Nature.com saytına daxil olduğunuz üçün təşəkkür edirik. İstifadə etdiyiniz brauzer versiyasında CSS üçün məhdud dəstək var. Ən yaxşı təcrübə üçün sizə yenilənmiş brauzerdən istifadə etməyi (və ya Internet Explorer-də uyğunluq rejimini söndürməyi) tövsiyə edirik. Bu arada əmin olmaq üçün davamlı dəstək, biz saytı üslub və JavaScript olmadan göstərəcəyik.
Ətraf mühit nümunələrinin monitorinqinin əhəmiyyəti COVID-19 pandemiyasının başlanğıcından bəri yüksək qiymətləndirilmişdir və qPCR əsaslı üsullar bahalı olsa da, bəzi monitorinq səyləri qızıl standartdan istifadə edilməklə həyata keçirilir. Elektrokimyəvi DNT biosensorları potensial olaraq qənaətcil aşağı və orta gəlirli ölkələrdə ekoloji su nümunələrinin monitorinqi üçün həll. Bu işdə biz ENIG-dən istifadə edərək çivili göl suyu nümunələrindən (SARS-CoV-2 üçün məşhur surroqat) təcrid olunmuş Phi6 faqından əldə edilən amplikonların elektrokimyəvi aşkarlanmasını nümayiş etdiririk. səthi dəyişdirmədən PCB elektrodlarını tamamlamaq üçün.cins. Elektrokimyəvi sensor reaksiyası müxtəlif uzunluqlu iki DNT fraqmenti (\({117}\,\hbox {bp}\) və \({503}\,\hbox {bp}\)) üçün hərtərəfli səciyyələndirilib. PZR master-qarışıqlarında duzların metilen mavisi (MB)-DNT qarşılıqlı təsirinə təsiri. Nəticələrimiz göstərir ki, DNT fraqmentlərinin uzunluğu elektrokimyəvi həssaslığı əhəmiyyətli dərəcədə müəyyən edir və bu işdə PZR məhsullarının gellə təmizlənmədən uzun amplikonları aşkar etmək qabiliyyətinin olduğunu nümayiş etdirir. su nümunələrinin yerində ölçülməsi üçün vacibdir.Viral yük üçün tam avtomatlaşdırılmış həll yaxşı vəd edir.
Su yolu ilə virusun ötürülməsi 1940-cı illərdən bəri ictimai sağlamlıq təhlükəsi kimi tanınır, poliomielit və hepatit E1-in su yolu ilə ötürülməsinə dair ilk dəlildir. Ümumdünya Səhiyyə Təşkilatı (ÜST) orta və yüksək sağlamlıq əhəmiyyətinə malik bir neçə su yolu ilə keçən virus patogenlərini təsnif etmişdir2. Ənənəvi virus aşkarlama üsulları yüksək həssas və spesifik olan qızıl standartlı qPCR əsaslı üsullara əsaslanır, lakin bahalı alətlərdən istifadə etməklə laboratoriyada sınaqdan keçirilməsi üçün ixtisaslı kadrlar tələb olunur. Bununla belə, məhdud resursları olan aşağı və orta gəlirli ölkələrdə (LMIC) insan nümunə sınağı, çox güman ki, ətraf mühitdə su nümunəsinin monitorinqindən üstün olacaq. Buna görə də, aşağı və orta gəlirli ölkələrdə su və tullantı su nümunələrinin davamlı, real vaxt rejimində monitorinqi üçün alternativ ucuz metodlara ehtiyac yaranan xəstəlik epidemiyalarının erkən xəbərdarlığı kimi, bununla da onları virus pandemiyasının ciddi sosial-iqtisadi təsirlərindən qoruyur. Nuklein turşuları üçün aşağı qiymətli elektrokimyəvi biosensorlar bu qarşılanmamış ehtiyacın perspektivli potensial həllini təmin edə bilər. Bu DNT biosensorlarının çoxu tamamlayıcı DNT zəncirlərinin elektrodda hərəkətsiz olması faktı ilə işləyir. Nümunədə uyğun ardıcıllıq mövcud olduqda səthi və hibridləşir. Bu, daha sonra kalium dəmir/ferrosiyanid kimi redoks vasitəçilərindən istifadə etməklə müxtəlif elektrokimyəvi üsullarla siqnala çevrilə bilər. Metilen mavisi (MB) redoks-aktiv molekullardan biridir. Tək zəncirli DNT-yə daha qeyri-spesifik bağlanması ilə yanaşı, ikiqat zəncirli DNT-yə (dsDNA) interkalasiya olunduğu bildirilmişdir5,6. MB-lərin MB-DNT komplekslərini meydana gətirmək üçün interkalasiya xarakteri onları bir neçə elektrokimyəvi DNT-də redoks mediatorları kimi məşhur seçim edir. sensor konfiqurasiyaları5,6,7,8,9. MB-nin DNT-yə interkalasiyası qeyri-spesifik olsa da və bu elektrokimyəvi sensorun spesifikliyi əsasən PCR və ya izotermik gücləndirmə üçün istifadə olunan primerlərin təmizliyindən asılı olsa da, o, real diaqnostikanı həyata keçirmək üçün çox uyğundur. -zaman elektrokimyəvi əsaslı qPCR və ya DNT konsentrasiyasının ölçülməsinə alternativ olaraq flüoresan izotermik gücləndirmə 9 .Belə bir tətbiqdə Won və başqaları. Qızıl elektrodların səthi real vaxt üçün 6-merkapto-1-heksanol (MCH) ilə dəyişdirildi. diferensial impuls voltametriyasından (DPV) istifadə edərək MB ilə PCR amplikonlarının ölçülməsi 9. Digər hallarda, Ramirez və başqaları. Ekranda çap edilmiş elektrodlarla MB istifadə edərək RT-LAMP reaksiyası ilə çirkab suda SARS-CoV-2-nin aşkarlanması. Platin elektrodlar da reaksiyalar zamanı amplikonların elektrokimyəvi aşkarlanması üçün nəzərdə tutulmuş mikrofluidik PCR platformasında in situ elektrodlar kimi istifadə olunur 8 .Bütün bu tədqiqatlar elektrodların səthinin modifikasiyasını tələb edir, bu funksionallaşdırılmış elektrodların sabitliyi üçün xüsusi saxlama tələbləri səbəbindən artan istehsal və əməliyyat xərclərini nəzərdə tutur.
