توفر الأمبليونات الأطول حساسية أفضل للاستشعار الكهروكيميائي للأحماض النووية الفيروسية في عينات المياه باستخدام أقطاب ثنائي الفينيل متعدد الكلور

نشكرك على زيارة Nature.com ، إصدار المتصفح الذي تستخدمه يحتوي على دعم محدود لـ CSS ، وللحصول على أفضل تجربة ، نوصيك باستخدام متصفح محدث (أو إيقاف تشغيل وضع التوافق في Internet Explorer) ، في غضون ذلك ، لضمان الدعم المستمر ، سنعرض الموقع بدون أنماط وجافا سكريبت.
تم تقدير أهمية مراقبة العينات البيئية بشكل كبير منذ بداية وباء COVID-19 ، ويتم تنفيذ بعض جهود المراقبة باستخدام المعيار الذهبي ، على الرغم من أن التقنيات القائمة على qPCR باهظة الثمن. حل لرصد عينات المياه البيئية في البلدان المنخفضة والمتوسطة الدخل. في هذا العمل ، نوضح الكشف الكهروكيميائي للأمبليكونات التي تم الحصول عليها من Phi6 phage المعزولة من عينات مياه البحيرة المسننة (بديل شائع لـ SARS-CoV-2) ، باستخدام ENIG لإكمال أقطاب ثنائي الفينيل متعدد الكلور دون تعديل السطح.تم تمييز استجابة المستشعر الكهروكيميائي بدقة لقطعتين من الحمض النووي بأطوال مختلفة (\ ({117} \ ، \ hbox {bp} \) و \ ({503} \ ، \ hbox {bp} \)) ، و تأثير الأملاح في الخلطات الرئيسية لـ PCR على تفاعلات الميثيلين الأزرق (MB) مع الحمض النووي. أظهرت نتائجنا أن طول شظايا الحمض النووي تحدد بشكل كبير الحساسية الكهروكيميائية وتوضح في هذا العمل أن القدرة على اكتشاف الأمبليكونات الطويلة دون تنقية هلام لمنتجات PCR هي مهم للقياس في الموقع لعينات المياه.حل مؤتمت بالكامل للحمل الفيروسي يبشر بالخير.
يُعرف انتقال الفيروس الذي تنتقل عن طريق المياه بأنه خطر على الصحة العامة منذ الأربعينيات ، مع ظهور أول دليل على انتقال الماء لشلل الأطفال والتهاب الكبد E1 ، وقد صنفت منظمة الصحة العالمية (WHO) العديد من مسببات الأمراض الفيروسية المنقولة بالمياه ذات الأهمية الصحية المتوسطة إلى العالية. تعتمد طرق الكشف على التقنيات المعتمدة على المعيار الذهبي qPCR ، والتي تتسم بحساسية عالية ومحددة ، ولكنها تتطلب موظفين مهرة للاختبار في المختبر باستخدام أدوات باهظة الثمن. ومع ذلك ، في البلدان المنخفضة والمتوسطة الدخل (LMICs) ذات الموارد المحدودة ، من المرجح أن يكون لاختبار العينة الأسبقية على مراقبة عينات المياه البيئية ، لذلك ، هناك حاجة إلى طرق بديلة منخفضة التكلفة للرصد المستدام في الوقت الحقيقي لعينات المياه ومياه الصرف الصحي في البلدان المنخفضة والمتوسطة الدخل كتحذير مبكر لتفشي الأمراض الناشئة ، وبالتالي حمايتهم من الآثار الاجتماعية والاقتصادية الشديدة لوباء الفيروس. يمكن أن توفر أجهزة الاستشعار الحيوية الكهروكيميائية منخفضة التكلفة للأحماض النووية حلاً محتملاً واعدًا لهذه الحاجة غير الملباة ، وتعمل العديد من أجهزة الاستشعار الحيوية للحمض النووي من خلال حقيقة أن خيوط الحمض النووي التكميلية مثبتة على القطب الكهربي السطح والتهجين عند وجود تسلسل مطابق في العينة ، ويمكن تحويل هذا بعد ذلك إلى إشارة من خلال تقنيات كهروكيميائية مختلفة باستخدام وسطاء الأكسدة والاختزال مثل حديد البوتاسيوم / فيروسيانيد. الميثيلين الأزرق (MB) هو أحد هذه الجزيئات النشطة للأكسدة تم الإبلاغ عن تقطيعها إلى DNA مزدوج الشريطة (dsDNA) بالإضافة إلى ارتباطها غير المحدد بالحمض النووي أحادي السلسلة. تكوينات المستشعر 5،6،7،8،9 على الرغم من أن إقحام MB إلى DNA غير محدد ، وتعتمد خصوصية هذا المستشعر الكهروكيميائي إلى حد كبير على نقاء المواد الأولية المستخدمة في PCR أو التضخيم متساوي الحرارة ، إلا أنه مناسب تمامًا لتطبيق حقيقي. -وقت qPCR القائم على الكهروكيميائية أو تضخيم متساوي الحرارة الفلورية كبديل لقياس تركيز الحمض النووي .9 في أحد هذه التطبيقات ، تم تعديل سطح الأقطاب الكهربائية الذهبية باستخدام 6-مركابتو -1-هيكسانول (MCH) في الوقت الحقيقي قياس أمبليكونات PCR باستخدام MB باستخدام مقياس الجهد التفاضلي (DPV) .9 في حالات أخرى ، اكتشف راميريز وآخرون SARS-CoV-2 في مياه الصرف الصحي عن طريق تفاعل RT-LAMP باستخدام MB مع أقطاب مطبوعة على الشاشة. تستخدم كأقطاب كهربائية في الموقع في منصة PCR ميكروفلويديك مصممة للكشف الكهروكيميائي عن الأمبليكون أثناء التفاعلات 8 تتطلب جميع هذه الدراسات تعديل سطح الأقطاب الكهربائية ، مما يعني زيادة تكاليف الإنتاج والتشغيل بسبب متطلبات التخزين الخاصة لاستقرار هذه الأقطاب الكهربائية الوظيفية.
