পিসিবি ইলেক্ট্রোড ব্যবহার করে জলের নমুনায় ভাইরাল নিউক্লিক অ্যাসিডের ইলেক্ট্রোকেমিক্যাল সেন্সিংয়ের জন্য দীর্ঘতর অ্যামপ্লিকনগুলি আরও ভাল সংবেদনশীলতা প্রদান করে

Nature.com পরিদর্শন করার জন্য আপনাকে ধন্যবাদ। আপনি যে ব্রাউজার সংস্করণটি ব্যবহার করছেন তাতে CSS এর জন্য সীমিত সমর্থন রয়েছে। সেরা অভিজ্ঞতার জন্য, আমরা আপনাকে একটি আপডেট করা ব্রাউজার ব্যবহার করার পরামর্শ দিই (অথবা Internet Explorer-এ সামঞ্জস্য মোড বন্ধ করুন)। ইতিমধ্যে, নিশ্চিত করতে অব্যাহত সমর্থন, আমরা শৈলী এবং জাভাস্ক্রিপ্ট ছাড়া সাইট প্রদর্শন করবে.
কোভিড-১৯ মহামারীর শুরু থেকেই পরিবেশগত নমুনা পর্যবেক্ষণের গুরুত্ব ব্যাপকভাবে প্রশংসিত হয়েছে, এবং কিছু পর্যবেক্ষণের প্রচেষ্টা সোনার মান ব্যবহার করে করা হচ্ছে, যদিও qPCR-ভিত্তিক কৌশলগুলি ব্যয়বহুল৷ ইলেক্ট্রোকেমিক্যাল ডিএনএ বায়োসেন্সরগুলি একটি সম্ভাব্য সাশ্রয়ী মূল্য দিতে পারে৷ নিম্ন এবং মধ্যম আয়ের দেশগুলিতে পরিবেশগত জলের নমুনাগুলি পর্যবেক্ষণের জন্য সমাধান৷ এই কাজে, আমরা ENIG ব্যবহার করে স্পিকড লেকের জলের নমুনাগুলি (SARS-CoV-2-এর জন্য একটি জনপ্রিয় সারোগেট) থেকে বিচ্ছিন্ন Phi6 ফেজ থেকে প্রাপ্ত অ্যামপ্লিকনগুলির ইলেক্ট্রোকেমিক্যাল সনাক্তকরণ প্রদর্শন করি৷ পৃষ্ঠ পরিবর্তন ছাড়াই PCB ইলেক্ট্রোড সম্পূর্ণ করতে।সেক্স। ইলেক্ট্রোকেমিক্যাল সেন্সর প্রতিক্রিয়াটি বিভিন্ন দৈর্ঘ্যের দুটি ডিএনএ খণ্ডের জন্য পুঙ্খানুপুঙ্খভাবে চিহ্নিত করা হয়েছিল (\({117}\,\hbox {bp}\) এবং \({503}\,\hbox {bp}\)), এবং মিথিলিন ব্লু (এমবি)-ডিএনএ মিথস্ক্রিয়াতে পিসিআর মাস্টার মিক্সে লবণের প্রভাব। আমাদের ফলাফলগুলি দেখায় যে ডিএনএ খণ্ডের দৈর্ঘ্য উল্লেখযোগ্যভাবে ইলেক্ট্রোকেমিক্যাল সংবেদনশীলতা নির্ধারণ করে এবং এই কাজে প্রমাণ করে যে পিসিআর পণ্যগুলির জেল পরিশোধন ছাড়াই দীর্ঘ অ্যামপ্লিকন সনাক্ত করার ক্ষমতা। জলের নমুনা পরিমাপের জন্য গুরুত্বপূর্ণ।ভাইরাল লোডের জন্য একটি সম্পূর্ণ স্বয়ংক্রিয় সমাধান ভালভাবে কাজ করে।
জলবাহিত ভাইরাস সংক্রমণ 1940 সাল থেকে জনস্বাস্থ্যের ঝুঁকি হিসাবে পরিচিত, যেখানে পোলিও এবং হেপাটাইটিস E1 জলবাহিত সংক্রমণের প্রথম প্রমাণ রয়েছে৷ বিশ্ব স্বাস্থ্য সংস্থা (WHO) মাঝারি থেকে উচ্চ স্বাস্থ্যের তাত্পর্যের বেশ কয়েকটি জলবাহিত ভাইরাল প্যাথোজেনকে শ্রেণীবদ্ধ করেছে৷ সনাক্তকরণ পদ্ধতিগুলি স্বর্ণ-মান qPCR-ভিত্তিক কৌশলগুলির উপর নির্ভর করে, যা অত্যন্ত সংবেদনশীল এবং নির্দিষ্ট, তবে ব্যয়বহুল যন্ত্রপাতি ব্যবহার করে পরীক্ষাগারে পরীক্ষা করার জন্য দক্ষ কর্মীদের প্রয়োজন। তবে, সীমিত সম্পদ সহ নিম্ন ও মধ্যম আয়ের দেশগুলিতে (LMICs) মানব পরিবেশগত জলের নমুনা পর্যবেক্ষণের তুলনায় নমুনা পরীক্ষাকে প্রাধান্য দেওয়া হতে পারে৷ অতএব, উদীয়মান রোগের প্রাদুর্ভাবের প্রাথমিক সতর্কতা হিসাবে স্বল্প ও মধ্যম আয়ের দেশগুলিতে জল এবং বর্জ্য জলের নমুনাগুলির টেকসই, বাস্তব-সময় পর্যবেক্ষণের জন্য বিকল্প কম খরচের পদ্ধতিগুলি প্রয়োজন, এইভাবে ভাইরাস মহামারীর গুরুতর আর্থ-সামাজিক প্রভাব থেকে তাদের রক্ষা করে। নিউক্লিক অ্যাসিডের জন্য কম খরচে ইলেক্ট্রোকেমিক্যাল বায়োসেন্সর এই অপূরণীয় প্রয়োজনের প্রতিশ্রুতিপূর্ণ সম্ভাব্য সমাধান দিতে পারে। এই ডিএনএ বায়োসেন্সরগুলির মধ্যে অনেকগুলি এই সত্য দ্বারা কাজ করে যে পরিপূরক ডিএনএ স্ট্র্যান্ডগুলি ইলেক্ট্রোডে স্থির থাকে। নমুনায় একটি মিলিত ক্রম উপস্থিত থাকলে পৃষ্ঠ এবং সংকরকরণ করা হয়। তারপরে এটি বিভিন্ন ইলেক্ট্রোকেমিক্যাল কৌশল দ্বারা পটাসিয়াম আয়রন/ফেরোসায়ানাইডের মতো রেডক্স মধ্যস্থতাকারী ব্যবহার করে একটি সংকেতে রূপান্তরিত হতে পারে। মিথিলিন ব্লু (এমবি) হল এমনই একটি রেডক্স-সক্রিয় অণু, যা ডাবল-স্ট্র্যান্ডেড ডিএনএ (dsDNA) তে আন্তঃসংযোগ করা হয়েছে এবং একক-স্ট্র্যান্ডেড DNA5,6-এর সাথে এর আরও অ-নির্দিষ্ট আবদ্ধতা রয়েছে। এমবি-ডিএনএ কমপ্লেক্স গঠনের জন্য এমবি-এর আন্তঃসংযোগ প্রকৃতি তাদের বেশ কয়েকটি ইলেক্ট্রোকেমিক্যাল ডিএনএ-তে রেডক্স মধ্যস্থতাকারী হিসাবে একটি জনপ্রিয় পছন্দ করে তোলে। সেন্সর কনফিগারেশন5,6,7,8,9.যদিও MB থেকে DNA-এর আন্তঃসংযোগ অ-নির্দিষ্ট, এবং এই ইলেক্ট্রোকেমিক্যাল সেন্সরের নির্দিষ্টতা মূলত পিসিআর বা আইসোথার্মাল অ্যামপ্লিফিকেশনের জন্য ব্যবহৃত প্রাইমারগুলির বিশুদ্ধতার উপর নির্ভর করে, এটি বাস্তব বাস্তবায়নের জন্য উপযুক্ত। ডিএনএ ঘনত্ব পরিমাপের বিকল্প হিসেবে টাইম ইলেক্ট্রোকেমিক্যাল-ভিত্তিক qPCR বা ফ্লুরোসেন্স আইসোথার্মাল অ্যামপ্লিফিকেশন ডিফারেনশিয়াল পালস ভোল্টামেট্রি (DPV) 9 ব্যবহার করে MB সহ PCR amplicons পরিমাপ। অন্য ক্ষেত্রে, Ramirez et al. স্ক্রীন-প্রিন্টেড ইলেক্ট্রোডের সাথে MB ব্যবহার করে RT-LAMP প্রতিক্রিয়ার মাধ্যমে বর্জ্য জলে SARS-CoV-2 সনাক্তকরণ। প্লাটিনাম ইলেক্ট্রোডও হয়েছে। প্রতিক্রিয়ার সময় ইলেক্ট্রোকেমিক্যালি অ্যামপ্লিকন শনাক্ত করার জন্য ডিজাইন করা একটি মাইক্রোফ্লুইডিক পিসিআর প্ল্যাটফর্মে সিটু ইলেক্ট্রোডের মতো ব্যবহার করা হয় 8। এই সমস্ত গবেষণায় ইলেক্ট্রোডগুলির পৃষ্ঠের পরিবর্তনের প্রয়োজন হয়, এই কার্যকরী ইলেক্ট্রোডগুলির স্থায়িত্বের জন্য বিশেষ স্টোরেজ প্রয়োজনীয়তার কারণে বর্ধিত উত্পাদন এবং অপারেটিং খরচ বোঝায়।