Göl suyu nümunələrində cəmlənmiş virus hissəciklərindən alınan amplikonların elektrokimyəvi aşkarlanması üçün iş axınının sxemi.
Biz bu yaxınlarda SARS-CoV-2 amplikonlarının DPV və dəyişdirilməmiş elektrodların səthində MB-DNT komplekslərinin adsorbsiyasından qaynaqlanan tsiklik voltametriya (CV) əsasında aşağı qiymətli çap dövrə lövhəsi (PCB) elektrodları ilə elektrokimyəvi tədqiqini nümayiş etdirdik. cari 11.Biz bildiririk ki, daha qısa fraqmentlərlə müqayisədə CDC tərəfindən tövsiyə edilən N1 irəli və N2 tərs primerlərdən istifadə etməklə əmələ gələn daha uzun DNT fraqmentləri (N1-N2, \({943}\, \hbox)) sensor reaksiyasında daha yaxşı xəttilik nümayiş etdirdi. ( N1, \(72\,\hbox {bp}\)) N1 irəli və N1 tərs primer dəstlərindən istifadə etməklə əmələ gəlib. Bu tədqiqatlar nukleazsız suda hazırlanmış DNT seyreltmələrindən istifadə edilməklə bildirilir. Platforma SARS-CoV-ni aşkar etmək üçün də istifadə edilib. Simulyasiya edilmiş tullantı su nümunələrində -2 amplikon (SARS-CoV-2 RNT ilə ümumi RNT nümunələrinin sıçraması ilə əldə edilir). RNT izolyasiya və aşağı axın emal zamanı kəsilməyə həssas olduğundan,12,13 bu heterojen nümunə ilə daha uzun fraqmentləri gücləndirmək çətindir. Buna görə də, çirkab suda SARS-CoV-2 amplikonunun elektrokimyəvi tədqiqinin nümayişi daha qısa \(72\,\hbox {bp}\) N1 fraqmenti ilə məhdudlaşır.
Bu işdə biz göl suyu nümunələrindən cəmlənmiş və təcrid olunmuş Phi6 faqının ENIG PCB əsaslı elektrokimyəvi tədqiqinin mümkünlüyünü araşdırdıq (Şəkil 1). Phi6 faqları ölçülərinə görə (80-100 nm) SARS-CoV-2 və həmçinin lipid membranı və sünbül zülalına malikdir. Bu səbəblərə görə Phi6 bakteriofajı SARS-CoV-2 və digər örtülmüş patogen RNT virusları üçün məşhur surroqatdır14,15. Faj hissəciklərindən təcrid olunmuş RNT cDNA sintezi üçün şablon kimi istifadə edilmişdir. 117 və 503 əsas cüt uzunluğunda iki DNT fraqmentini əldə etmək üçün PCR. Əvvəlki işimizdə \(943\,\hbox {bp}\) N1-N2 fraqmentlərini gücləndirmək çətinliyini nəzərə alaraq, biz aralıq uzunluqlu fraqmentləri (\(117) hədəfləyirik. \,\hbox {bp}\) və \(503 \,\hbox {bp}\)), mövcud primerlərə əsaslanır. Elektrokimyəvi sensor reaksiyası sistematik olaraq geniş konsentrasiya diapazonunda tədqiq edilmişdir (\({10}\,{) \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) - \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) Hər iki fraqment üçün MB-nin mövcudluğu, duzun sensorun reaksiyasına təsiri spektrofotometrik ölçmələrlə xarakterizə edilmiş və çarpaz təsdiq edilmişdir. Bu işin əsas töhfələri aşağıdakılardır:
DNT fraqmentinin uzunluğu və nümunədə duzun olması həssaslığa güclü təsir göstərir.Nəticələrimiz göstərir ki, elektrokimyəvi aktivlik DNT konsentrasiyası və uzunluğundan asılı olaraq voltametrik cavabda MB, DNT və sensorun qarşılıqlı təsirinin müxtəlif mexanizmlərindən asılıdır, daha uzun Fraqmentlər daha yüksək həssaslıq göstərir, baxmayaraq ki, duz arasında elektrostatik qarşılıqlı təsirlərə mənfi təsir göstərir. MB və DNT.
DNT konsentrasiyası dəyişdirilməmiş elektrodlarda MB-DNT qarşılıqlı təsir mexanizmini müəyyən edir Biz MB-DNT qarşılıqlı təsirinin müxtəlif mexanizmlərinin DNT konsentrasiyasından asılı olduğunu nümayiş etdiririk. DNT konsentrasiyalarında az miqdarda \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), biz müşahidə etdik ki, elektrokimyəvi cərəyan reaksiyası əsasən MB-DNT-nin elektrodda adsorbsiyası ilə, aşağı konsentrasiyalarda isə yüksək DNT konsentrasiyalarında elektrokimyəvi cərəyan reaksiyası redoksun sterik inhibəsi ilə müəyyən edilirdi. DNT baza cütləri arasında MB daxil edilməsinə görə fəaliyyət.
