima vode jezera. Testni uzorci su izmjereni u tri primjerka i upoređeni sa kontrolama bez šablona (NTC) i pozitivne kontrole (PC).
Naši nalazi ilustruju različite mehanizme koji utiču na performanse elektrohemijskih senzora za amplikone različite dužine za različite DNK, sa koncentracijama verifikovanim optičkim merenjima pomoću UV/Vis spektrofotometra. Naša zapažanja naglašavaju uvid da duži DNK fragmenti do \(\približno\) \(500\,\hbox {bp}\) se može detektovati sa većom osjetljivošću i da prisustvo soli u uzorku ne utiče na osjetljivost koncentracije DNK što utiče na veću osjetljivost (rijetko \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) i iznad). Osim toga, istražili smo efekte različitih tipova uzoraka, uključujući amplikone pročišćene gelom sa i bez dodane soli, te dodavanje uzoraka jezerske vode u DPV i CV mjerenjima.Primetili smo da DPV daje bolju rezoluciju, pošto pozadinska kapacitivna struja takođe utiče na CV merenje, čineći ga manje osetljivim.
Amplifikacija dužih fragmenata zavisi od integriteta virusne genomske RNK. Nekoliko studija je pokazalo da amplifikacija dužih fragmenata nije uvijek efikasna zbog degradacije RNK u okolini i potencijala za spajanje tokom izolacije11,41,42,43,44 Primetili smo da je metoda koncentracije virusa zasnovana na PEG bila efikasnija u koncentraciji faga Phi-6 ubačenog u uzorke vode jezera od metode koncentracije virusa na bazi aluminijum hidroksida. Pokazalo se da je sposobnost detekcije dugih fragmenata DNK prevazišla zahtev za multipleks PCR za pojačavanje više šablona kraće dužine i smanjenje mogućnosti unakrsne specifičnosti.
Biološki uzorci su rijetki, tako da postoji potreba da se dizajnira biosenzor koji zahtijeva minimalne uzorke za testiranje. ENIG PCB elektrode korištene u ovoj studiji zahtijevale su samo \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ ) uzorci za testiranje kako bi se pokrila efektivna površina elektroda. Dodatno, ista elektroda se može ponovo koristiti nakon čišćenja prije ispuštanja sljedećeg uzorka. Pojačani uzorci ne zahtijevaju dodavanje bilo koje druge kemikalije osim metilenskog plavog, koje je jeftino i uobičajeno korištena kemikalija. Budući da svaka elektroda košta oko 0,55 USD (ili INR 40) za proizvodnju, ovaj biosenzor može biti isplativa alternativa postojećim tehnologijama detekcije. DNK fragmenti u heterogenim uzorcima.
S obzirom na to da se protokoli za elektrohemijsku detekciju zasnovani na MB oslanjaju na specifičnost PCR-a, glavno ograničenje ove metode je potencijal za nespecifično pojačavanje u heterogenim uzorcima kao što su otpadna voda i voda jezera ili korištenje prajmera niske čistoće. Da bi se poboljšala osjetljivost elektrohemijske metode detekcije za detekciju DNK nepročišćenih PCR proizvoda korišćenjem nemodifikovanih ENIG PCB elektroda, neophodno je bolje razumeti greške koje unose nekorišćeni dNTP i prajmeri, i optimizovati reakcione uslove i protokole analize. Dodatni fizičko-hemijski parametri kao što su pH, temperatura i biološki Potreba za kiseonikom (BOD) uzorka vode će takođe možda morati da se izmeri kako bi se poboljšala tačnost merenja.
U zaključku, predlažemo jeftin elektrohemijski ENIG PCB senzor za detekciju virusa u uzorcima okoline (voda jezera). Za razliku od imobiliziranih oligonukleotidnih elektroda ili prilagođenih supstrata za DNK sensing koji zahtijevaju kriogeno skladištenje da bi se održala osjetljivost,53,54 naša tehnika koristi nemodificirani PCB elektrode sa dužim vijekom trajanja i bez posebnih zahtjeva za skladištenje i stoga pogodne za razvoj rješenja za mjerenje s automatiziranom obradom uzoraka koja se primjenjuje u LMICs. Biosenzor koristi jeftine redoks boje za interkalaciju DNK (MB) za brzo otkrivanje ciljnih amplikona. Nespecifično pojačanje uobičajen u uzorcima životne sredine smanjuje specifičnost ove metode sensinga zbog nespecifičnog vezivanja MB za jednolančane i dvolančane oligonukleotide. Stoga specifičnost ovog testa zavisi od optimizacije prajmera i uslova PCR reakcije. Osim toga, CV i DPV vršne struje dobijene iz testiranih uzoraka treba tumačiti u odnosu na odgovore dobijene od negativne kontrole (NTC) za svaki test. Dizajn i metode elektrohemijskih senzora predstavljeni u ovom radu mogu se integrisati sa automatskim uzorkovačima kako bi se razvili potpuno automatizovani i niski -cijenovno rješenje koje može prikupljati i analizirati uzorke i bežično prenositi rezultate natrag u laboratorij.