হ্রদের জলের নমুনাগুলিতে ঘনীভূত ভাইরাল কণা থেকে প্রাপ্ত অ্যামপ্লিকনগুলির ইলেক্ট্রোকেমিক্যাল সনাক্তকরণের জন্য কর্মপ্রবাহের পরিকল্পিত৷
আমরা সম্প্রতি SARS-CoV-2 অ্যামপ্লিকনগুলির ইলেক্ট্রোকেমিক্যাল সেন্সিং প্রদর্শন করেছি যা DPV-এর উপর ভিত্তি করে কম খরচে প্রিন্টেড সার্কিট বোর্ড (PCB) ইলেক্ট্রোড এবং অপরিবর্তিত ইলেক্ট্রোডের পৃষ্ঠে MB-DNA কমপ্লেক্সগুলির শোষণ দ্বারা প্ররোচিত সাইক্লিক ভোল্টমেট্রি (CV) শীর্ষে পরিবর্তনগুলি বর্তমান11.আমরা রিপোর্ট করি যে লম্বা DNA খণ্ড (N1-N2, \({943}\, \hbox) সিডিসি-প্রস্তাবিত N1 ফরোয়ার্ড এবং N2 রিভার্স প্রাইমার ব্যবহার করে সংক্ষিপ্ত টুকরো {bp}\)) সেন্সর প্রতিক্রিয়াতে আরও ভাল রৈখিকতা দেখায় ( N1, \(72\,\hbox {bp}\)) N1 ফরোয়ার্ড এবং N1 রিভার্স প্রাইমার সেট ব্যবহার করে গঠিত। এই গবেষণাগুলি নিউক্লিয়াস-মুক্ত জলে তৈরি ডিএনএ ডিলিউশন ব্যবহার করে রিপোর্ট করা হয়েছে। প্লাটফর্মটি SARS-CoV সনাক্ত করতেও ব্যবহৃত হয়েছিল সিমুলেটেড বর্জ্য জলের নমুনাগুলিতে -2 অ্যামপ্লিকন (SARS-CoV-2 RNA দিয়ে মোট RNA নমুনাগুলিকে স্পাইক করে প্রাপ্ত)। যেহেতু RNA বিচ্ছিন্নতা এবং ডাউনস্ট্রিম প্রক্রিয়াকরণের সময় শিয়ারিংয়ের জন্য সংবেদনশীল, 12,13 এই ভিন্নধর্মী নমুনা দিয়ে দীর্ঘ খণ্ডগুলিকে প্রসারিত করা কঠিন। অতএব, বর্জ্য জলে SARS-CoV-2 অ্যামপ্লিকনের ইলেক্ট্রোকেমিক্যাল সেন্সিং এর প্রদর্শন ছোট \(72\,\hbox {bp}\) N1 খণ্ডের মধ্যে সীমাবদ্ধ।
এই কাজে, আমরা ENIG PCB-ভিত্তিক ইলেক্ট্রোকেমিক্যাল সেন্সিং-এর সম্ভাব্যতা তদন্ত করেছি যা Phi6 কেন্দ্রীভূত এবং হ্রদের জলের নমুনাগুলি থেকে বিচ্ছিন্ন করা হয়েছে (চিত্র 1)। Phi6 ফেজগুলি আকারে (80-100 nm) SARS-CoV-2 এর সাথে তুলনীয়। এছাড়াও একটি লিপিড মেমব্রেন এবং একটি স্পাইক প্রোটিন রয়েছে৷ এই কারণে, ব্যাকটেরিওফেজ Phi6 হল SARS-CoV-2 এবং অন্যান্য এনভেলপড প্যাথোজেনিক আরএনএ ভাইরাসগুলির জন্য একটি জনপ্রিয় সারোগেট 14,15৷ ফেজ কণা থেকে বিচ্ছিন্ন RNA সিডিএনএ সংশ্লেষণের জন্য একটি টেমপ্লেট হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল PCR দৈর্ঘ্যে 117 এবং 503 বেস জোড়ার দুটি DNA খণ্ড পেতে৷ আমাদের পূর্ববর্তী কাজে \(943\,\hbox {bp}\) N1-N2 খণ্ডগুলিকে পরিবর্ধিত করার চ্যালেঞ্জের পরিপ্রেক্ষিতে, আমরা মধ্যবর্তী দৈর্ঘ্যের খণ্ডগুলিকে লক্ষ্য করি (\(117) \,\hbox {bp}\) এবং \(503 \,\hbox {bp}\)), উপলব্ধ প্রাইমারের উপর ভিত্তি করে। ইলেক্ট্রোকেমিক্যাল সেন্সর প্রতিক্রিয়া পদ্ধতিগতভাবে বিস্তৃত ঘনত্ব পরিসরে অধ্যয়ন করা হয়েছিল (\({10}\,{) \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) থেকে \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) উভয় খণ্ডের জন্য এমবি উপস্থিতি, সেন্সর প্রতিক্রিয়ার উপর লবণের প্রভাব চিহ্নিত করা হয়েছে এবং স্পেকট্রোফটোমেট্রিক পরিমাপ দ্বারা ক্রস-বৈধ করা হয়েছে। এই কাজের প্রধান অবদানগুলি নিম্নরূপ:
ডিএনএ খণ্ডের দৈর্ঘ্য এবং নমুনায় লবণের উপস্থিতি দৃঢ়ভাবে সংবেদনশীলতাকে প্রভাবিত করে।আমাদের ফলাফলগুলি দেখায় যে ইলেক্ট্রোকেমিক্যাল কার্যকলাপ এমবি, ডিএনএ এবং ভোল্টমেট্রিক প্রতিক্রিয়াতে সেন্সরের মিথস্ক্রিয়ার বিভিন্ন প্রক্রিয়ার উপর নির্ভর করে, ডিএনএ ঘনত্ব এবং দৈর্ঘ্যের উপর নির্ভর করে, লম্বা টুকরাগুলি উচ্চতর সংবেদনশীলতা দেখায়, যদিও লবণের মধ্যে ইলেক্ট্রোস্ট্যাটিক মিথস্ক্রিয়াতে নেতিবাচক প্রভাব রয়েছে। এমবি এবং ডিএনএ।
ডিএনএ ঘনত্ব অপরিবর্তিত ইলেক্ট্রোডে এমবি-ডিএনএ মিথস্ক্রিয়ার প্রক্রিয়া নির্ধারণ করে আমরা দেখাই যে এমবি-ডিএনএ মিথস্ক্রিয়া করার বিভিন্ন প্রক্রিয়া ডিএনএ ঘনত্বের উপর নির্ভর করে। ডিএনএ ঘনত্বে অল্প পরিমাণের নিচে {l}}}\), আমরা লক্ষ্য করেছি যে ইলেক্ট্রোকেমিক্যাল বর্তমান প্রতিক্রিয়া প্রধানত ইলেক্ট্রোডে এমবি-ডিএনএ শোষণের দ্বারা নির্ধারিত হয়েছিল, যখন কম ঘনত্বে উচ্চ ডিএনএ ঘনত্বে, ইলেক্ট্রোকেমিক্যাল বর্তমান প্রতিক্রিয়া রেডক্সের স্টেরিক বাধা দ্বারা নির্ধারিত হয়েছিল ডিএনএ বেস জোড়ার মধ্যে এমবি সন্নিবেশের কারণে কার্যকলাপ।
লেকের জলের নমুনায় ভাইরাল নিউক্লিক অ্যাসিডের ENIG PCB-ভিত্তিক ইলেক্ট্রোকেমিক্যাল সেন্সিং পওয়াই লেক, IIT মুম্বাই ক্যাম্পাস থেকে প্রাপ্ত জলের নমুনাগুলি থেকে প্রাপ্ত Phi6-যুক্ত \(503\,\hbox {bp}\) ডিএনএ খণ্ডগুলির বৈদ্যুতিন রাসায়নিক সনাক্তকরণের মাধ্যমে পর্যবেক্ষণগুলি যাচাই করা হয়েছিল। ফলাফল ফেজ.