رسم تخطيطي لسير العمل للكشف الكهروكيميائي عن الأمبليكون المأخوذة من الجزيئات الفيروسية المركزة في عينات مياه البحيرة.
لقد أظهرنا مؤخرًا الاستشعار الكهروكيميائي لأمبليكونات SARS-CoV-2 مع أقطاب لوحة الدوائر المطبوعة منخفضة التكلفة (PCB) استنادًا إلى DPV وقياس الجهد الدوري (CV) الناجم عن امتزاز معقدات MB-DNA على سطح الأقطاب الكهربائية غير المعدلة) التغييرات في الذروة الحالي 11.أبلغنا أن شظايا الحمض النووي الأطول (N1-N2 ، \ ({943} \ ، \ hbox) التي تم تشكيلها باستخدام الاشعال الأمامي N1 الموصى به من قبل CDC و N2 العكسي مقارنةً بالأجزاء الأقصر {bp} \)) أظهرت خطيًا أفضل في استجابة المستشعر (N1، \ (72 \، \ hbox {bp} \)) تم تشكيلها باستخدام مجموعات التمهيدي N1 forward و N1 العكسي. تم الإبلاغ عن هذه الدراسات باستخدام تخفيفات الحمض النووي المحضرة في الماء الخالي من نوكلياز ، كما تم استخدام المنصة للكشف عن SARS-CoV -2 أمبليكون في عينات مياه الصرف المحاكية (تم الحصول عليها عن طريق ضخ عينات RNA الإجمالية باستخدام SARS-CoV-2 RNA). نظرًا لأن الحمض النووي الريبي عرضة للقص أثناء العزل والمعالجة النهائية ، فمن الصعب تضخيم الأجزاء الأطول باستخدام هذه العينة غير المتجانسة. لذلك ، فإن عرض الاستشعار الكهروكيميائي لأمبليكون SARS-CoV-2 في مياه الصرف يقتصر على جزء N1 الأقصر \ (72 \، \ hbox {bp} \).
في هذا العمل ، قمنا بالتحقيق في جدوى الاستشعار الكهروكيميائي المستند إلى ENIG ثنائي الفينيل متعدد الكلور لعثة Phi6 المركزة والمعزولة من عينات مياه البحيرة (الشكل 1). يحتوي أيضًا على غشاء دهني وبروتين سبايك. PCR للحصول على جزأين من الحمض النووي من 117 و 503 زوجًا أساسيًا في الطول. نظرًا للتحدي المتمثل في تضخيم شظايا \ (943 \، \ hbox {bp} \) N1-N2 في عملنا السابق ، فإننا نستهدف شظايا متوسطة الطول (\ (117 \، \ hbox {bp} \) و \ (503 \، \ hbox {bp} \)) ، بناءً على البادئات المتاحة. تمت دراسة استجابة المستشعر الكهروكيميائي بشكل منهجي عبر نطاق تركيز واسع (\ ({10} \ ، { \ hbox {pg} / {\ upmu \ hbox {l}}} \) إلى \ ({20} \ ، {\ hbox {ng} / {\ upmu \ hbox {l}}} \)) لكلا الجزأين في بوجود بروميد الميثيل ، تم تمييز تأثير الملح على استجابة المستشعر والتحقق من صحته من خلال القياسات الطيفية ، والمساهمات الرئيسية لهذا العمل هي كما يلي:
يؤثر طول جزء الحمض النووي ووجود الملح في العينة بشدة على الحساسية.تظهر نتائجنا أن النشاط الكهروكيميائي يعتمد على آليات مختلفة لتفاعل MB و DNA والمستشعر في استجابة الفولتميتر ، اعتمادًا على تركيز الحمض النووي وطوله ، مع ظهور الأجزاء الأطول حساسية أعلى ، على الرغم من أن الملح له تأثير سلبي على التفاعلات الكهروستاتيكية بين ميغابايت والحمض النووي.
يحدد تركيز الحمض النووي آلية تفاعل MB-DNA في أقطاب كهربائية غير معدلة ، ونوضح أن الآليات المختلفة لتفاعل MB-DNA تعتمد على تركيز الحمض النووي. عند تركيزات الحمض النووي أقل من كمية صغيرة من \ ({\ hbox {ng} / {\ upmu \ hbox {l}}} \) ، لاحظنا أن الاستجابة الحالية الكهروكيميائية تم تحديدها بشكل أساسي عن طريق امتزاز MB-DNA على القطب الكهربائي ، بينما عند تركيزات منخفضة من الحمض النووي ، تم تحديد استجابة التيار الكهروكيميائي عن طريق تثبيط ستيري للأكسدة بسبب إدخال MB بين أزواج قواعد الحمض النووي.
الاستشعار الكهروكيميائي المستند إلى ثنائي الفينيل متعدد الكلور ENIG للأحماض النووية الفيروسية في عينات مياه البحيرة تم التحقق من صحة الملاحظات عن طريق الكشف الكهروكيميائي عن شظايا الحمض النووي المضافة من Phi6 \ (503 \، \ hbox {bp} \) التي تم الحصول عليها من عينات المياه من بحيرة بواي ، حرم IIT في مومباي نتيجة فج.
تكلفة منخفضة للتنفيذ وإمكانية الاندماج في أنظمة المراقبة المؤتمتة بالكامل أو قليل النوكليوتيدات أو الأبتاميرات على أقطاب كهربائية ذات عمر تخزين أطول.