Göl Suyu Nümunələrində Viral Nuklein Turşularının ENIG PCB Əsaslı Elektrokimyəvi Tədqiqi Müşahidələr Powai gölündən, IIT Mumbai Kampusundan su nümunələrindən əldə edilmiş Phi6 əlavə edilmiş \(503\,\hbox {bp}\) DNT fraqmentlərinin elektrokimyəvi aşkarlanması ilə təsdiq edilmişdir. Nəticə fag.
Tətbiqin aşağı qiyməti və tam avtomatlaşdırılmış monitorinq sistemlərinə, oliqonukleotidlərə və ya daha uzun raf ömrü olan elektrodlarda aptamerlərə inteqrasiya potensialı.
Phage Phi6, Pseudomonas syringae-ni yoluxduran Cytoviridae ailəsinin qapalı dsRNA virusudur. Phi6 faqının genomu 3 fraqment şəklində mövcuddur: S (\(2.95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4.07) \,\hbox {Kb}\)) və L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\))16,17. Phi6 faqı patogen olmayan BSL-1 Pseudomonas ştamını yoluxdurduğundan istifadə etmək təhlükəsizdir. və laboratoriyada asanlıqla yetişdirilə bilər.Phage Phi6 və onun sahibi Pseudomonas syringae Felix d'Herelle Bakterial Viruslar üçün Referans Mərkəzindən, Laval Universiteti, Kanadadan alınıb (istinad mərkəzinin kataloq nömrələri müvafiq olaraq HER-102 və HER-1102-dir) .Phi6 faqı və onun aparıcısı istinad mərkəzinin göstərişinə uyğun olaraq canlandırıldı. Phage Phi6 plitə lizisi və elüsyon yolu ilə təmizlənərək \(\təxminən 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { ilə son titrləri əldə etdi. ml}}\) (lövhə əmələ gətirən vahidlər/ millilitr). RNT istehsalçının təlimatlarına uyğun olaraq GenElute™ Universal Ümumi RNT Təmizləmə Kitindən (Sigma-Aldrich) istifadə edərək təmizlənmiş faq hissəciklərindən təcrid edilmişdir. Qısaca olaraq, təmizlənmiş faq Phi6 suspenziyası\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) parçalandı və RNT-nin qatran sütununa bağlanmasına imkan vermək üçün lizat spin sütununa yükləndi. Daha sonra RNT elüsyon məhlulunda elüt edilir \({ 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) dəst tərəfindən təmin edilmişdir. RNT-nin udma ilə konsentrasiyasını \(260\,\hbox {nm}\-də təxmin edin). ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) sonrakı istifadəyə qədər.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) iScript cDNA sintez dəsti (Bio) -Rad Laboratories) istehsalçının göstərişlərinə uyğun olaraq cDNA sintezi üçün şablon kimi istifadə edilmişdir. Qısaca desək, cDNA sintez reaksiyası 3 mərhələdən ibarətdir: \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min} }\) , \({20}\,{\hbox {min}}\) ünvanının tərs transkripsiyası \({46}\,{^{\circ) }\hbox {C}}\), və tərs Qeydiyyatçı \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) üçün \({1}\,{\hbox {dəq.) }}\).1% agaroza gel üzərində işləyərkən cDNA gözlənilən üç RNT fraqmentinə uyğun gələn üç zolaq göstərdi (məlumatlar göstərilmir). Aşağıdakı primerlər uzunluğu 117 və 503 bp olan iki DNT fraqmentini gücləndirmək üçün istifadə edilmişdir, miniPCR® mini8 termal siklatorda PCR üçün şablon kimi cDNA-dan istifadə:
\(117\,\hbox {bp}\) və \(503\,\hbox {bp}\) üçün primerlər müvafiq olaraq M seqmentinin 1476-1575 nukleotidinə və L seqmentinin 458-943 nukleotidinə uyğundur. .Bütün gücləndirilmiş PZR məhsulları 1% agaroza gellərində elektroforasiya edilmiş və gücləndirilmiş hədəf DNT GeneJET Gel Ekstraksiya Kitindən (Thermo Fisher Scientific) istifadə edərək təmizlənmişdir.
IIT Mumbai şəhərciyindəki göldən (Powai Gölü, Powai, Mumbay) faj hissəcikləri əlavə etmək üçün istifadə edilib. Göl suyu çıxarmaq üçün \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) membrandan süzülüb. asılmış hissəciklər və sonra Phi6 faq əlavə edildi. \({1}\,{\hbox {ml}}\) və \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} əlavə edin. \) \( {100}\ ,{\hbox {ml}}\) süzülmüş göl suyuna, \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\). Kiçik hissəcik lövhə analizi ilə viral yükün ölçülməsi üçün qorunur. Biz sünbüllü Phi6 virus hissəciklərini konsentrasiya etmək üçün iki fərqli üsulu sınaqdan keçirdik: (1) ətraf mühit nümunələrindən bir neçə zərflənmiş RNT virusunun konsentrasiyası üçün təsdiqlənmiş alüminium hidroksid adsorbsiya-çökmə üsulu19 və (2) ) Polietilen qlikol (PEG) əsaslı virus konsentrasiyası metodu Flood et al.20 .PEG əsaslı metodun bərpa səmərəliliyinin alüminium hidroksid metodundan daha yaxşı olduğu aşkar edildiyindən, göl suyu nümunələrindən Phi6 hissəciklərinin konsentrasiyası üçün PEG əsaslı metoddan istifadə edilmişdir.