বাস্তবায়নের কম খরচ এবং সম্পূর্ণ স্বয়ংক্রিয় মনিটরিং সিস্টেম, অলিগোনিউক্লিওটাইডস বা ইলেক্ট্রোডের দীর্ঘ শেল্ফ লাইফের সাথে অ্যাপটামারগুলিতে একীকরণের সম্ভাবনা।
Phage Phi6 হল Cytoviridae পরিবারের একটি ঢেকে রাখা dsRNA ভাইরাস যা সিউডোমোনাস সিরিঞ্জে সংক্রমিত করে। Phi6 ফেজের জিনোম 3টি খণ্ড আকারে বিদ্যমান: S (\(2.95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4.07) \,\hbox {Kb}\)) এবং L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\))16,17. যেহেতু Phi6 ফেজ একটি নন-প্যাথোজেনিক BSL-1 সিউডোমোনাস স্ট্রেনকে সংক্রামিত করে, তাই এটি ব্যবহার করা নিরাপদ এবং সহজেই পরীক্ষাগারে জন্মানো যায়। Phage Phi6 এবং এর হোস্ট Pseudomonas syringae ফেলিক্স ডি'হেরেল রেফারেন্স সেন্টার ফর ব্যাকটেরিয়াল ভাইরাস, লাভাল ইউনিভার্সিটি, কানাডা থেকে কেনা হয়েছিল (রেফারেন্স সেন্টারের ক্যাটালগ নম্বর যথাক্রমে HER-102 এবং HER-1102) রেফারেন্স সেন্টারের নির্দেশ অনুসারে Phi6 ফেজ এবং এর হোস্টকে পুনরুজ্জীবিত করা হয়েছিল। Phi6 Phi6 কে প্লেট লাইসিস এবং ইলুশন দ্বারা শুদ্ধ করা হয়েছিল \(\ প্রায় 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { দিয়ে চূড়ান্ত টাইটারগুলি পেতে) ml}}\) (প্ল্যাক গঠনকারী ইউনিট/মিলিলিটার)। প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসারে GenElute™ ইউনিভার্সাল টোটাল RNA পিউরিফিকেশন কিট (সিগমা-অলড্রিচ) ব্যবহার করে RNA বিশুদ্ধ ফেজ কণা থেকে বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, একটি বিশুদ্ধ ফেজ Phi6 সাসপেনশন\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) lysed করা হয়েছিল এবং RNA কে রজন কলামের সাথে আবদ্ধ করার অনুমতি দেওয়ার জন্য lysate একটি স্পিন কলামের উপর লোড করা হয়েছিল। RNA তারপর ইলুশন দ্রবণে নির্গত হয় \({ 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) কিট দ্বারা প্রদত্ত। \(260\,\hbox {nm}\) তে শোষণের মাধ্যমে RNA এর ঘনত্ব অনুমান করুন। RNA অ্যালিকোটগুলিতে সংরক্ষিত ছিল। ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) পরবর্তী ব্যবহার না হওয়া পর্যন্ত।\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) iScript cDNA সংশ্লেষণ কিট (বায়ো) -র্যাড ল্যাবরেটরিজ) প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসরণ করে সিডিএনএ সংশ্লেষণের জন্য একটি টেমপ্লেট হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল। সংক্ষেপে, একটি সিডিএনএ সংশ্লেষণ প্রতিক্রিয়া 3টি ধাপ নিয়ে গঠিত: প্রাইমিং এ \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min} }\) , \({20}\,{\hbox {min}}\) এর বিপরীত প্রতিলিপি \({46}\,{^{\circ) }\hbox {C}}\), এবং বিপরীত রেকর্ডারটি \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) \({1}\,{\hbox {মিনিট) এর মধ্যে রয়েছে }}\) 1% অ্যাগারোজ জেলে চালিত হলে, সিডিএনএ প্রত্যাশিত তিনটি আরএনএ খণ্ডের সাথে সম্পর্কিত তিনটি ব্যান্ড দেখায় (ডেটা দেখানো হয়নি)। নিম্নলিখিত প্রাইমারগুলি 117 এবং 503 bp দৈর্ঘ্যের দুটি DNA খণ্ডকে প্রশস্ত করতে ব্যবহৃত হয়েছিল, একটি miniPCR® mini8 থার্মাল সাইক্লারে PCR-এর জন্য টেমপ্লেট হিসাবে cDNA ব্যবহার করা:
\(117\,\hbox {bp}\) এবং \(503\,\hbox {bp}\) এর প্রাইমারগুলি যথাক্রমে এম সেগমেন্টের 1476-1575 নিউক্লিওটাইড এবং L সেগমেন্টের 458-943 নিউক্লিওটাইডের সাথে মিলে যায়, যথাক্রমে অ্যাসিড .সমস্ত পরিবর্ধিত পিসিআর পণ্য 1% অ্যাগারোজ জেলে ইলেক্ট্রোফোরস করা হয়েছিল, এবং জিনজেট জেল এক্সট্রাকশন কিট (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) ব্যবহার করে পরিবর্ধিত লক্ষ্য ডিএনএ বিশুদ্ধ করা হয়েছিল।
আইআইটি মুম্বাই ক্যাম্পাসের একটি হ্রদ (পাওয়াই লেক, পওয়াই, মুম্বাই) ফেজ কণা যোগ করার জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল। হ্রদের জল একটি \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) ঝিল্লির মাধ্যমে ফিল্টার করা হয়েছিল। স্থগিত কণা, এবং তারপর Phi6 ফেজ যোগ করা হয়েছে। \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} এর মধ্যে \({1}\,{\hbox {ml}}\) যোগ করুন \) থেকে \({100}\ ,{\hbox {ml}}\) ফিল্টার করা লেকের জল, \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\) এ।একটি ছোট অ্যালিকোট ছিল প্লেক অ্যাস দ্বারা ভাইরাল লোড পরিমাপের জন্য সংরক্ষিত। আমরা স্পাইকড Phi6 ভাইরাস কণাকে ঘনীভূত করার জন্য দুটি ভিন্ন পদ্ধতি পরীক্ষা করেছি: (1) অ্যালুমিনিয়াম হাইড্রক্সাইড শোষণ-বর্ষণ পদ্ধতি, 19 যা পরিবেশগত নমুনা থেকে বেশ কয়েকটি এনভেলপড RNA ভাইরাসের ঘনত্বের জন্য যাচাই করা হয়েছে, এবং (2) ) পলিথিন গ্লাইকল (পিইজি)-ভিত্তিক ভাইরাস ঘনত্বের পদ্ধতিটি ফ্লাড এট আল থেকে অভিযোজিত হয়েছিল।20 .যেহেতু পিইজি-ভিত্তিক পদ্ধতির পুনরুদ্ধার দক্ষতা অ্যালুমিনিয়াম হাইড্রক্সাইড পদ্ধতির চেয়ে ভাল বলে প্রমাণিত হয়েছে, তাই পিইজি-ভিত্তিক পদ্ধতিটি হ্রদের জলের নমুনা থেকে Phi6 কণাকে ঘনীভূত করতে ব্যবহার করা হয়েছিল।