Phage Phi6 هو فيروس dsRNA مغلف من عائلة Cytoviridae يصيب Pseudomonas syringae. يوجد جينوم Phi6 في شكل 3 أجزاء: S (\ (2.95 \، \ hbox {Kb} \)) ، M (\ (4.07) \، \ hbox {Kb} \)) و L (\ (6.37 \، \ hbox {Kb} \)) 16،17. نظرًا لأن العاثية Phi6 تصيب سلالة BSL-1 Pseudomonas غير المسببة للأمراض ، فهي آمنة للاستخدام ويمكن زراعتها بسهولة في المختبر. تم شراء Phage Phi6 ومضيفه Pseudomonas syringae من مركز Felix d'Herelle المرجعي للفيروسات البكتيرية ، جامعة لافال ، كندا (أرقام كتالوج المركز المرجعي هي HER-102 و HER-1102 ، على التوالي) تم إحياء Phi6 ومضيفه وفقًا لتوجيهات المركز المرجعي. تمت تنقية Phage Phi6 بواسطة تحلل اللوح والشطف للحصول على التتر النهائي مع \ (\ about 10 ^ {12} \، {\ hbox {PFU} / \ hbox { ml}} \) (وحدات تشكيل البلاك / مليلتر). تم عزل الحمض النووي الريبي من جزيئات الملتهمة المنقاة باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي الريبي الكلي GenElute ™ (Sigma-Aldrich) وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. تم فصل 100} \، {{\ upmu \ hbox {l}}} \) وتم تحميل المحللة على عمود الدوران للسماح للحمض النووي الريبي بالارتباط بعمود الراتينج. ثم يتم فصل الحمض النووي الريبي في محلول الشطف \ ({ 50} \، {{\ upmu \ hbox {l}}} \) التي توفرها المجموعة. تقدير تركيز الحمض النووي الريبي عن طريق الامتصاصية عند \ (260 \، \ hbox {nm} \). تم تخزين الحمض النووي الريبي في أجزاء صغيرة في \ ({-80} \، {^ {\ circ} \ hbox {C}} \) حتى استخدام آخر. \ ({2} \، {\ upmu \ hbox {g}} \) مجموعة iScript cDNA Synthesis Kit (Bio -Rad Laboratories) كنموذج لتوليف cDNA باتباع إرشادات الشركة المصنعة. باختصار ، يتكون تفاعل توليف cDNA من 3 خطوات: التحضير في \ ({25} \ ، {^ {\ circ} \ hbox {C}} \ ) \ ({5} \ ، {\ hbox {min}} \) ، النسخ العكسي لـ \ ({20} \ ، {\ hbox {min}} \) في \ ({46} \ ، {^ {\ circ } \ hbox {C}} \) ، والعكس المسجل موجود في \ ({95} \ ، {^ {\ circ} \ hbox {C}} \) من أجل \ ({1} \ ، {\ hbox {min }} \) عند تشغيله على هلام الاغاروز 1٪ ، أظهر (كدنا) ثلاثة نطاقات تقابل الأجزاء الثلاثة المتوقعة من الحمض النووي الريبي (البيانات غير معروضة). تم استخدام البادئات التالية لتضخيم جزأين من الحمض النووي بطول 117 و 503 نقطة أساس ، باستخدام (كدنا) كقالب لـ PCR في جهاز تدوير حراري miniPCR® mini8:
تتوافق البادئات \ (117 \، \ hbox {bp} \) و \ (503 \، \ hbox {bp} \) مع 1476-1575 نيوكليوتيدات المقطع M و 458-943 نيوكليوتيدات المقطع L ، على التوالي تم فصل جميع منتجات PCR المضخمة على 1 ٪ من المواد الهلامية agarose ، وتمت تنقية الحمض النووي المستهدف باستخدام مجموعة GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Fisher Scientific).
تم استخدام بحيرة في حرم IIT في مومباي (بحيرة بواي ، بواي ، مومباي) لإضافة جزيئات الملتهمة. تمت تصفية مياه البحيرة من خلال غشاء \ ({5} \ ، {\ upmu \ hbox {m}} \) لإزالته الجسيمات المعلقة ، ثم تمت إضافة Phi6 phage. أضف \ ({1} \ ، {\ hbox {ml}} \) من \ (10 ​​^ {6} \ ، {\ hbox {PFU} / \ hbox {ml}} \) إلى \ ({100} \ ، {\ hbox {ml}} \) مياه البحيرة المفلترة ، في \ ({4} \ ، {^ {\ دائرة} \ hbox {C}} \). قسمة صغيرة كانت مخصصة لقياس الحمل الفيروسي عن طريق فحص البلاك. اختبرنا طريقتين مختلفتين لتركيز جزيئات فيروس Phi6 المسننة: (1) طريقة ترسيب-امتزاز هيدروكسيد الألومنيوم ، 19 والتي تم التحقق من صحتها لتركيز العديد من فيروسات الحمض النووي الريبي المغلفة من العينات البيئية ، و (2) تم تكييف طريقة تركيز الفيروس المعتمد على البولي إيثيلين جلايكول (PEG) من Flood et al.20 - نظرًا لأن كفاءة الاسترداد للطريقة المعتمدة على PEG أفضل من طريقة هيدروكسيد الألومنيوم ، فقد تم استخدام الطريقة المعتمدة على PEG لتركيز جسيمات Phi6 من عينات مياه البحيرة.