İstifadə olunan PEG metodu aşağıdakı kimi idi: PEG 8000 və \(\hbox {NaCl}\) 8% PEG 8000 və \(0.2\,\hbox {M} \) \( əldə etmək üçün Phi6-spiked göl suyu nümunələrinə əlavə edildi. \ hbox {NaCl}\).Nümunələr çalkalayıcıda inkubasiya edilib\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), sonra \(4700 \,\hbox {g}\) \({45}\,{\hbox {min}}\-də sentrifuqalanır. Supernatantı atın və pelleti \({1}\, Eyni supernatantda {\hbox {ml}}\). dəstlə təchiz edilmiş elüsyon buferində\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\). RNT konsentrasiyası nümunədən nümunəyə üç nüsxədə dəyişəcəyindən, \({2}\,{\upmu \ hbox {l}}\) RNT konsentrasiyasından asılı olmayaraq hər üçü üçün istifadə olunur. Nümunələrin cDNA sintezi. cDNA sintezi əvvəllər təsvir edildiyi kimi həyata keçirilir.\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNA \ (117\,\hbox {bp}\) və \(503\,\hbox { gücləndirmək üçün 35 dövr üçün \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR üçün şablon kimi istifadə edilmişdir. bp}\) fraqmentləri. Bu nümunələr “1:1″, yəni seyreltilmədən təqdim olunur. Neqativ nəzarət kimi şablonsuz nəzarət (NTC), təmizlənmiş faqdan təcrid olunmuş RNT istifadə edərək sintez edilmiş cDNT quruldu. müsbət nəzarət (PC) üçün şablon kimi. Kəmiyyət PCR (qPCR) Stratagene Mx3000P RT-PCR alətində Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies) istifadə edərək həyata keçirilib. Reaksiyalar əvvəllər olduğu kimi üç nüsxədə qurulmuşdur. təsvir edilmişdir. Bütün nümunələr üçün dövriyyə həddi (Ct) qeydə alınmışdır. Bundan əlavə, seyreltilmiş nümunələr süzülmüş göl suyunda 1:100 nisbətində seyreltilmiş cDNA istifadə edərək \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) olmuşdur. \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) 35 dövr üçün PCR. Bu nümunələr “1:100″ kimi təqdim olunur.
PCB elektrodları, əlavə qızılla örtülməyə ehtiyac olmadan, kommersiyada mövcud olan aşağı qiymətli Elektrosiz Nikel Daldırma Qızılı (ENIG) prosesindən istifadə etməklə hazırlanır. ENIG PCB elektrodunun spesifikasiyası əvvəlki işimizdə ətraflı təsvir edilmişdir11. ENIG PCB elektrodları üçün ənənəvi elektrod təmizləmə üsulları, məsələn piranya məhlulu və ya sulfat turşusunun siklik voltammetriyası tövsiyə edilmir, çünki onlar nazik qızıl təbəqənin (qalınlıq \(\təxminən\) \(100\,\hbox {nm }\)) soyulmasına və meylli olan mis təbəqələrin ifşa edilməsinə səbəb ola bilər. korroziyaya 21, 22, 23, 24, 25. Buna görə də elektrodları IPA ilə nəmlənmiş tüysüz parça ilə təmizləyin. Sınaq ediləcək nümunə \({50}\,{\upmu \hbox {M} ilə inkubasiya edilib. }\) Asan daxil etmək üçün \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) daxilində MB. Əvvəlki işimizdə , biz sensorun həssaslığının və xəttinin MB konsentrasiyasını artırmaqla yaxşılaşdığını müşahidə etdik 11 .Əvvəlki işimizdə bildirilmiş optimallaşdırmalara əsasən, biz \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB istifadə etdik. Bu tədqiqatda DNT-ni yerləşdirmək üçün konsentrasiyalar. İkiqat zəncirli DNT-nin (ds-DNT) elektrokimyəvi aşkarlanmasına anion və ya kationik interkalatorlardan istifadə etməklə nail olmaq olar. Anion interkalatorlar DNT-ni daha yaxşı seçiciliklə aşkar etmələrinə baxmayaraq, onlar bir gecədə inkubasiya tələb edir və nəticədə daha uzun aşkarlama vaxtları olur. digər tərəfdən MB kimi katyonik interkalatorlar ds-DNA6-nın elektrokimyəvi aşkarlanması üçün təxminən \({1}\,{\hbox {h}}\) daha qısa inkubasiya müddəti tələb edir. elektrod\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), sonra başqa nümunə ilə davam etməzdən əvvəl IPA ilə nəmlənmiş bez ilə təmizləyin.bir ölçmə. Hər nümunə 5 fərqli elektrodda sınaqdan keçirildi, əgər başqa cür göstərilmədisə. DPV və CV ölçmələri PalmSens Sensit Smart potensiostatından istifadə edilərək aparıldı və PSTrace proqramı potensiostatın konfiqurasiyası və pik cərəyan hesablamaları da daxil olmaqla məlumatların toplanması üçün istifadə edildi. Aşağıdakı parametrlər istifadə olunur. DPV və CV ölçmələri üçün:
DPV: Tarazlıq vaxtı = \(8\,\hbox {s}\), Gərginlik addımı = \(3\,\hbox {mV}\), Pulse gərginliyi = \(25\,\hbox {mV}\), impuls müddəti = \(50\,\hbox {ms}\), skan sürəti = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: Tarazlıq vaxtı = \(8\,\hbox {s}\), Gərginlik addımı = \(3\,\hbox {mV}\), Süpürmə dərəcəsi = \({300}\,\hbox {mV/s) }\)
\({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB ilə kompleksləşdirilmiş DNT-nin voltammoqramlarından əldə edilən pik cərəyanlar: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