ব্যবহৃত PEG পদ্ধতিটি নিম্নরূপ: PEG 8000 এবং \(\hbox {NaCl}\) Phi6-স্পাইকড লেকের জলের নমুনায় যোগ করা হয়েছিল 8% PEG 8000 এবং \(0.2\,\hbox {M} \) \( \ hbox {NaCl}\)। নমুনাগুলি একটি শেকারে ইনকিউব করা হয়েছিল\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), তারপর \(4700 \,\hbox {g}\) এ সেন্ট্রিফিউজ করা হয় \({45}\,{\hbox {min}}\)। সুপারন্যাট্যান্ট বাদ দিন এবং \({1}\, তে পেলেট পুনরায় সাসপেন্ড করুন) {\hbox {ml}}\) একই সুপারনাট্যান্টে৷ সমস্ত স্পাইকিং এবং ভাইরাস ঘনত্বের পরীক্ষাগুলি ত্রিপিকে সঞ্চালিত হয়েছিল৷ ঘনত্বের পরে, প্লেক অ্যাস দ্বারা পুনরুদ্ধারের দক্ষতা পরিমাপের জন্য একটি ছোট অ্যালিকোট সংরক্ষিত ছিল৷ আরএনএকে পূর্বে বর্ণিত হিসাবে বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল এবং ইলুট করা হয়েছিল৷ কিট-সরবরাহকৃত ইলিউশন বাফারে\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\)।যেহেতু RNA ঘনত্ব নমুনা থেকে নমুনাতে ত্রি-প্রতিলিপিতে পরিবর্তিত হবে, \({2}\,{\upmu \ RNA এর hbox {l}}\) নমুনার cDNA সংশ্লেষণের ঘনত্ব নির্বিশেষে তিনটির জন্যই ব্যবহৃত হয়। cDNA সংশ্লেষণ পূর্বে বর্ণিত হিসাবে সঞ্চালিত হয়েছিল।\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNA \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) \(117\,\hbox {bp}\) এবং \(503\,\hbox { প্রশস্ত করার জন্য 35টি চক্রের জন্য PCR-এর টেমপ্লেট হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল bp}\) টুকরা। এই নমুনাগুলিকে "1:1″ হিসাবে উপস্থাপিত করা হয়েছে, অর্থাৎ পাতলা করা ছাড়াই। একটি নো-টেমপ্লেট নিয়ন্ত্রণ (NTC) একটি নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ হিসাবে সেট আপ করা হয়েছিল, যখন বিশুদ্ধ ফেজ থেকে বিচ্ছিন্ন RNA ব্যবহার করে সংশ্লেষিত একটি সিডিএনএ সেট আপ করা হয়েছিল। একটি পজিটিভ কন্ট্রোল (PC) এর জন্য একটি টেমপ্লেট হিসাবে। কোয়ান্টিটেটিভ পিসিআর (qPCR) ব্রিলিয়ান্ট III আল্ট্রা-ফাস্ট এসওয়াইবিআর গ্রীন কিউপিসিআর মাস্টার মিক্স (এজিলেন্ট টেকনোলজিস) ব্যবহার করে একটি স্ট্র্যাটেজিন Mx3000P RT-PCR যন্ত্রে সঞ্চালিত হয়েছিল। প্রতিক্রিয়াগুলি পূর্বের মতো ট্রিপলিকেটে সেট আপ করা হয়েছিল। বর্ণনা করা হয়েছে। সমস্ত নমুনার জন্য সাইকেল থ্রেশহোল্ড (Ct) রেকর্ড করা হয়েছে। উপরন্তু, মিশ্রিত নমুনাগুলি ছিল \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) সিডিএনএ ব্যবহার করে 1:100 ফিল্টার করা লেকের জলে \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) 35টি চক্রের জন্য PCR৷ এই নমুনাগুলিকে "1:100″ হিসাবে উপস্থাপন করা হয়েছে৷
PCB ইলেক্ট্রোডগুলি একটি বাণিজ্যিকভাবে উপলব্ধ স্বল্প-মূল্যের ইলেক্ট্রোলেস নিকেল ইমারসন গোল্ড (ENIG) প্রক্রিয়া ব্যবহার করে বাড়তি সোনার প্রলেপের প্রয়োজন ছাড়াই তৈরি করা হয়৷ ENIG PCB ইলেক্ট্রোড স্পেসিফিকেশনগুলি আমাদের পূর্ববর্তী কাজে বিশদ বিবরণ দেওয়া হয়েছে11৷ ENIG PCB ইলেক্ট্রোডের জন্য, ঐতিহ্যগত ইলেক্ট্রোড পরিষ্কারের পদ্ধতি যেমন পিরানহা দ্রবণ বা সালফিউরিক অ্যাসিড সাইক্লিক ভোল্টমেট্রি সুপারিশ করা হয় না কারণ এগুলো পাতলা সোনার স্তর (বেধ \(\প্রায়\) \(100\,\hbox {nm }\)) এর খোসা ছাড়তে পারে এবং অন্তর্নিহিত তামার স্তরগুলিকে উন্মুক্ত করতে পারে যা প্রবণ। ক্ষয় থেকে 21, 22, 23, 24, 25। অতএব, আইপিএ দিয়ে ভেজা একটি লিন্ট-মুক্ত কাপড় দিয়ে ইলেক্ট্রোডগুলি পরিষ্কার করুন। পরীক্ষা করা নমুনাটি \({50}\,{\upmu \hbox {M}} দিয়ে ইনকিউব করা হয়েছিল। }\) এমবি ইন \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) সহজে সন্নিবেশ করার জন্য। আমাদের আগের কাজটিতে , আমরা লক্ষ্য করেছি যে MB ঘনত্ব 11 বাড়িয়ে সেন্সরের সংবেদনশীলতা এবং রৈখিকতা উন্নত হয়েছে। আমাদের পূর্বের কাজগুলিতে রিপোর্ট করা অপ্টিমাইজেশনের উপর ভিত্তি করে, আমরা \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB ব্যবহার করেছি এই গবেষণায় DNA এম্বেড করার জন্য ঘনত্ব। ডাবল-স্ট্র্যান্ডেড ডিএনএ (ds-DNA) এর ইলেক্ট্রোকেমিক্যাল সনাক্তকরণ অ্যানিওনিক বা ক্যাটেশনিক ইন্টারক্যালেটর ব্যবহার করে অর্জন করা যেতে পারে। যদিও অ্যানিওনিক ইন্টারক্যালেটররা ডিএনএ শনাক্ত করে ভালো সিলেক্টিভিটি দিয়ে, তাদের রাতারাতি ইনকিউবেশন প্রয়োজন, যার ফলে সনাক্তকরণের সময় বেশি হয়। অন্যদিকে, ds-DNA6 এর ইলেক্ট্রোকেমিক্যাল সনাক্তকরণের জন্য MB-এর মতো ক্যাটেশনিক ইন্টারক্যালেটরগুলির জন্য কম ইনকিউবেশন সময়ের প্রয়োজন হয়, প্রায় \({1}\,{\hbox {h}}\)। প্রতিটি পরিমাপের মধ্যে পরীক্ষা করার জন্য নমুনা বিতরণ করা জড়িত। ইলেক্ট্রোড\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), তারপর অন্য একটি নমুনা নিয়ে এগিয়ে যাওয়ার আগে একটি আইপিএ-সিক্ত রাগ দিয়ে পরিষ্কার করুন।একটি পরিমাপ। প্রতিটি নমুনা 5টি ভিন্ন ইলেক্ট্রোডের উপর পরীক্ষা করা হয়েছিল যদি না অন্যথায় বলা হয়। DPV এবং CV পরিমাপ একটি PalmSens Sensit Smart potentiostat ব্যবহার করে সঞ্চালিত হয়েছিল, এবং PSTrace সফ্টওয়্যারটি potentiostat কনফিগারেশন এবং ডেটা অধিগ্রহণের জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল, যার মধ্যে শীর্ষ বর্তমান গণনা রয়েছে। নিম্নলিখিত সেটিংস ব্যবহার করা হয়েছে DPV এবং CV পরিমাপের জন্য:
DPV: ভারসাম্যের সময় = \(8\,\hbox {s}\), ভোল্টেজ ধাপ = \(3\,\hbox {mV}\), পালস ভোল্টেজ = \(25\,\hbox {mV}\) , পালস সময়কাল = \(50\,\hbox {ms}\), স্ক্যান রেট = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