كانت طريقة PEG المستخدمة كما يلي: تمت إضافة PEG 8000 و \ (\ hbox {NaCl} \) إلى عينات مياه بحيرة Phi6-spiked للحصول على 8٪ PEG 8000 و \ (0.2 \، \ hbox {M} \) \ ( \ hbox {NaCl} \). تم تحضين العينات على شاكر \ ({4} \، {^ {\ circ} \ hbox {C}} \) \ ({4} \، {\ hbox {h}} \ ) ، ثم طرد مركزيًا في \ (4700 \، \ hbox {g} \) هو \ ({45} \، {\ hbox {min}} \). تجاهل المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في \ ({1} \، {\ hbox {ml}} \) في نفس المادة الطافية. تم إجراء جميع تجارب الرفع وتركيز الفيروس في ثلاث نسخ. بعد التركيز ، تم حجز قسمة صغيرة لقياس كفاءة الاسترداد عن طريق فحص البلاك. تم عزل الحمض النووي الريبي كما هو موضح سابقًا والتصفية في المخزن المؤقت للشطف الذي توفره المجموعة \ ({40} \، {\ upmu \ hbox {l}} \). نظرًا لأن تركيز الحمض النووي الريبي سيختلف من عينة إلى عينة في ثلاث نسخ ، فإن \ ({2} \، {\ upmu \ hbox {l}} \) من الحمض النووي الريبي يستخدم لجميع الثلاثة بغض النظر عن تركيزه ، تم إجراء توليف cDNA للعينات. تم استخدامه كنموذج لـ \ ({20} \، {\ upmu \ hbox {l}} \) PCR لمدة 35 دورة لتضخيم \ (117 \، \ hbox {bp} \) و \ (503 \، \ hbox { bp} \). يتم تمثيل هذه العينات على أنها "1: 1" ، أي بدون تخفيف. كقالب للتحكم الإيجابي (PC) تم إجراء PCR الكمي (qPCR) في أداة Stratagene Mx3000P RT-PCR باستخدام Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies). تم تسجيل عتبة الدورة (Ct) لجميع العينات. بالإضافة إلى ذلك ، كانت العينات المخففة \ ({1} \ ، {\ upmu \ hbox {l}} \) باستخدام cDNA المخفف 1: 100 في مياه البحيرة المفلترة مثل \ ({20} \، {\ upmu \ hbox {l}} \) PCR لـ 35 دورة. يتم تمثيل هذه العينات كـ "1: 100 ″.
يتم تصنيع أقطاب ثنائي الفينيل متعدد الكلور باستخدام عملية منخفضة التكلفة ومتوفرة تجارياً بالنيكل الغمر بالنيكل (ENIG) دون الحاجة إلى طلاء إضافي بالذهب. لا يُنصح باستخدام محلول سمكة البيرانا أو قياس الفولتميتر الدوري لحمض الكبريتيك لأنها قد تتسبب في تقشير الطبقة الذهبية الرقيقة (سمك \ (\ تقريبًا \) \ (100 \ ، \ مربع {nm} \)) وكشف الطبقات النحاسية الأساسية المعرضة للتآكل 21 ، 22 ، 23 ، 24 ، 25 ، لذلك نظف الأقطاب بقطعة قماش خالية من النسالة مبللة بـ IPA ، واحتضنت العينة المراد اختبارها بـ \ ({50} \ ، {\ upmu \ hbox {M} } \) ميغابايت في \ ({4} \، {^ {\ circ} \ hbox {C}} \) \ ({1} \، {\ hbox {h}} \) لسهولة الإدراج. في عملنا السابق ، لاحظنا أنه تم تحسين حساسية وخطية المستشعر عن طريق زيادة تركيز MB 11. واستنادًا إلى التحسينات التي تم الإبلاغ عنها في عملنا السابق ، استخدمنا \ ({50} \ ، {\ upmu \ hbox {M}} \) ميغابايت تركيزات لتضمين الحمض النووي في هذه الدراسة. يمكن تحقيق الكشف الكهروكيميائي للحمض النووي مزدوج الشريطة (ds-DNA) باستخدام مقسمات أنيونية أو كاتيونية. على الرغم من أن المقسمات الأنيونية تكتشف الحمض النووي مع انتقائية أفضل ، إلا أنها تتطلب حضانة بين عشية وضحاها ، مما يؤدي إلى أوقات اكتشاف أطول. من ناحية أخرى ، تتطلب أدوات الإقحام الموجبة مثل MB أوقات حضانة أقصر ، تقريبًا \ ({1} \ ، {\ hbox {h}} \) للكشف الكهروكيميائي عن ds-DNA. يتضمن كل قياس صرف العينة المراد اختبارها على قطب كهربائي \ ({5} \ ، {{\ upmu \ hbox {l}}} \) ، ثم التنظيف بقطعة قماش مبللة بـ IPA ، قبل متابعة عينة أخرى.قياس واحد تم اختبار كل عينة على 5 أقطاب كهربائية مختلفة ما لم يذكر خلاف ذلك ، تم إجراء قياسات DPV و CV باستخدام جهاز PalmSens Sensit Smart potentiostat ، وتم استخدام برنامج PSTrace لتكوين potentiostat والحصول على البيانات ، بما في ذلك حسابات الذروة الحالية. لقياسات DPV و CV:
DPV: وقت التوازن = \ (8 \، \ hbox {s} \) ، خطوة الجهد = \ (3 \ ، \ hbox {mV} \) ، جهد النبض = \ (25 \ ، \ hbox {mV} \) ، مدة النبضة = \ (50 \، \ hbox {ms} \)، معدل المسح = \ ({20} \، \ hbox {mV / s} \)
السيرة الذاتية: Equilibrium Time = \ (8 \، \ hbox {s} \)، Voltage Step = \ (3 \، \ hbox {mV} \) ، معدل الاجتياح = \ ({300} \، \ hbox {mV / s } \)
تم الحصول على تيارات الذروة من الفولتاموجرامس للحمض النووي المركب مع \ ({50} \، {\ upmu \ hbox {M}} \) MB: (a) \ (503 \، \ hbox {bp} \) DPV، (b) \ (503 \، \ hbox {bp} \) السيرة الذاتية، (c) \ (117 \، \ hbox {bp} \) DPV، (d) \ (117 \، \ hbox {bp} \) السيرة الذاتية.