DPV və CV voltammoqramları DNT ilə kompleksləşdirilmiş ENIG PCB elektrodlarında \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB (10-\({20}\,{\ hbox {ng) konsentrasiyalarında əldə edilmişdir. }/{\upmu \hbox {l}}}\) yəni \(117\,\hbox {bp}\ ) və 0,03 üçün 0,13–\({0,26}\,{\upmu \hbox {M}}\) –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) üçün \(503\,\hbox {bp}\)). Təmsilçi voltamoqramlar Əlavə Məlumatda Şəkil S1-də göstərilmişdir. Şəkil 2 nəticələri göstərir gel-təmizlənmiş PCR məhsullarından istifadə edərək DPV və CV ölçmələrinin (pik cərəyan). CV ölçmələri ilə müqayisədə, DPV ölçmələri daha yüksək həssaslıq (DNT konsentrasiyasının bir funksiyası kimi) göstərir, çünki CV ölçmələrində fon tutumlu cərəyanlar Farada cərəyanlarını gizlədir 26 .Məlumatlar qutusunun hər qutusu üçün 5 elektroddan ölçmələr var. Bütün ölçmələr elektroddan elektroda dəyişməyə görə ölçmə xətalarının qarşısını almaq üçün eyni elektrod dəstindən istifadə edir. Biz DPV və CV-nin aşağı konsentrasiyaları üçün ölçülən pik cərəyanlarda artan tendensiya müşahidə etdik. , daha uzun (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ \(117) ilə müqayisədə). MB-DNT kompleksinin adsorbsiyası elektrodda yük ötürülməsini asanlaşdırır, bu da pik cərəyanın artmasına kömək edir. Digər tədqiqatlar MB-DNT interkalasiyasına oliqonukleotidlərin ölçüsü və ardıcıllığının təsirini göstərmişdir27,28,29,30. Quanin İki amplikonun (\(117\,\hbox {bp}\) və \(503\,\hbox {bp}\)) -sitozin (GC) tərkibi təqribən 50% idi ki, bu da müşahidənin fərqinə görə olduğunu göstərir. amplikon uzunluğuna. Lakin, daha yüksək DNT konsentrasiyaları üçün (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), \(503\,\hbox {bp} üçün) \) və \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) üçün \(117\,\hbox {bp}\)), biz iki gücləndirmə müşahidə edirik Subsların pik cərəyanları həm DPV, həm də CV ölçmələrində azalır. Bunun səbəbi MB-nin DNT-nin əsas cütləri arasında doyması və interkalasiyasıdır, nəticədə MB31,32-də reduksiya olunan qrupun redoks aktivliyinin sterik inhibəsi ilə nəticələnir.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503) \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV。
PCR master-qarışıqlarında mövcud olan duzlar MB və DNT arasında elektrostatik qarşılıqlı təsirlərə mane olur, buna görə də \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) əlavə edərək \({50} \,{\) upmu \hbox {M}}\) MB-DNT qarşılıqlı təsirinə duzun təsirini öyrənmək üçün MB gellə təmizlənmiş məhsul. Şəkil 3-də göstərildiyi kimi, biz müşahidə etdik ki, daha yüksək DNT konsentrasiyaları üçün (\(>{2}\,{\) hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) və \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) üçün \(117\,\hbox {bp} \)), DPV və CV-də Duzun əlavə edilməsi ölçmələrə əhəmiyyətli dərəcədə təsir göstərməmişdir (təmsilci voltammoqramlar üçün Əlavə Məlumatda Şəkil S2-ə baxın). Bununla belə, aşağı DNT konsentrasiyaları, duzun əlavə edilməsi həssaslığı əhəmiyyətli dərəcədə azaldır, nəticədə DNT konsentrasiyası ilə cərəyanda əhəmiyyətli dəyişiklik baş vermir. Duzun MB-DNT qarşılıqlı təsirinə və interkalasiyasına oxşar mənfi təsiri əvvəllər digər tədqiqatçılar tərəfindən bildirilmişdir33,34.\(\hbox { Mg}^{2+}\) kationları DNT-nin mənfi fosfat onurğasına bağlanır və bununla da MB və DNT arasında elektrostatik qarşılıqlı əlaqəyə mane olur. Daha yüksək DNT konsentrasiyalarında redoks-aktiv MB-lərin sterik inhibəsi daha aşağı pik cərəyanlarla nəticələnir, buna görə də elektrostatik qarşılıqlı təsirlər sensor reaksiyasına əhəmiyyətli dərəcədə təsir göstərmir. Əsas məqam ondan ibarətdir ki, bu biosensor daha yüksək DNT konsentrasiyalarını aşkar etmək üçün daha uyğundur (nadir hallarda \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) və ya daha yüksək), PCR məhsullarının gellə təmizlənməsinin mümkün olmaya biləcəyi ətraf mühitdəki su nümunələrinin tam avtomatlaşdırılmış emalı üçün.
\({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) ilə kompleksləşdirilmiş DNT-nin müxtəlif konsentrasiyaları üçün 600-700 \(\hbox {nm}\) dalğa uzunluğu diapazonu üçün udma əyrisi altındakı sahə: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) duzlu və duzsuz (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) duzlu və duzsuz (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB nümunələrinə uyğun DNT konsentrasiyaları DNT yoxdur.
Yuxarıdakı nəticələri daha da yoxlamaq üçün UV/Vis spektrofotometrindən (Thermo Scientific Multiskan GO) istifadə edərək optik ölçmələr apardıq, hər biri üçün nümunələr \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) istifadə edildi. Ölçmə. Udulma işarəsi artan DNT konsentrasiyası ilə azalır, \(600\,\hbox {nm}\) dalğa uzunluğu diapazonu üçün udma əyrisi altındakı tendensiyadan \(700\,\hbox { nm}\), Şəkil 4-də göstərildiyi kimi (Əlavə Məlumatda Şəkil S3-də göstərilən absorbsiya spektri). \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox-dan az olan DNT konsentrasiyası olan nümunələr üçün) {l}}}\), DNT tərkibli və yalnız MB nümunələri arasında qəbulda əhəmiyyətli fərq yox idi (\(503\,\hbox {bp}\) və \(117\,\hbox {bp}\ üçün) ) uzunluq fraqmentləri), redoks-aktiv MB-nin sterik inhibəsinin olmamasını göstərir. Daha yüksək DNT konsentrasiyalarında biz absorbans siqnalında tədricən azalma müşahidə etdik və duzun iştirakı ilə absorbsiyada daha az azalma qeyd etdik. Bu nəticələr molekulyar DNT hibridlərində baza yığılması ilə qarşılıqlı təsirlər və sterik inhibə. Bizim nəticələrimiz \(\pi\)–\(\pi ^*\-də hipoxromatikliyi azalmış enerji səviyyələri ilə əlaqələndirən MB-DNT interkalasiyasının spektroskopik tədqiqatlarına dair ədəbiyyatdakı hesabatlara uyğundur. ) interkalasiyaya görə elektron keçidlər Layers 36, 37, 38.