সিভি: ইকুইলিব্রিয়াম টাইম = \(8\,\hbox {s}\), ভোল্টেজ ধাপ = \(3\,\hbox {mV}\), সুইপ রেট = \({300}\,\hbox {mV/s }\)
ডিএনএ এর ভোল্টামমোগ্রাম থেকে প্রাপ্ত সর্বোচ্চ স্রোত \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV।
DPV এবং CV ভোল্টামমোগ্রামগুলি ENIG PCB ইলেক্ট্রোড \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB ডিএনএর সাথে জটিল (10–\({20}\,{\ hbox {ng ঘনত্বে) প্রাপ্ত হয়েছিল }/{\upmu \hbox {l}}}\) অর্থাৎ 0.13–\({0.26}\,{\upmu \hbox {M}}\) \(117\,\hbox {bp}\ ) এবং 0.03 এর জন্য –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) \(503\,\hbox {bp}\) এর জন্য। প্রতিনিধি ভোল্টামমোগ্রামগুলি পরিপূরক তথ্যের চিত্র S1 এ দেখানো হয়েছে। চিত্র 2 ফলাফল দেখায়। জেল-বিশুদ্ধ পিসিআর পণ্য ব্যবহার করে ডিপিভি এবং সিভি পরিমাপ (পিক কারেন্ট)। সিভি পরিমাপের তুলনায়, ডিপিভি পরিমাপ উচ্চতর সংবেদনশীলতা দেখায় (ডিএনএ ঘনত্বের ফাংশন হিসাবে বর্তমান) কারণ সিভি পরিমাপের পটভূমি ক্যাপাসিটিভ স্রোত ফ্যারাডাইক স্রোতগুলিকে লুকিয়ে রাখে 26। ডেটা বক্সপ্লটের প্রতিটি বাক্সের জন্য 5টি ইলেক্ট্রোড থেকে পরিমাপ রয়েছে৷ সমস্ত পরিমাপ ইলেক্ট্রোড থেকে ইলেক্ট্রোড বৈচিত্রের কারণে পরিমাপের ত্রুটিগুলি এড়াতে একই ইলেক্ট্রোড ব্যবহার করে৷ আমরা ডিএনএ-র নিম্ন ঘনত্বের জন্য DPV এবং CV পরিমাপিত শীর্ষ স্রোতে একটি ক্রমবর্ধমান প্রবণতা লক্ষ্য করেছি৷ , দীর্ঘ (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\\(117) ) খণ্ডের তুলনায়। এটি আমাদের পূর্ববর্তী কাজে রিপোর্ট করা ইলেক্ট্রোড শোষণের প্রত্যাশিত প্রবণতার সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ। এমবি-ডিএনএ কমপ্লেক্সের শোষণ ইলেক্ট্রোডে চার্জ স্থানান্তরকে সহজ করে, যা সর্বোচ্চ কারেন্ট বৃদ্ধিতে অবদান রাখে। অন্যান্য গবেষণায় এমবি-ডিএনএ ইন্টারক্যালেশন 27,28,29,30-এর উপর অলিগোনিউক্লিওটাইড আকার এবং অনুক্রমের প্রভাব দেখানো হয়েছে। দুটি অ্যামপ্লিকন (\(117\,\hbox {bp}\) এবং \(503\,\hbox {bp}\)) এর সাইটোসিন (GC) বিষয়বস্তু ছিল প্রায় 50%, যা নির্দেশ করে যে পর্যবেক্ষণের কারণে পার্থক্য অ্যামপ্লিকন দৈর্ঘ্য পর্যন্ত। তবে, উচ্চতর DNA ঘনত্বের জন্য (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), \(503\,\hbox {bp}) \) এবং \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) \(117\,\hbox {bp}\) এর জন্য), আমরা দুটি পরিবর্ধন লক্ষ্য করি DPV এবং CV উভয় পরিমাপেই সাব-এর সর্বোচ্চ স্রোত হ্রাস পায়। এর কারণ হল MB স্যাচুরেট করে এবং DNA-এর বেস জোড়ার মধ্যে ইন্টারক্যালেট করে, যার ফলে MB31,32-এ হ্রাসযোগ্য গ্রুপের রেডক্স কার্যকলাপের স্টেরিক বাধা সৃষ্টি হয়।
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV।
পিসিআর মাস্টার মিক্সে উপস্থিত সল্ট এমবি এবং ডিএনএর মধ্যে ইলেক্ট্রোস্ট্যাটিক মিথস্ক্রিয়ায় হস্তক্ষেপ করে, তাই \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) এর সাথে \({50} \,{\) যোগ করে upmu \hbox {M}}\) MB জেল-বিশুদ্ধ পণ্য MB-DNA মিথস্ক্রিয়ায় লবণের প্রভাব অধ্যয়ন করতে। চিত্র 3-এ দেখানো হয়েছে, আমরা লক্ষ্য করেছি যে উচ্চতর DNA ঘনত্বের জন্য (\(>{2}\,{\) hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) এবং \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) \(117\,\hbox {bp} \)), DPV এবং CV-তে লবণের সংযোজন পরিমাপকে উল্লেখযোগ্যভাবে প্রভাবিত করেনি (প্রতিনিধি ভোল্টামমোগ্রামের জন্য পরিপূরক তথ্যে চিত্র S2 দেখুন)। তবে, এখানে নিম্ন ডিএনএ ঘনত্ব, লবণ সংযোজন সংবেদনশীলতাকে ব্যাপকভাবে হ্রাস করে, যার ফলে ডিএনএ ঘনত্বের সাথে বর্তমানের কোন উল্লেখযোগ্য পরিবর্তন হয় না। এমবি-ডিএনএ মিথস্ক্রিয়া এবং ইন্টারক্যালেশনের উপর লবণের অনুরূপ নেতিবাচক প্রভাব পূর্বে অন্যান্য গবেষকরা রিপোর্ট করেছেন 33,34।\(\hbox { Mg}^{2+}\) ক্যাটেশনগুলি DNA-এর নেতিবাচক ফসফেট ব্যাকবোনে আবদ্ধ হয়, যার ফলে MB এবং DNA-এর মধ্যে ইলেক্ট্রোস্ট্যাটিক মিথস্ক্রিয়া বাধাগ্রস্ত হয়৷ উচ্চতর DNA ঘনত্বে, রেডক্স-সক্রিয় এমবি-এর স্টেরিক বাধার ফলে নিম্ন শিখর স্রোত হয়, তাই ইলেক্ট্রোস্ট্যাটিক মিথস্ক্রিয়া সেন্সর প্রতিক্রিয়া উল্লেখযোগ্যভাবে প্রভাবিত করে না। মূল বিষয় হল এই বায়োসেন্সরটি উচ্চতর ডিএনএ ঘনত্ব সনাক্ত করার জন্য আরও উপযুক্ত (কদাচিৎ \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) বা উচ্চতর), সম্পূর্ণরূপে- পরিবেশগত জলের নমুনাগুলির স্বয়ংক্রিয় প্রক্রিয়াকরণের জন্য, যেখানে পিসিআর পণ্যগুলির জেল পরিশোধন সম্ভব নাও হতে পারে।
\({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB দিয়ে জটিল ডিএনএর বিভিন্ন ঘনত্বের জন্য তরঙ্গদৈর্ঘ্য 600–700 \(\hbox {nm}\) পরিসরের জন্য শোষণ বক্ররেখার অধীনে ক্ষেত্র: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) লবণ সহ এবং ছাড়া (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) লবণ সহ এবং ছাড়া (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\))।\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) এমবি নমুনার সাথে সম্পর্কিত ডিএনএ ঘনত্ব কোনও ডিএনএ নেই।