تم الحصول على صور فولتاموجرام DPV و CV على أقطاب ENIG PCB \ ({50} \، {\ upmu \ hbox {M}} \) ميغا بايت معقد مع DNA (بتركيزات 10 - \ ({20} \، {\ hbox {ng } / {\ upmu \ hbox {l}}} \) مثل 0.13 - \ ({0.26} \ ، {\ upmu \ hbox {M}} \) لـ \ (117 \ ، \ hbox {bp} \) و 0.03 - \ ({0.06} \، {\ upmu \ hbox {M}} \) لـ \ (503 \، \ hbox {bp} \)). يظهر الفولتموجرام التمثيلي في الشكل S1 في المعلومات التكميلية ، ويظهر الشكل 2 النتائج قياسات DPV و CV (تيار الذروة) باستخدام منتجات PCR المنقى بالهلام. بالمقارنة مع قياسات السيرة الذاتية ، تُظهر قياسات DPV حساسية أعلى (التيار كدالة لتركيز الحمض النووي) لأن التيارات السعوية الخلفية في قياسات السيرة الذاتية تخفي تيارات فاراديك. لكل صندوق في boxplot يحتوي على قياسات من 5 أقطاب كهربائية. تستخدم جميع القياسات نفس مجموعة الأقطاب الكهربائية لتجنب أخطاء القياس بسبب اختلاف القطب إلى القطب ، لاحظنا اتجاهًا متزايدًا في تيارات الذروة المقاسة DPV و CV لتركيزات منخفضة من الحمض النووي ، أطول (\ (503 \، \ hbox {bp} \)) \، \ hbox {bp} \ مقارنة بجزء \ (117)) ، وهذا يتوافق مع الاتجاه المتوقع لامتصاص القطب الذي تم الإبلاغ عنه في عملنا السابق. يسهل امتزاز مجمع MB-DNA نقل الشحنة على القطب ، مما يساهم في زيادة ذروة التيار. أظهرت دراسات أخرى تأثير حجم وتسلسل قليل النوكليوتيد على إقحام MB-DNA. -محتوى السيتوزين (GC) من الأمبليكونين (\ (117 \، \ hbox {bp} \) و \ (503 \، \ hbox {bp} \)) كان حوالي 50٪ ، مما يشير إلى أن الملاحظة مستحقة إلى طول amplicon. ومع ذلك ، بالنسبة لتركيزات الحمض النووي الأعلى (\ (> {2} \ ، {\ hbox {ng} / {\ upmu \ hbox {l}}} \) ، لـ \ (503 \، \ hbox {bp} \) و \ (> {10} \ ، {\ hbox {ng} / {\ upmu \ hbox {l}}} \) لـ \ (117 \، \ hbox {bp} \)) ، نلاحظ تضخيمين يتم تقليل التيارات الذروية للغواصات في كل من قياسات DPV و CV وهذا لأن MB يشبع ويقحم بين أزواج القاعدة من الحمض النووي ، مما يؤدي إلى تثبيط فاصل لنشاط الأكسدة والاختزال للمجموعة القابلة للاختزال في MB.
在 存在 \ (2 \، \ hbox {mM} \) \ ({\ hbox {MgCl} _2} \): (a) \ (503 \، \ hbox {bp} \) DPV، (b) \ (503 \، \ hbox {bp} \) السيرة الذاتية ، (c) \ (117 \، \ hbox {bp} \) DPV ， (d) \ (117 \، \ hbox {bp} \) السيرة الذاتية。
تتداخل الأملاح الموجودة في الخلطات الرئيسية لـ PCR مع التفاعلات الكهروستاتيكية بين ميغابايت والحمض النووي ، لذلك عن طريق إضافة \ (2 \، \ hbox {mM} \) \ (\ hbox {MgCl} _2 \) مع \ ({50} \، {\ upmu \ hbox {M}} \) ميغابايت من المنتج المنقى بالهلام لدراسة تأثير الملح على تفاعل MB-DNA. كما هو موضح في الشكل 3 ، لاحظنا أنه بالنسبة لتركيزات الحمض النووي الأعلى (\ (> {2} \، {\ hbox {ng} / {\ upmu \ hbox {l}}} \) (503 \، \ hbox {bp} \) و \ (> {10} \ ، {\ hbox {ng} / {\ upmu \ hbox { l}}} \) لـ \ (117 \، \ hbox {bp} \)) ، في DPV و CV لم تؤثر إضافة الملح بشكل كبير على القياسات (انظر الشكل S2 في المعلومات التكميلية لفولتموجرام تمثيلي). انخفاض تركيزات الحمض النووي ، إضافة الملح يقلل بشكل كبير من الحساسية ، مما يؤدي إلى عدم حدوث تغيير كبير في التيار مع تركيز الحمض النووي. تم الإبلاغ سابقًا عن تأثيرات سلبية مماثلة للملح على تفاعلات MB-DNA والاقحام من قبل باحثين آخرين. Mg} ^ {2 +} \) ترتبط الكاتيونات بالعمود الفقري للفوسفات السالب للحمض النووي ، مما يعيق التفاعل الكهروستاتيكي بين MB والحمض النووي. في حالة التركيزات العالية للحمض النووي ، ينتج عن التثبيط الجامد لـ MBs النشطة في الأكسدة والاختزال تيارات ذروة منخفضة ، لذا فإن التفاعلات الكهروستاتيكية لا تؤثر بشكل كبير على استجابة المستشعر. النقطة الأساسية هي أن هذا المستشعر الحيوي هو الأنسب للكشف عن تركيزات أعلى من الحمض النووي (نادرًا \ ({\ hbox {ng} / {\ upmu \ hbox {l}}} \) أو أعلى) ، للمعالجة الآلية الكاملة لعينات المياه البيئية ، حيث قد لا تكون تنقية الهلام لمنتجات PCR ممكنة.
المنطقة الواقعة تحت منحنى الامتصاص لنطاق الطول الموجي 600-700 \ (\ hbox {nm} \) لتركيزات مختلفة من الحمض النووي المركب بـ \ ({50} \، {\ upmu \ hbox {M}} \) ميغا بايت: (a ) \ (503 \، \ hbox {bp} \) مع الملح وبدونه (\ (2 \، \ hbox {mM} \) \ (\ hbox {MgCl} _2 \))، (b) \ (117 \، \ hbox {bp} \) مع الملح وبدونه (\ (2 \، \ hbox {mM} \) \ (\ hbox {MgCl} _2 \)). \ ({0} \، {\ hbox {pg} / {\ upmu \ hbox {l}}} \) تراكيز الحمض النووي المقابلة لـ \ ({50} \، {\ upmu \ hbox {M}} \) ميغابايت عينات بدون DNA.