Phi6 fagının agaroz gel elektroforezi: göl suyu nümunələrindən \(117\,\hbox {bp}\) və \(503\,\hbox {bp}\) uzunluğunda PCR məhsulları.M-DNT markeri;NTC-şablonsuz nəzarət, müvafiq amplikonları ehtiva edən primerlər;PC müsbət nəzarət;Üç nüsxədə 1, 2, 3 seyreltilməmiş (1:1) çubuqlu göl suyu nümunələri. \(503\,\-də istifadə olunmamış oliqonukleotidlərə görə \(\təxminən 50\,\hbox {bp}\) zolaq görünür. hbox {bp}\) zolağı.
Biz sensorun faydasını Phi6 fajı ilə çivilənmiş Powai gölü su nümunələrindən istifadə edərək qiymətləndirdik. Fajlı su nümunələrindən təcrid olunmuş RNT konsentrasiyaları 15,8–\({19,4}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox { arasında dəyişdi. ml}}\), təmizlənmiş faq süspansiyonlarından təcrid olunmuşlar isə RNT-nin təxminən 1 bərpa effektivliyi ilə \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) olduğu təxmin edilmişdir. %.RNT cDNA-ya əks transkripsiya edilmiş və PCR və qPCR üçün şablon kimi istifadə edilmişdir. Məhsulun ölçüsü sensorla sınaqdan əvvəl agaroz gel elektroforezi ilə təsdiq edilmişdir (Şəkil 5). Bu nümunələr gellə təmizlənməmişdir və buna görə də PCR-in bütün komponentləri kimi qPCR zamanı qeydə alınan Ct dəyərlərinin (Cədvəl 1) müvafiq sünbüllü su nümunələrindən təcrid olunmuş RNT konsentrasiyası ilə əlaqəli olduğu göstərildi. Ct dəyəri flüoresan siqnal üçün tələb olunan dövrlərin sayını göstərir. eşik həddi və ya fon siqnalını aşır. Yüksək Ct dəyərləri daha aşağı şablon konsentrasiyalarını göstərir və əksinə. NTC nümunələrinin Ct dəyərləri gözlənildiyi qədər yüksək idi. \(\təxminən 3\) Ct dəyərlərində fərq müsbət nəzarət və test nümunəsi daha sonra göstərir ki, hər bir test nümunəsi müsbət nəzarətlə müqayisədə təxminən 1% şablona malikdir. Biz əvvəllər daha uzun amplikonların daha yaxşı həssaslığa səbəb olduğunu müzakirə etmişik. Heterojen ətraf mühit nümunələrindən təcrid olunmuş daha uzun fraqmentlərin gücləndirilməsi çatışmazlıqlar nəzərə alınmaqla çətindir. aşağı virus konsentrasiyası və RNT deqradasiyası. Bununla belə, virus zənginləşdirmə və PCR gücləndirmə protokolumuzla biz elektrokimyəvi zondlama üçün \(503\,\hbox {bp}\) fraqmentini uğurla gücləndirə bildik.
Şəkil 6 həm şablon (1:1) kimi seyreltilməmiş cDNA, həm də şablon kimi 100 qat seyreltilmiş cDNA (1:100) yerinə yetirilmiş PCR istifadə edən \(503\,\hbox {bp}\) fraqment amplikonunun elektrokimyəvi sensor nəticələrini göstərir. , NTC və PC ilə müqayisədə (nümayəndə voltammoqramlar üçün Əlavə Məlumatda Şəkil S4-ə baxın). Şəkil 6-dakı qutuda olan hər qutuda 5 elektrodda üç nümunənin ölçmələri var. Elektrodla bağlı səhvlərin qarşısını almaq üçün bütün nümunələri ölçmək üçün eyni elektrodlardan istifadə edilmişdir. -elektroda dəyişkənlik.CV ölçmələri ilə müqayisədə, DPV ölçmələri test və PC nümunələrini NTC-lərdən ayırmaq üçün daha yaxşı həlledicilik göstərir, çünki əvvəllər qeyd edildiyi kimi, Farada cərəyanları sonunculardakı fon kapasitiv cərəyanları səbəbindən gizlənir. Daha uzun amplikonlar üçün biz müşahidə etdik ki, mənfi nəzarət (NTC) müsbət nəzarətə nisbətən daha yüksək CV və DPV pik cərəyanları ilə nəticələndi, halbuki müsbət və seyreltilməmiş sınaq nümunələri DPV pik cərəyanlarının oxşar pik hündürlüklərini göstərdi. Hər bir seyreltilməmiş üçün ölçülmüş orta və orta dəyərlər (1:1) ) test nümunəsi və PC NTC nümunəsi üçün sensor çıxışından aydın şəkildə həll edilə bilər, halbuki 1:100 seyreltilmiş nümunə üçün ayırdetmə daha az ifadə edilir. cDNA-nın 100 qat qatlanması üçün biz gel elektroforezi zamanı heç bir zolaq müşahidə etmədik. (Şəkil 5-də göstərilməyən zolaqlar) və müvafiq DPV və CV pik cərəyanları NTC üçün gözlənilən cərəyanlara bənzəyirdi. \(117\,\hbox {bp}\) fraqmenti üçün nəticələr Əlavə Məlumatda göstərilib. Mənfi nəzarət, elektrodda sərbəst MB-nin adsorbsiyasına və MB-nin tək zəncirli primer oliqonukleotidlə qarşılıqlı əlaqəsinə görə PCB sensorundan elektrokimyəvi reaksiyaya səbəb oldu. Buna görə də, nümunə hər dəfə sınaqdan keçirildikdə, mənfi nəzarət həyata keçirilməlidir və diferensial (nisbi) ölçüyə nail olmaq üçün mənfi nəzarətin əldə etdiyi pik cərəyanla müqayisədə sınaq nümunəsinin pik cərəyanı39,40 test nümunəsini müsbət və ya mənfi kimi təsnif etmək üçün.