উপরের ফলাফলগুলি আরও যাচাই করার জন্য, আমরা একটি UV/Vis স্পেকট্রোফটোমিটার (থার্মো সায়েন্টিফিক মাল্টিস্কান জিও) ব্যবহার করে অপটিক্যাল পরিমাপ করেছি, প্রতিটির জন্য নমুনাগুলি \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) ব্যবহার করা হয়েছিল পরিমাপ। DNA ঘনত্ব বৃদ্ধির সাথে শোষণের স্বাক্ষর হ্রাস পায়, যেমনটি তরঙ্গদৈর্ঘ্য পরিসীমা \(600\,\hbox {nm}\) থেকে \(700\,\hbox {) এর জন্য শোষণ বক্ররেখার অধীনে এলাকার প্রবণতা থেকে দেখা যায়। nm}\) , যেমন চিত্র 4 এ দেখানো হয়েছে (পরিপূরক তথ্যে চিত্র S3 এ শোষণের বর্ণালী দেখানো হয়েছে)। \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox) এর চেয়ে কম DNA ঘনত্বের নমুনার জন্য {l}}}\), ডিএনএ-ধারণকারী এবং এমবি-শুধু নমুনার মধ্যে (\(503\,\hbox {bp}\) এবং \(117\,\hbox {bp}\ এর জন্য) গ্রহণের ক্ষেত্রে কোনও উল্লেখযোগ্য পার্থক্য ছিল না ) দৈর্ঘ্যের টুকরো), রেডক্স-অ্যাক্টিভ এমবি-এর স্টেরিক বাধার অনুপস্থিতি নির্দেশ করে। উচ্চতর ডিএনএ ঘনত্বে, আমরা শোষণ সংকেত ধীরে ধীরে হ্রাস লক্ষ্য করেছি এবং লবণের উপস্থিতিতে শোষণের কম হ্রাস লক্ষ্য করেছি। এই ফলাফলগুলি আণবিকের জন্য দায়ী করা হয়েছিল। ডিএনএ হাইব্রিডগুলিতে বেস স্ট্যাকিংয়ের সাথে মিথস্ক্রিয়া এবং স্টেরিক ইনহিবিশন। আমাদের ফলাফলগুলি MB-DNA ইন্টারক্যালেশনের স্পেকট্রোস্কোপিক অধ্যয়নের সাহিত্যের রিপোর্টের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ যা \(\pi\)–\(\pi ^*\) এ শক্তির মাত্রা হ্রাসের সাথে হাইপোক্রোমাটিসিটিকে যুক্ত করে। ) ইন্টারক্যালেশন লেয়ার 36, 37, 38 এর কারণে ইলেকট্রনিক ট্রানজিশন।
ফেজ Phi6 এর অ্যাগারোজ জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস: লেকের পানির নমুনা থেকে দৈর্ঘ্যের PCR পণ্য \(117\,\hbox {bp}\) এবং \(503\,\hbox {bp}\)। M-DNA মার্কার;এনটিসি-নো-টেমপ্লেট কন্ট্রোল, প্রাইমারে সংশ্লিষ্ট অ্যামপ্লিকন রয়েছে;পিসি ইতিবাচক নিয়ন্ত্রণ;1, 2, 3-অনডিলুটেড (1:1) স্পাইকড লেকের পানির নমুনা ট্রিপ্লিকেট। একটি ব্যান্ড \(\প্রায় 50\,\hbox {bp}\) এ অব্যবহৃত অলিগোনিউক্লিওটাইডের কারণে দৃশ্যমান হয়। hbox {bp}\) লেন।
আমরা Phi6 ফেজ দিয়ে স্পাইক করা পওয়াই লেকের জলের নমুনাগুলি ব্যবহার করে সেন্সরের উপযোগিতা মূল্যায়ন করেছি৷ ফেজ-স্পাইকযুক্ত জলের নমুনাগুলি থেকে বিচ্ছিন্ন RNA ঘনত্ব 15.8–\({19.4}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox { ml}}\), যখন বিশুদ্ধ ফেজ সাসপেনশন থেকে বিচ্ছিন্ন RNA অনুমান করা হয়েছিল \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) যার পুনরুদ্ধারের দক্ষতা প্রায় 1 ছিল %.RNA বিপরীতভাবে cDNA-তে ট্রান্সক্রাইব করা হয়েছিল এবং PCR এবং qPCR-এর টেমপ্লেট হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল৷ সেন্সরের সাথে পরীক্ষার আগে অ্যাগারোজ জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস (চিত্র 5) দ্বারা পণ্যের আকার নিশ্চিত করা হয়েছিল৷ এই নমুনাগুলি জেল বিশুদ্ধ নয় এবং তাই পিসিআর-এর সমস্ত উপাদান ধারণ করে৷ পাশাপাশি আগ্রহের amplicons। qPCR (সারণী 1) এর সময় রেকর্ড করা Ct মানগুলি সংশ্লিষ্ট স্পাইকযুক্ত জলের নমুনাগুলি থেকে বিচ্ছিন্ন RNA এর ঘনত্বের সাথে সম্পর্কযুক্ত দেখানো হয়েছে। Ct মান ফ্লুরোসেন্ট সংকেতের জন্য প্রয়োজনীয় চক্রের সংখ্যা প্রকাশ করে থ্রেশহোল্ড বা ব্যাকগ্রাউন্ড সিগন্যাল অতিক্রম করুন৷ উচ্চ Ct মান নিম্ন টেমপ্লেট ঘনত্ব নির্দেশ করে এবং এর বিপরীতে৷ NTC নমুনার Ct মানগুলি প্রত্যাশিত হিসাবে উচ্চ ছিল৷ \(\ আনুমানিক 3\) Ct মানগুলির মধ্যে পার্থক্য ইতিবাচক নিয়ন্ত্রণ এবং পরীক্ষার নমুনা আরও ইঙ্গিত করে যে প্রতিটি পরীক্ষার নমুনায় ইতিবাচক নিয়ন্ত্রণের তুলনায় প্রায় 1% টেমপ্লেট রয়েছে৷ আমরা পূর্বে আলোচনা করেছি যে দীর্ঘ অ্যামপ্লিকনগুলি আরও ভাল সংবেদনশীলতার দিকে পরিচালিত করে৷ ভিন্নতাপূর্ণ পরিবেশগত নমুনাগুলি থেকে বিচ্ছিন্ন দীর্ঘ খণ্ডগুলির প্রসারণ অসুবিধাগুলির কারণে চ্যালেঞ্জিং৷ কম ভাইরাল ঘনত্ব এবং আরএনএ অবক্ষয়। যাইহোক, আমাদের ভাইরাস সমৃদ্ধকরণ এবং পিসিআর পরিবর্ধন প্রোটোকলের সাহায্যে আমরা ইলেক্ট্রোকেমিক্যাল সেন্সিংয়ের জন্য \(503\,\hbox {bp}\) খণ্ডটিকে সফলভাবে প্রসারিত করতে সক্ষম হয়েছি।
চিত্র 6 এ \(503\,\hbox {bp}\) ফ্র্যাগমেন্ট অ্যামপ্লিকনের ইলেক্ট্রোকেমিক্যাল সেন্সর ফলাফল দেখায়, উভয়ই টেমপ্লেট হিসাবে undiluted cDNA ব্যবহার করে (1:1) এবং 100-fold diluted cDNA টেমপ্লেট (1:100) PCR সঞ্চালিত , NTC এবং PC এর তুলনায় (প্রতিনিধি ভোল্টামমোগ্রামের পরিপূরক তথ্যে চিত্র S4 দেখুন)। চিত্র 6-এর বক্সপ্লটের প্রতিটি বাক্সে 5টি ইলেক্ট্রোডে তিনটি নমুনা থেকে পরিমাপ রয়েছে। ইলেক্ট্রোডের কারণে ত্রুটি এড়াতে একই ইলেক্ট্রোডগুলি সমস্ত নমুনা পরিমাপ করতে ব্যবহৃত হয়েছিল। -থেকে-ইলেক্ট্রোড বৈচিত্র।