لمزيد من التحقق من النتائج المذكورة أعلاه ، أجرينا قياسات بصرية باستخدام مقياس الطيف الضوئي UV / Vis (Thermo Scientific Multiskan GO) ، تم استخدام العينات \ ({50} \ ، {{\ upmu \ hbox {l}}} \) لكل منها القياس: يتناقص توقيع الامتصاص مع زيادة تركيز الحمض النووي ، كما يتضح من اتجاه المنطقة الواقعة أسفل منحنى الامتصاص لنطاق الطول الموجي \ (600 \، \ hbox {nm} \) إلى \ (700 \، \ hbox { nm} \) ، كما هو مبين في الشكل 4 (طيف الامتصاص الموضح في الشكل S3 في المعلومات التكميلية). بالنسبة للعينات ذات تركيزات الحمض النووي أقل من \ ({1} \ ، {\ hbox {ng} / {\ upmu \ hbox {l}}} \) ، لم يكن هناك فرق كبير في الامتصاص بين العينات المحتوية على DNA وعينات MB فقط (لـ \ (503 \، \ hbox {bp} \) و \ (117 \، \ hbox {bp} \) ) شظايا الطول) ، مما يشير إلى عدم وجود تثبيط ستيري لـ MB النشط الأكسدة. في تركيزات أعلى من الحمض النووي ، لاحظنا انخفاضًا تدريجيًا في إشارة الامتصاص ولاحظنا انخفاضًا أقل في الامتصاص في وجود الملح ، وتعزى هذه النتائج إلى الجزيئية التفاعلات والتثبيط الفاصل مع التراص الأساسي في هجينة الحمض النووي. تتوافق نتائجنا مع التقارير الواردة في الأدبيات المتعلقة بالدراسات الطيفية لإقحام MB-DNA التي تربط بين نقص اللون ومستويات الطاقة المنخفضة في \ (\ pi \) - \ (\ pi ^ * \ ) التحولات الإلكترونية بسبب طبقات الإقحام 36 ، 37 ، 38.
Agarose gel electrophoresis of phage Phi6: منتجات PCR ذات الطول \ (117 \، \ hbox {bp} \) و \ (503 \، \ hbox {bp} \) من عينات مياه البحيرة.NTC-no-template control ، بادئات تحتوي على أمبليكونات مقابلة ؛التحكم الإيجابي للكمبيوتر الشخصي ؛1 ، 2 ، 3 - عينات مياه بحيرة مسننة غير مخففة (1: 1) في ثلاث نسخ. يكون الشريط مرئيًا في \ (\ about 50 \، \ hbox {bp} \) بسبب قليل النيوكليوتيدات غير المستخدمة في \ (503 \، \ hbox {bp} \).
قمنا بتقييم فائدة المستشعر باستخدام عينات مياه بحيرة بواي التي ارتفعت مع Phi6 phage. تراوحت تركيزات الحمض النووي الريبي المعزولة من عينات المياه ذات الفتحات الملوثة من 15.8 - \ ({19.4} \، {\ upmu \ hbox {g} / \ hbox { ml}} \) ، بينما تلك المعزولة من معلقات الملتهمة المنقاة ، تم تقدير الحمض النووي الريبي ليكون \ ({1945} \ ، {\ upmu \ hbox {g} / \ hbox {ml}} \) بكفاءة استرداد تقارب 1 تم نسخ عكسي للحمض النووي الريبي في (كدنا) واستخدامه كقالب لـ PCR و qPCR. تم تأكيد حجم المنتج بواسطة الرحلان الكهربائي للهلام agarose (الشكل 5) قبل الاختبار باستخدام المستشعر. بالإضافة إلى الأمبليكونات ذات الأهمية. تم إظهار قيم Ct المسجلة خلال qPCR (الجدول 1) لترتبط بتركيز الحمض النووي الريبي المعزول من عينات المياه المسننة المقابلة. تكشف قيمة Ct عن عدد الدورات المطلوبة لإشارة الفلورسنت إلى تتجاوز العتبة أو إشارة الخلفية. تشير قيم Ct الأعلى إلى تركيزات أقل للقالب والعكس صحيح ، وكانت قيم Ct لعينات NTC عالية كما هو متوقع ، والفرق في \ (\ حوالي 3 \) قيم Ct بين يشير كل من التحكم الإيجابي وعينة الاختبار أيضًا إلى أن كل عينة اختبار تحتوي على نموذج بنسبة 1 ٪ تقريبًا مقارنةً بالتحكم الإيجابي. لقد ناقشنا سابقًا أن الأمبليكونات الأطول تؤدي إلى حساسية أفضل. يعد تضخيم الأجزاء الأطول المعزولة من العينات البيئية غير المتجانسة أمرًا صعبًا نظرًا للعيوب من انخفاض التركيز الفيروسي وتدهور الحمض النووي الريبي. ومع ذلك ، من خلال إثراء الفيروسات وبروتوكول تضخيم PCR ، تمكنا من تضخيم جزء \ (503 \، \ hbox {bp} \) بنجاح للاستشعار الكهروكيميائي.