Cashdollar, J. & Wymer, L. Metode za početnu koncentraciju virusa iz uzoraka vode: pregled i meta-analiza nedavnih studija.J.Application.microorganism.115, str. 1-11 (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL Virusi koji se prenose vodom: barijere za sigurnu vodu za piće. PLoS Pathogens.11, E1004867 (2015).
Shrestha, S. et al. Epidemiologija otpadnih voda za isplativo opsežno praćenje COVID-19 u zemljama sa niskim i srednjim dohotkom: izazovi i mogućnosti. Voda 13, 2897 (2021).
Palecek, E. & Bartosik, M. Nucleic acid electrochemistry.Chemical.Rev.112, 3427–3481 (2012).
Tani, A., Thomson, AJ & Butt, JN Metilensko plavo kao elektrohemijski diskriminator jednolančanih i dvolančanih oligonukleotida imobilisanih na zlatnim supstratima. Analitičar 126, 1756–1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ Poređenje katjonskih i anionskih interkalatora za elektrohemijsku transdukciju DNK hibridizacije pomoću dugog dometa elektronskog transfera.Electrochemistry.comminicate.6, 648–654 (2004).
Wong, EL & Gooding, JJ Prijenos naboja kroz DNK: selektivni elektrohemijski DNK biosenzor.anus.Chemical.78, 2138–2144 (2006).
Fang, TH et al. PCR mikrofluidni uređaj u realnom vremenu s istovremenom elektrohemijskom detekcijom.biološki senzor.Bioelectronics.24, 2131–2136 (2009).
Win, BY et al. Proučavanje mehanizma signalizacije i verifikacija performansi elektrohemijskog PCR sistema u realnom vremenu zasnovanog na interakciji metilenskog plavog sa DNK. Analitičar 136, 1573–1579 (2011).
Ramirez-Chavarria, RG et al. Petlja-posredovani elektrohemijski senzor zasnovan na izotermnom pojačanju za detekciju sars-cov-2 u uzorcima otpadne vode.J.Environment.Chemical.Britain.10, 107488 (2022).
Kumar, M. et al. Elektrohemijsko sensiranje SARS-CoV-2 amplikona sa PCB elektrodama. Senzor je aktiviran. B Chemistry.343, 130169 (2021).
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. & Yoshida, H. Efikasno otkrivanje SARS-CoV-2 RNK u čvrstoj frakciji otpadnih voda.nauka.opšte okruženje.763, 144587 (2021).
Alygizakis, N. et al. Analitičke metode za otkrivanje SARS-CoV-2 u otpadnim vodama: protokol i buduće perspektive. TraC trending anal.Chemical.134, 116125 (2020).
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. & Kashtan, N. Preživljavanje omotanog bakteriofaga Phi6 (surogat za SARS-CoV-2) u isparenim kapljicama pljuvačke nanesenim na staklene površine.science.Rep.10, 1–10 (2020).
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ Ekološka perzistencija surogata SARS-CoV-2 (Phi6) u slobodnoživućoj amebi.J.Zdravlje voda 20, 83 (2021).
Mindich, L. Precizno pakovanje tri genomska fragmenta dvolančanog RNK bakteriofaga\(\varphi\)6.microorganism.Moore.biology.Rev.63, 149–160 (1999).
Pirttimaa, MJ & Bamford, Sekundarna struktura regiona pakovanja DH RNA faga\(\varphi\)6.RNA 6, 880–889 (2000).
Bonilla, N. et al. Fagi na slavinu – Brz i efikasan protokol za pripremu laboratorijskih zaliha bakteriofaga. PeerJ 4, e2261 (2016).
Vrijeme objave: 27.05.2022