(a) DPV və (b) göl suyu nümunələrində \(503\,\hbox {bp}\) fraqmentlərin elektrokimyəvi aşkarlanması üçün CV pik cərəyanı. Test nümunələri üç nüsxədə ölçüldü və heç bir şablon nəzarəti (NTC) ilə müqayisə edildi və müsbət nəzarət (PC).
Bizim tapıntılarımız müxtəlif DNT-lər üçün müxtəlif uzunluqlu amplikonlar üçün elektrokimyəvi sensorların işinə təsir edən müxtəlif mexanizmləri təsvir edir, konsentrasiyalar UV/Vis spektrofotometrindən istifadə edərək optik ölçmələrlə təsdiqlənir. Müşahidələrimiz \(\təxminən\)-ə qədər daha uzun DNT fraqmentlərinin olduğu fikrini vurğulayır. \(500\,\hbox {bp}\) daha yüksək həssaslıqla aşkar edilə bilər və nümunədə duzun olmaması Həssaslıq DNT konsentrasiyası daha yüksək həssaslığa təsir edir (nadir hallarda \({\hbox {ng}/{\upmu) \hbox {l}}}\) və yuxarıda).Bundan əlavə, biz müxtəlif növ nümunələrin, o cümlədən duz əlavə edilmiş və duzsuz gellə təmizlənmiş amplikonların, DPV və CV ölçmələrində göl suyu nümunələrinin əlavə edilməsinin təsirini araşdırdıq.DPV-nin daha yaxşı ayırdetmə təmin etdiyini müşahidə etdik, çünki fon tutumlu cərəyan da CV ölçülməsinə təsir edərək onu daha az həssas edir.
Daha uzun fraqmentlərin gücləndirilməsi virus genomik RNT-nin bütövlüyündən asılıdır. Bir sıra tədqiqatlar göstərmişdir ki, ətraf mühitdə RNT-nin deqradasiyası və təcrid zamanı splaysləşmə potensialı səbəbindən daha uzun fraqmentlərin gücləndirilməsi həmişə effektiv olmur11,41,42,43,44 .Biz müşahidə etdik ki, PEG-əsaslı virus konsentrasiyası metodu, alüminium hidroksid əsaslı virus konsentrasiyası metodundan daha çox göl suyu nümunələrində Phi-6 sünbüllü faqın konsentrasiyasında daha təsirli idi. Uzun DNT fraqmentlərini aşkar etmək qabiliyyəti multipleks PCR tələbini dəf etdi çox qısa uzunluqlu şablonları gücləndirmək və çarpaz spesifiklik imkanlarını azaltmaq.
Bioloji nümunələr azdır, ona görə də sınaq üçün minimal nümunələr tələb edən biosensorun layihələndirilməsinə ehtiyac var. Bu tədqiqatda istifadə olunan ENIG PCB elektrodları yalnız \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ tələb edirdi. ) elektrodların effektiv sahəsini əhatə etmək üçün sınaq üçün nümunələr. Bundan əlavə, eyni elektrod növbəti nümunəni verməzdən əvvəl təmizləndikdən sonra təkrar istifadə edilə bilər. Gücləndirilmiş nümunələr ucuz olan metilen mavisindən başqa heç bir kimyəvi maddənin əlavə edilməsini tələb etmir. və tez-tez istifadə olunan kimyəvi. Hər bir elektrodun istehsalı təxminən 0,55 dollara (və ya 40 INR) başa gəldiyindən, bu biosensor mövcud aşkarlama texnologiyalarına sərfəli alternativ ola bilər. Cədvəl 2 bu işin ədəbiyyatda uzun müddətdir bildirilmiş digər sensorlarla müqayisəsini göstərir. Heterojen nümunələrdə DNT fraqmentləri.
MB əsaslı elektrokimyəvi aşkarlama protokollarının PZR-in spesifikliyinə əsaslandığını nəzərə alsaq, bu metodun əsas məhdudiyyəti tullantı suları və göl suyu kimi heterojen nümunələrdə qeyri-spesifik gücləndirmə və ya aşağı təmizlikli primerlərdən istifadə potensialıdır. dəyişdirilməmiş ENIG PCB elektrodlarından istifadə edərək təmizlənməmiş PCR məhsullarının DNT-nin aşkarlanması üçün elektrokimyəvi aşkarlama üsulları üçün istifadə olunmamış dNTP-lər və primerlər tərəfindən təqdim edilən səhvləri daha yaxşı başa düşmək və reaksiya şəraitini və analiz protokollarını optimallaşdırmaq lazımdır. pH, temperatur və bioloji kimi əlavə fiziki-kimyəvi parametrlər Ölçmənin dəqiqliyini artırmaq üçün su nümunəsinin oksigen tələbatının (BOD) də ölçülməsinə ehtiyac ola bilər.