يوضح الشكل 6 نتائج المستشعر الكهروكيميائي لجزء amplicon \ (503 \، \ hbox {bp} \) ، كلاهما باستخدام cDNA غير المخفف كقالب (1: 1) و 100 ضعف cDNA المخفف كقالب (1: 100) تم تنفيذ PCR ، مقارنةً بـ NTC والكمبيوتر الشخصي (انظر الشكل S4 في المعلومات التكميلية للحصول على مخططات الفولتموجرام التمثيلية) ، يحتوي كل صندوق في مخطط الصندوق في الشكل 6 على قياسات من ثلاث عينات في 5 أقطاب كهربائية ، وقد تم استخدام نفس الأقطاب لقياس جميع العينات لتجنب الأخطاء بسبب القطب الكهربائي. - اختلاف إلى قطب كهربائي: بالمقارنة مع قياسات السيرة الذاتية ، تُظهر قياسات DPV دقة أفضل للتمييز بين عينات الاختبار والكمبيوتر الشخصي من NTCs لأنه ، كما ذكرنا سابقًا ، يتم إخفاء تيارات Faradaic بسبب التيارات السعوية الخلفية في الأخير. أدى التحكم السلبي (NTC) إلى ارتفاع تيارات ذروة CV و DPV بالنسبة إلى التحكم الإيجابي ، بينما أظهرت عينات الاختبار الإيجابية وغير المخففة ارتفاعات ذروة مماثلة لتيارات ذروة DPV. ) يمكن حل عينة الاختبار والكمبيوتر الشخصي بوضوح من إخراج المستشعر لعينة NTC ، في حين أن دقة العينة المخففة 1: 100 تكون أقل وضوحًا. (الممرات غير معروضة في الشكل 5) ، وكانت تيارات ذروة DPV و CV المقابلة مماثلة لتلك المتوقعة لـ NTC. تظهر نتائج الجزء \ (117 \، \ hbox {bp} \) في المعلومات التكميلية. تسبب التحكم في استجابة كهروكيميائية من مستشعر ثنائي الفينيل متعدد الكلور بسبب امتزاز MB الحر على القطب وتفاعل MB مع أوليغنوكليوتيد التمهيدي أحادي السلسلة ، لذلك في كل مرة يتم فيها اختبار عينة ، يجب تشغيل عنصر تحكم سلبي و تيار الذروة لعينة الاختبار مقارنة بتيار الذروة الذي تم الحصول عليه بواسطة التحكم السلبي لتحقيق قياس تفاضلي (نسبي) لتصنيف عينة الاختبار على أنها إيجابية أو سلبية.
(أ) DPV ، و (ب) تيار ذروة السيرة الذاتية للكشف الكهروكيميائي عن شظايا \ (503 \، \ hbox {bp} \) في عينات مياه البحيرة. تم قياس عينات الاختبار في ثلاث نسخ ومقارنتها بعدم وجود عناصر تحكم قالب (NTC) و الضوابط الإيجابية (PC).
توضح النتائج التي توصلنا إليها الآليات المختلفة التي تؤثر على أداء المستشعرات الكهروكيميائية للأمبليكونات ذات الأطوال المختلفة للحمض النووي المختلف ، مع التحقق من التركيزات عن طريق القياسات الضوئية باستخدام مقياس الطيف الضوئي UV / Vis. \ (500 \، \ hbox {bp} \) يمكن الكشف عنها بحساسية أعلى وأن وجود الملح في العينة لا يسبب حساسية لتركيز الحمض النووي الذي يؤثر على الحساسية العالية (نادرًا \ ({\ hbox {ng} / {\ upmu \ hbox {l}}} \) وما فوق). بالإضافة إلى ذلك ، قمنا بفحص تأثير أنواع مختلفة من العينات ، بما في ذلك الأمبليكون المنقى بالهلام مع وبدون ملح مضاف ، وإضافة عينات من مياه البحيرة في قياسات DPV و CV.لاحظنا أن DPV قدمت دقة أفضل ، لأن التيار السعوي في الخلفية يؤثر أيضًا على قياس السيرة الذاتية ، مما يجعله أقل حساسية.
يعتمد تضخيم الأجزاء الأطول على سلامة الحمض النووي الريبي الجينومي الفيروسي ، وقد أظهرت العديد من الدراسات أن تضخيم الأجزاء الأطول ليس فعالًا دائمًا بسبب تدهور الحمض النووي الريبي في البيئة وإمكانية التضفير أثناء العزلة. لاحظنا أن طريقة تركيز الفيروس المعتمد على PEG كانت أكثر فاعلية في تركيز الملتهمة Phi-6 في عينات مياه البحيرة مقارنة بطريقة تركيز الفيروس المعتمد على هيدروكسيد الألومنيوم ، وقد أثبتت القدرة على اكتشاف شظايا الحمض النووي الطويلة أنها تغلبت على متطلبات مضاعفة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). لتضخيم قوالب متعددة أقصر طولًا وتقليل احتمالية التحديد التبادلي.
العينات البيولوجية نادرة ، لذلك هناك حاجة لتصميم مستشعر حيوي يتطلب أقل عدد ممكن من العينات للاختبار. تتطلب أقطاب ENIG PCB المستخدمة في هذه الدراسة فقط \ ({5} \، {{\ upmu \ hbox {l}}} \ ) عينات للاختبار لتغطية المنطقة الفعالة من الأقطاب الكهربائية ، بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إعادة استخدام نفس القطب بعد التنظيف قبل الاستغناء عن العينة التالية ، ولا تتطلب العينات المكبرة إضافة أي مواد كيميائية بخلاف الميثيلين الأزرق ، وهو غير مكلف بما أن تصنيع كل قطب كهربائي يكلف حوالي 0.55 دولار (أو 40 روبية هندية) ، يمكن أن يكون هذا المستشعر الحيوي بديلاً فعالاً من حيث التكلفة لتقنيات الكشف الحالية ، ويبين الجدول 2 مقارنة هذا العمل مع أجهزة الاستشعار الأخرى المذكورة في الأدبيات لفترة طويلة شظايا الحمض النووي في عينات غير متجانسة.
بالنظر إلى أن بروتوكولات الكشف الكهروكيميائية القائمة على MB تعتمد على خصوصية PCR ، فإن أحد القيود الرئيسية لهذه الطريقة هو إمكانية التضخيم غير المحدد في العينات غير المتجانسة مثل مياه الصرف الصحي ومياه البحيرة أو استخدام بادئات منخفضة النقاء. طرق الكشف الكهروكيميائية لاكتشاف الحمض النووي لمنتجات PCR غير المنقاة باستخدام أقطاب ENIG PCB غير المعدلة ، من الضروري فهم الأخطاء التي تحدث بواسطة dNTPs غير المستخدمة والبادئات بشكل أفضل ، ولتحسين ظروف التفاعل وبروتوكولات الفحص. قد يلزم أيضًا قياس الطلب على الأكسجين (BOD) لعينة الماء من أجل تحسين دقة القياس.