সিভি পরিমাপের তুলনায়, DPV পরিমাপগুলি পরীক্ষা এবং পিসি নমুনাগুলিকে NTC থেকে আলাদা করার জন্য আরও ভাল রেজোলিউশন দেখায় কারণ, পূর্বে উল্লিখিত হিসাবে, ফ্যারাডাইক স্রোতগুলি পরবর্তীতে ব্যাকগ্রাউন্ড ক্যাপাসিটিভ স্রোতের কারণে লুকিয়ে থাকে। দীর্ঘ এমপ্লিকনগুলির জন্য, আমরা লক্ষ্য করেছি যে নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ (এনটিসি) এর ফলে ইতিবাচক নিয়ন্ত্রণের তুলনায় উচ্চতর সিভি এবং ডিপিভি পিক স্রোত দেখা যায়, যেখানে ইতিবাচক এবং অবিচ্ছিন্ন পরীক্ষার নমুনাগুলি ডিপিভি পিক স্রোতের অনুরূপ সর্বোচ্চ উচ্চতা দেখায়। প্রতিটি অমিশ্রিত (1:1) জন্য পরিমাপ করা গড় এবং মধ্যম মান ) পরীক্ষার নমুনা এবং পিসি NTC নমুনার জন্য সেন্সর আউটপুট থেকে স্পষ্টভাবে সমাধান করা যেতে পারে, যখন 1:100 পাতলা নমুনার রেজোলিউশন কম উচ্চারিত হয়। cDNA এর 100-গুণ তরল করার জন্য, আমরা জেল ইলেক্ট্রোফোরসিসের সময় কোনো ব্যান্ড পর্যবেক্ষণ করিনি। (চিত্র 5 এ দেখানো হয়নি) এবং সংশ্লিষ্ট DPV এবং CV পিক স্রোত NTC-এর জন্য প্রত্যাশিত অনুরূপ ছিল। \(117\,\hbox {bp}\) খণ্ডের ফলাফল পরিপূরক তথ্যে দেখানো হয়েছে। নেতিবাচক ইলেক্ট্রোডে ফ্রি এমবি শোষণ এবং সিঙ্গেল-স্ট্র্যান্ডেড প্রাইমার অলিগোনিউক্লিওটাইডের সাথে এমবি-এর মিথস্ক্রিয়ার কারণে নিয়ন্ত্রণ PCB সেন্সর থেকে একটি ইলেক্ট্রোকেমিক্যাল প্রতিক্রিয়া প্ররোচিত করে। অতএব, প্রতিবার নমুনা পরীক্ষা করার সময়, একটি নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ চালাতে হবে এবং পরীক্ষার নমুনাকে ইতিবাচক বা নেতিবাচক হিসাবে শ্রেণীবদ্ধ করার জন্য একটি ডিফারেনশিয়াল (আপেক্ষিক) পরিমাপ39,40 অর্জনের জন্য নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ দ্বারা প্রাপ্ত সর্বোচ্চ কারেন্টের তুলনায় পরীক্ষার নমুনার সর্বোচ্চ বর্তমান।
(a) DPV, এবং (b) হ্রদের জলের নমুনাগুলিতে \(503\,\hbox {bp}\) খণ্ডগুলির ইলেক্ট্রোকেমিক্যাল সনাক্তকরণের জন্য সিভি পিক কারেন্ট৷ পরীক্ষার নমুনাগুলি ত্রিপিকে পরিমাপ করা হয়েছিল এবং কোনও টেমপ্লেট নিয়ন্ত্রণ নেই (এনটিসি) এবং এর সাথে তুলনা করা হয়েছিল ইতিবাচক নিয়ন্ত্রণ (পিসি)।
আমাদের অনুসন্ধানগুলি বিভিন্ন ডিএনএ-এর জন্য বিভিন্ন দৈর্ঘ্যের অ্যামপ্লিকনগুলির জন্য ইলেক্ট্রোকেমিক্যাল সেন্সরগুলির কার্যকারিতাকে প্রভাবিত করে এমন বিভিন্ন প্রক্রিয়াকে চিত্রিত করে, একটি UV/Vis স্পেকট্রোফোটোমিটার ব্যবহার করে অপটিক্যাল পরিমাপের দ্বারা যাচাই করা ঘনত্বের সাথে৷ আমাদের পর্যবেক্ষণগুলি সেই অন্তর্দৃষ্টিকে আন্ডারস্কোর করে যে ডিএনএ টুকরা \(\আনুমানিক) পর্যন্ত দীর্ঘ হয়৷ \(500\,\hbox {bp}\) উচ্চ সংবেদনশীলতার সাথে সনাক্ত করা যেতে পারে এবং নমুনায় লবণের উপস্থিতি সংবেদনশীলতা ডিএনএ ঘনত্বকে প্রভাবিত করে না যা উচ্চ সংবেদনশীলতাকে প্রভাবিত করে (কদাচিৎ \({\hbox {ng}/{\upmu) \hbox {l}}}\) এবং তার উপরে)। উপরন্তু, আমরা বিভিন্ন ধরণের নমুনার প্রভাব তদন্ত করেছি, যার মধ্যে লবণ যুক্ত এবং ছাড়া জেল-বিশুদ্ধ অ্যামপ্লিকন এবং DPV এবং CV পরিমাপে হ্রদের জলের নমুনা যোগ করা রয়েছে।আমরা লক্ষ্য করেছি যে DPV আরও ভাল রেজোলিউশন প্রদান করেছে, যেহেতু ব্যাকগ্রাউন্ড ক্যাপাসিটিভ কারেন্টও CV পরিমাপকে প্রভাবিত করে, এটি কম সংবেদনশীল করে তোলে।
দীর্ঘতর খণ্ডের পরিবর্ধন নির্ভর করে ভাইরাল জিনোমিক RNA-এর অখণ্ডতার উপর। বেশ কিছু গবেষণায় দেখা গেছে যে পরিবেশে RNA-এর অবনতি এবং বিচ্ছিন্নতার সময় বিভক্ত হওয়ার সম্ভাবনার কারণে দীর্ঘতর টুকরোগুলির পরিবর্ধন সবসময় কার্যকর হয় না11,41,42,43,44 .আমরা লক্ষ্য করেছি যে PEG-ভিত্তিক ভাইরাস ঘনত্ব পদ্ধতি অ্যালুমিনিয়াম হাইড্রোক্সাইড-ভিত্তিক ভাইরাস ঘনত্ব পদ্ধতির চেয়ে লেকের জলের নমুনায় স্পাইক করা ফেজ Phi-6 ঘনীভূত করার ক্ষেত্রে বেশি কার্যকর। একাধিক ছোট দৈর্ঘ্যের টেমপ্লেটকে প্রশস্ত করতে এবং ক্রস-নির্দিষ্টতার সম্ভাবনা কমাতে।
জৈবিক নমুনাগুলি দুষ্প্রাপ্য, তাই একটি বায়োসেন্সর ডিজাইন করার প্রয়োজন রয়েছে যা পরীক্ষার জন্য ন্যূনতম নমুনার প্রয়োজন৷ এই গবেষণায় ব্যবহৃত ENIG PCB ইলেক্ট্রোডগুলি শুধুমাত্র প্রয়োজন \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ ) ইলেক্ট্রোডের কার্যকর এলাকা কভার করার জন্য পরীক্ষার জন্য নমুনা। উপরন্তু, পরবর্তী নমুনা বিতরণ করার আগে পরিষ্কার করার পরে একই ইলেক্ট্রোড পুনরায় ব্যবহার করা যেতে পারে। পরিবর্ধিত নমুনাগুলিতে মিথিলিন ব্লু ছাড়া অন্য কোনও রাসায়নিক যোগ করার প্রয়োজন হয় না, যা একটি সস্তা। এবং সাধারণত ব্যবহৃত রাসায়নিক। যেহেতু প্রতিটি ইলেক্ট্রোড তৈরিতে প্রায় $0.55 (বা INR 40) খরচ হয়, তাই এই বায়োসেন্সরটি বিদ্যমান শনাক্তকরণ প্রযুক্তির জন্য একটি সাশ্রয়ী বিকল্প হতে পারে। সারণী 2 দীর্ঘ সময়ের জন্য সাহিত্যে রিপোর্ট করা অন্যান্য সেন্সরগুলির সাথে এই কাজের তুলনা দেখায়। ভিন্ন ভিন্ন নমুনায় ডিএনএ খণ্ড।
প্রদত্ত যে এমবি-ভিত্তিক ইলেক্ট্রোকেমিক্যাল সনাক্তকরণ প্রোটোকলগুলি পিসিআর-এর নির্দিষ্টতার উপর নির্ভর করে, এই পদ্ধতির একটি প্রধান সীমাবদ্ধতা হ'ল বর্জ্য জল এবং হ্রদের জলের মতো ভিন্নজাতীয় নমুনাগুলিতে অ-নির্দিষ্ট পরিবর্ধনের সম্ভাবনা বা স্বল্প-বিশুদ্ধতার প্রাইমার ব্যবহার করা। সংবেদনশীলতা উন্নত করার জন্য। অপরিশোধিত ENIG PCB ইলেক্ট্রোড ব্যবহার করে অপরিশোধিত PCR পণ্যগুলির DNA সনাক্তকরণের জন্য ইলেক্ট্রোকেমিক্যাল সনাক্তকরণ পদ্ধতি, অব্যবহৃত dNTPs এবং প্রাইমারগুলির দ্বারা প্রবর্তিত ত্রুটিগুলিকে আরও ভালভাবে বোঝার জন্য এবং প্রতিক্রিয়া অবস্থা এবং অ্যাসে প্রোটোকলগুলিকে অপ্টিমাইজ করার জন্য প্রয়োজন৷ অতিরিক্ত ভৌত রাসায়নিক পরামিতি যেমন pH, তাপমাত্রা এবং জীববিজ্ঞান পরিমাপের নির্ভুলতা উন্নত করার জন্য জলের নমুনার অক্সিজেনের চাহিদা (BOD) পরিমাপ করা প্রয়োজন হতে পারে।