Sonda biz ətraf mühitin (göl suyu) nümunələrində virus aşkarlanması üçün ucuz elektrokimyəvi ENIG PCB sensoru təklif edirik. Həssaslığı qorumaq üçün kriogen saxlama tələb edən immobilizasiya edilmiş oliqonukleotid elektrodlardan və ya DNT-nin tədqiqi üçün xüsusi substratlardan fərqli olaraq,53,54 texnikamız dəyişdirilməmiş PCB istifadə edir. daha uzun raf ömrü olan və xüsusi saxlama tələbləri olmayan elektrodlar və buna görə də LMIC-lərdə yerləşdirilmiş avtomatlaşdırılmış nümunə emalı ilə ölçmə həllərinin inkişafı üçün uyğundur. Biosensor hədəf amplikonların sürətli aşkarlanması üçün ucuz DNT-interkalasiya edən redoks boyalardan (MB) istifadə edir. Qeyri-spesifik gücləndirmə Ətraf mühit nümunələrində ümumi olan, MB-lərin tək və ikiqat zəncirli oliqonukleotidlərə qeyri-spesifik bağlanması səbəbindən bu algılama metodunun spesifikliyini azaldır. Buna görə də, bu testin spesifikliyi primerlərin və PCR reaksiya şərtlərinin optimallaşdırılmasından asılıdır. Bundan əlavə, CV və sınaqdan keçirilmiş nümunələrdən əldə edilən DPV pik cərəyanları hər bir test üçün mənfi nəzarətdən (NTC) alınan cavablara nisbətən şərh edilməlidir. Bu işdə təqdim olunan elektrokimyəvi sensor dizaynları və metodları tam avtomatlaşdırılmış və aşağı səviyyəli bir nümunə hazırlamaq üçün avtomatik nümunə götürənlərlə inteqrasiya oluna bilər. -Nümunələri toplayıb təhlil edə bilən və nəticələri laboratoriyaya kabelsiz ötürə bilən xərc həlli.
Cashdollar, J. & Wymer, L. Su nümunələrindən virusların ilkin konsentrasiyası üsulları: son tədqiqatların icmalı və meta-analizi.J.Tətbiq.mikroorqanizm.115, s.1-11 (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL Su ilə yoluxan viruslar: Təhlükəsiz içməli suya maneələr. PLoS Pathogens.11, E1004867 (2015).
Shrestha, S. et al. Aşağı və orta gəlirli ölkələrdə COVID-19-un səmərəli genişmiqyaslı monitorinqi üçün çirkab su epidemiologiyası: problemlər və imkanlar.Water 13, 2897 (2021).
Palecek, E. & Bartosik, M. Nuclein acid electrochemistry.Chemical.Rev.112, 3427–3481 (2012).
Tani, A., Thomson, AJ & Butt, JN Metilen mavisi qızıl substratlarda immobilizasiya edilmiş tək və ikiqat telli oliqonukleotidlərin elektrokimyəvi diskriminatoru kimi. Analitik 126, 1756-1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ Comparison of Cation and Anion Intercalators for electrochemic Transduction of DNT Hybridization by Long Range Electron Transfer.Electrochemistry.comminicate.6, 648-654 (2004).
Wong, EL & Gooding, JJ DNT vasitəsilə yük transferi: seçici elektrokimyəvi DNT biosensor.anus.Chemical.78, 2138–2144 (2006).
Fang, TH et al. Paralel elektrokimyəvi aşkarlama ilə real vaxtda PCR mikrofluidik cihaz.bioloji sensor.Bioelektronika.24, 2131–2136 (2009).
Win, BY et al. Metilen mavisinin DNT ilə qarşılıqlı əlaqəsinə əsaslanan elektrokimyəvi real vaxt PCR sisteminin siqnal mexanizminin tədqiqi və performansının yoxlanılması. Analitik 136, 1573–1579 (2011).
Ramirez-Chavarria, RG et al. Tullantı su nümunələrində sars-cov-2-nin aşkarlanması üçün loop vasitəçiliyi ilə izotermik gücləndirmə əsaslı elektrokimyəvi sensor.J.Environment.Chemical.Britain.10, 107488 (2022).
Kumar, M. et al. SARS-CoV-2 amplikonlarının PCB elektrodları ilə elektrokimyəvi tədqiqi. Sensor aktivləşdirilib. B Chemistry.343, 130169 (2021).
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. & Yoshida, H. Tullantı suyunun bərk hissəsində SARS-CoV-2 RNT-nin effektiv aşkarlanması.science.general environment.763, 144587 (2021).
Alygizakis, N. et al. Tullantı sularında SARS-CoV-2 aşkarlanması üçün analitik metodlar: Protokol və Gələcək Perspektivlər. TraC trendli anal.Chemical.134, 116125 (2020).
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. & Kashtan, N. Şüşə səthlərə çökdürülmüş buxarlanmış tüpürcək damcılarında zərflənmiş Phi6 bakteriofaqının (SARS-CoV-2 üçün surroqat) sağ qalması.science.Rep.10, 1–10 (2020).
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ Sərbəst yaşayan amöbada SARS-CoV-2 surroqatının (Phi6) ekoloji davamlılığı.Su Sağlamlığı 20, 83 (2021).
Mindich, L. Cüt zəncirli RNT bakteriofajının üç genomik fraqmentinin dəqiq qablaşdırılması\(\varphi\)6.mikroorqanizm.Moore.biology.Rev.63, 149–160 (1999).
Pirttimaa, MJ & Bamford, DH RNT fagının ikincil strukturu \(varphi\)6 qablaşdırma bölgəsi.RNA 6, 880-889 (2000).
Bonilla, N. et al. Tap on the Phages – Bakteriofaqların laboratoriya ehtiyatlarının hazırlanması üçün sürətli və səmərəli protokol. PeerJ 4, e2261 (2016).
Göndərmə vaxtı: 27 may 2022-ci il