في الختام ، نقترح مستشعر ENIG PCB منخفض التكلفة للكشف عن الفيروسات في عينات البيئة (مياه البحيرة). الأقطاب الكهربائية ذات عمر افتراضي أطول ولا توجد متطلبات تخزين محددة ، وبالتالي فهي مناسبة لتطوير حلول القياس مع معالجة العينات المؤتمتة المنتشرة في البلدان منخفضة ومتوسطة الدخل. يستخدم المستشعر الحيوي أصباغ الأكسدة والاختزال غير المكلفة لتداخل الحمض النووي (MB) للكشف السريع عن أمبليكونات الهدف. شائع في العينات البيئية يقلل من خصوصية طريقة الاستشعار هذه بسبب الارتباط غير المحدد لـ MBs بأوليغنوكليوتيدات أحادية ومزدوجة تقطعت بهم السبل ، لذلك فإن خصوصية هذا الاختبار تعتمد على تحسين البادئات وظروف تفاعل PCR. يجب تفسير تيارات ذروة DPV التي تم الحصول عليها من العينات المختبرة بالنسبة للاستجابات التي تم الحصول عليها من التحكم السلبي (NTC) لكل اختبار. - حل التكلفة الذي يمكنه جمع العينات وتحليلها وإرسال النتائج لاسلكيًا إلى المختبر.
Cashdollar، J. & Wymer، L. طرق للتركيز الأولي للفيروسات من عينات المياه: مراجعة وتحليل تلوي للدراسات الحديثة.التطبيق: الكائنات الدقيقة 115 ، الصفحات 1-11 (2013).
Gall، AM، Mariñas، BJ، Lu، Y. & Shisler، JL Waterborne viruses: الحواجز أمام مياه الشرب الآمنة. PLoS Pathogens.11، E1004867 (2015).
شريسثا ، إس وآخرون ، علم أوبئة مياه الصرف الصحي من أجل المراقبة الفعالة من حيث التكلفة على نطاق واسع لـ COVID-19 في البلدان المنخفضة والمتوسطة الدخل: التحديات والفرص ، Water 13 ، 2897 (2021).
Palecek، E. & Bartosik، M. الكيمياء الكهربائية للحمض النووي. كيميائي.112 ، 3427-3481 (2012).
Tani، A.، Thomson، AJ & Butt، JN Methylene blue كمميز كهروكيميائي لأوليغنوكليوتيدات مفردة ومزدوجة تقطعت بهم السبل مثبتة على ركائز ذهبية. محلل 126 ، 1756-1759 (2001).
Wong، EL، Erohkin، P. & Gooding، JJ مقارنة بين الكاتيون والأنيون Intercalators للتحويل الكهروكيميائي لتهجين الحمض النووي عن طريق نقل الإلكترون طويل المدى. Electrochemistry.comminicate.6، 648–654 (2004).
Wong، EL & Gooding، JJ Charge transfer من خلال DNA: جهاز استشعار حيوي للحمض النووي الكهروكيميائي الانتقائي.anus.Chemical.78 ، 2138-2144 (2006).
فانغ ، تي إتش وآخرون ، جهاز الموائع الدقيقة PCR في الوقت الحقيقي مع الكشف الكهروكيميائي المتزامن ، المستشعر البيولوجي ، الإلكترونيات الحيوية ، 24 ، 2131-2136 (2009).
Win، BY وآخرون دراسة آلية الإشارة والتحقق من أداء نظام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكهروكيميائي في الوقت الفعلي بناءً على تفاعل أزرق الميثيلين مع الحمض النووي محلل 136 ، 1573-1579 (2011).
Ramirez-Chavarria ، RG وآخرون ، مستشعر كهروكيميائي قائم على التضخيم متساوي الحرارة بوساطة الحلقات للكشف عن sars-cov-2 في عينات مياه الصرف الصحي.البيئة ، الكيمياء ، بريطانيا ، 10 ، 107488 (2022).
كومار ، إم وآخرون ، الاستشعار الكهروكيميائي لمبليكونات السارس- CoV-2 مع أقطاب ثنائي الفينيل متعدد الكلور ، يتم تنشيط المستشعر ب الكيمياء 343 ، 130169 (2021).
Kitamura ، K. ، Sadamasu ، K. ، Muramatsu ، M. & Yoshida ، H. الاكتشاف الفعال لـ SARS-CoV-2 RNA في الجزء الصلب من مياه الصرف الصحي. البيئة العامة 763 ، 144587 (2021).
Alygizakis، N. et al: الطرق التحليلية لاكتشاف فيروس كورونا SARS-CoV-2 في مياه الصرف الصحي: البروتوكول والآفاق المستقبلية.
Fedorenko، A.، Grinberg، M.، Orevi، T. & Kashtan، N.10 ، 1-10 (2020).
Dey ، R. ، Dlusskaya ، E. & Ashbolt ، NJ الثبات البيئي لبديل SARS-CoV-2 (Phi6) في الأميبا التي تعيش بحرية.Water Health 20، 83 (2021).
Mindich، L. تغليف دقيق لثلاث شظايا جينومية من بكتيريا RNA مزدوجة الشريطة \ (\ varphi \) 6.microorganism.Moore.biology.Rev.63 ، 149-160 (1999).
Pirttimaa ، MJ & Bamford ، البنية الثانوية للعاثية DH RNA \ (\ varphi \) 6 ، RNA 6 ، 880-889 (2000).
Bonilla، N. et al.Phages on the Tap - بروتوكول سريع وفعال لإعداد مخزون المختبر من العاثيات PeerJ 4، e2261 (2016).