উপসংহারে, আমরা পরিবেশগত (লেকের জল) নমুনাগুলিতে ভাইরাস সনাক্তকরণের জন্য একটি কম খরচের ইলেক্ট্রোকেমিক্যাল ENIG PCB সেন্সর প্রস্তাব করছি৷ ডিএনএ সেন্সিংয়ের জন্য স্থির অলিগোনিউক্লিওটাইড ইলেক্ট্রোড বা কাস্টম সাবস্ট্রেটের বিপরীতে যার সংবেদনশীলতা বজায় রাখতে ক্রায়োজেনিক স্টোরেজ প্রয়োজন, 53,54 আমাদের কৌশলটি অপরিবর্তিত PCB ব্যবহার করে দীর্ঘ শেলফ লাইফ সহ ইলেক্ট্রোড এবং কোন নির্দিষ্ট স্টোরেজ প্রয়োজনীয়তা নেই এবং তাই LMICs-এ মোতায়েন স্বয়ংক্রিয় নমুনা প্রক্রিয়াকরণ সহ পরিমাপ সমাধানগুলির বিকাশের জন্য উপযুক্ত৷ বায়োসেন্সর লক্ষ্য amplicons দ্রুত সনাক্তকরণের জন্য সস্তা ডিএনএ-ইন্টারকেলেটিং রেডক্স ডাই (এমবি) ব্যবহার করে৷ অনির্দিষ্ট পরিবর্ধন পরিবেশগত নমুনাগুলিতে সাধারণ এই সেন্সিং পদ্ধতির নির্দিষ্টতা হ্রাস করে কারণ MBs-এর একক- এবং ডাবল-স্ট্র্যান্ডেড অলিগোনিউক্লিওটাইডের সাথে অনির্দিষ্ট আবদ্ধতার কারণে। অতএব, এই পরীক্ষার নির্দিষ্টতা প্রাইমার এবং পিসিআর প্রতিক্রিয়া অবস্থার অপ্টিমাইজেশনের উপর নির্ভর করে। উপরন্তু, সিভি এবং পরীক্ষিত নমুনাগুলি থেকে প্রাপ্ত DPV পিক স্রোত প্রতিটি পরীক্ষার জন্য নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ (NTC) থেকে প্রাপ্ত প্রতিক্রিয়াগুলির সাথে সাপেক্ষে ব্যাখ্যা করা উচিত৷ এই কাজে উপস্থাপিত ইলেক্ট্রোকেমিক্যাল সেন্সর ডিজাইন এবং পদ্ধতিগুলি সম্পূর্ণ স্বয়ংক্রিয় এবং নিম্নমানের বিকাশের জন্য অটোস্যাম্পলারগুলির সাথে একীভূত করা যেতে পারে৷ - খরচের সমাধান যা নমুনা সংগ্রহ এবং বিশ্লেষণ করতে পারে এবং তারবিহীনভাবে ফলাফলগুলি পরীক্ষাগারে প্রেরণ করতে পারে৷
Cashdollar, J. & Wymer, L. জলের নমুনা থেকে ভাইরাসের প্রাথমিক ঘনত্বের পদ্ধতি: সাম্প্রতিক গবেষণার একটি পর্যালোচনা এবং মেটা-বিশ্লেষণ।Application.microorganism.115, pp. 1-11 (2013)।
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL জলবাহিত ভাইরাস: নিরাপদ পানীয় জলে বাধা। PLoS প্যাথোজেনস.11, E1004867 (2015)।
শ্রেষ্ঠ, এস. এট আল. নিম্ন ও মধ্যম আয়ের দেশগুলিতে COVID-19-এর ব্যয়-কার্যকর বড় আকারের নজরদারির জন্য ওয়েস্টওয়াটার এপিডেমিওলজি: চ্যালেঞ্জ এবং সুযোগ। ওয়াটার 13, 2897 (2021)।
Palecek, E. & Bartosik, M. Nucleic acid electrochemistry.Chemical.Rev.112, 3427–3481 (2012)।
Tani, A., Thomson, AJ & Butt, JN Methylene Blue as a electrochemical discriminator of single- and double-stranded oligonucleotides inmobilized on the gold substrates. Analyst 126, 1756–1759 (2001)।
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ Comparison of Cation এবং Anion Intercalators for Electrochemical Transduction of DNA Hybridization by Long-range Electron Transfer.Electrochemistry.comminicate.6, 648–654 (2004)।
Wong, EL & Gooding, JJ চার্জ স্থানান্তর DNA এর মাধ্যমে: একটি নির্বাচনী ইলেক্ট্রোকেমিক্যাল DNA biosensor.anus.Chemical.78, 2138–2144 (2006)।
Fang, TH et al. সমসাময়িক ইলেক্ট্রোকেমিক্যাল সনাক্তকরণ সহ রিয়েল-টাইম পিসিআর মাইক্রোফ্লুইডিক ডিভাইস। জৈবিক সেন্সর। বায়োইলেক্ট্রনিক্স।24, 2131–2136 (2009)।
Win, BY et al. ডিএনএ-এর সাথে মিথিলিন ব্লু-এর মিথস্ক্রিয়ার উপর ভিত্তি করে একটি ইলেক্ট্রোকেমিক্যাল রিয়েল-টাইম পিসিআর সিস্টেমের সিগন্যালিং মেকানিজম অধ্যয়ন এবং কর্মক্ষমতা যাচাই। বিশ্লেষক 136, 1573-1579 (2011)।
Ramirez-Chavarria, RG et al. Loop-mediated isothermal amplification-based electrochemical sensor for sars-cov-2 সনাক্তকরণের জন্য বর্জ্য জলের নমুনা.J.Environment.Chemical.Britain.10, 107488 (2022)।
কুমার, এম. এট আল. PCB ইলেক্ট্রোড সহ SARS-CoV-2 অ্যামপ্লিকনগুলির ইলেক্ট্রোকেমিক্যাল সেন্সিং৷ সেন্সর সক্রিয় করা হয়েছে৷B রসায়ন.343, 130169 (2021)৷
কিতামুরা, কে., সাদামাসু, কে., মুরামাতসু, এম. ও ইয়োশিদা, এইচ. বর্জ্য জলের কঠিন ভগ্নাংশে SARS-CoV-2 RNA এর দক্ষ সনাক্তকরণ।
Alygizakis, N. et al. বর্জ্য জলে SARS-CoV-2 সনাক্তকরণের জন্য বিশ্লেষণাত্মক পদ্ধতি: প্রোটোকল এবং ভবিষ্যত দৃষ্টিভঙ্গি।TraC ট্রেন্ডিং anal.Chemical.134, 116125 (2020)।
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. & Kashtan, N. সারভাইভাল অফ দ্য এনভেলপড ব্যাকটেরিওফেজ Phi6 (SARS-CoV-2-এর জন্য একটি সারোগেট) কাচের পৃষ্ঠে জমা হওয়া বাষ্পীভূত লালা ফোঁটাগুলিতে। science.Rep.10, 1-10 (2020)।
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ পরিবেশগত অধ্যবসায় একটি SARS-CoV-2 সারোগেট (Phi6) ইন ফ্রি-লিভিং অ্যামিবা.জে.জল স্বাস্থ্য 20, 83 (2021)।
Mindich, L. ডাবল-স্ট্র্যান্ডেড RNA ব্যাকটেরিওফেজ\(\varphi\)6.microorganism.Moore.biology.Rev.-এর তিনটি জিনোমিক খণ্ডের সুনির্দিষ্ট প্যাকেজিং।63, 149-160 (1999)।
Pirttimaa, MJ & Bamford, DH RNA phage\(\varphi\)6 প্যাকেজিং অঞ্চলের সেকেন্ডারি স্ট্রাকচার।RNA 6, 880–889 (2000)।
Bonilla, N. et al.Phages on the Tap – ব্যাকটেরিওফেজের ল্যাবরেটরি স্টক প্রস্তুত করার জন্য একটি দ্রুত এবং দক্ষ প্রোটোকল। PeerJ 4, e2261 (2016)।