Dankie dat jy Nature.com besoek het. Die blaaierweergawe wat jy gebruik het beperkte ondersteuning vir CSS. Vir die beste ervaring, beveel ons aan dat jy 'n opgedateerde blaaier gebruik (of versoenbaarheidsmodus in Internet Explorer afskakel). Om intussen te verseker voortgesette ondersteuning, sal ons die webwerf sonder style en JavaScript vertoon.
Die belangrikheid van die monitering van omgewingsmonsters word baie waardeer sedert die begin van die COVID-19-pandemie, en sommige moniteringspogings word uitgevoer met behulp van die goue standaard, hoewel qPCR-gebaseerde tegnieke duur is. Elektrochemiese DNA-biosensors kan 'n potensieel kostedoeltreffende oplossing vir die monitering van omgewingswatermonsters in lae- en middelinkomstelande. In hierdie werk demonstreer ons die elektrochemiese opsporing van amplikone verkry van Phi6-faag wat geïsoleer is uit meer watermonsters met puntige meer ('n gewilde surrogaat vir SARS-CoV-2), met behulp van ENIG om PCB-elektrodes te voltooi sonder oppervlakmodifikasie.seks. Die elektrochemiese sensorrespons is deeglik gekarakteriseer vir twee DNS-fragmente van verskillende lengtes (\({117}\,\hbox {bp}\) en \({503}\,\hbox {bp}\)), en die effek van soute in PCR-meestermengsels op metileenblou (MB)-DNA-interaksies. Ons resultate toon dat die lengte van DNA-fragmente die elektrochemiese sensitiwiteit aansienlik bepaal en demonstreer in hierdie werk dat die vermoë om lang amplikone op te spoor sonder gel suiwering van PCR produkte is belangrik vir in situ meting van watermonsters.'n Ten volle outomatiese oplossing vir virale lading voorspel goed.
Watergedraagde virusoordrag is sedert die 1940's bekend as 'n openbare gesondheidsgevaar, met die eerste bewyse van watergedraagde oordrag van polio en hepatitis E1. Die Wêreldgesondheidsorganisasie (WGO) het verskeie watergedraagde virale patogene van matige tot hoë gesondheidsbelangrikheid geklassifiseer2. Tradisionele virus opsporingsmetodes maak staat op goudstandaard qPCR-gebaseerde tegnieke, wat hoogs sensitief en spesifiek is, maar vereis dat geskoolde personeel in die laboratorium met duur instrumente toets. In lae- en middelinkomstelande (LMIC's) met beperkte hulpbronne is mense egter monstertoetsing sal waarskynlik voorkeur geniet bo omgewingswatermonstermonitering.Daarom is alternatiewe laekostemetodes nodig vir volhoubare, intydse monitering van water- en afvalwatermonsters in lae- en middelinkomstelande as vroeë waarskuwings van opkomende siekte-uitbrake, daardeur teen die ernstige sosio-ekonomiese impakte van die viruspandemie te beskerm. Laekoste-elektrochemiese biosensors vir nukleïensure kan 'n belowende potensiële oplossing vir hierdie onvervulde behoefte bied. Baie van hierdie DNS-biosensors werk deur die feit dat komplementêre DNS-stringe op die elektrode geïmmobiliseer word oppervlak en hibridiseer wanneer 'n ooreenstemmende volgorde in die monster teenwoordig is. Dit kan dan deur verskeie elektrochemiese tegnieke in 'n sein omgeskakel word deur redoksbemiddelaars soos kaliumyster/ferrosianied te gebruik. Metileenblou (MB) is een so 'n redoksaktiewe molekule, wat na berig word om in dubbelstring-DNA (dsDNA) te interkaleer bykomend tot die meer nie-spesifieke binding daarvan aan enkelstring-DNA5,6. Die interkalerende aard van MB's om MB-DNA-komplekse te vorm maak hulle 'n gewilde keuse as redoksbemiddelaars in verskeie elektrochemiese DNA sensorkonfigurasies5,6,7,8,9. Alhoewel die interkalasie van MB na DNA nie-spesifiek is, en die spesifisiteit van hierdie elektrochemiese sensor grootliks afhang van die suiwerheid van die primers wat vir PCR of isotermiese amplifikasie gebruik word, is dit goed geskik vir die implementering van werklike -tyd elektrochemies-gebaseerde qPCR of fluoressensie isotermiese amplifikasie as 'n alternatief vir DNA konsentrasie meting 9 .In een so 'n implementering, Won et al. Die oppervlak van goue elektrodes is gemodifiseer met 6-merkapto-1-heksanol (MCH) vir intydse meting van PCR-amplikone met MB deur gebruik te maak van differensiële pulsvoltammetrie (DPV)9.In ander gevalle, Ramirez et al.Opsporing van SARS-CoV-2 in afvalwater deur RT-LAMP-reaksie deur MB met skermgedrukte elektrodes te gebruik.Platinum-elektrodes is ook gebruik as in situ elektrodes in 'n mikrofluïdiese PCR platform wat ontwerp is om amplicons elektrochemies op te spoor tydens reaksies 8 .Al hierdie studies vereis oppervlak modifikasie van die elektrodes, wat verhoogde produksie en bedryfskoste impliseer as gevolg van spesiale stoor vereistes vir die stabiliteit van hierdie gefunksionaliseerde elektrodes.
Skematiese van die werkvloei vir elektrochemiese opsporing van amplicons verkry uit gekonsentreerde virale deeltjies in meerwatermonsters.
Ons het onlangs elektrochemiese waarneming van SARS-CoV-2-amplikone gedemonstreer met laekoste-gedrukte stroombaan (PCB)-elektrodes gebaseer op DPV en sikliese voltammetrie (CV) geïnduseer deur adsorpsie van MB-DNA-komplekse op die oppervlak van ongemodifiseerde elektrodes ) veranderinge in piek huidige11.Ons rapporteer dat langer DNS-fragmente (N1-N2, \({943}\, \hbox) wat gevorm is met die CDC-aanbevole N1 voorwaartse en N2 omgekeerde primers in vergelyking met korter fragmente {bp}\)) beter lineariteit in die sensorrespons getoon het ( N1, \(72\,\hbox {bp}\)) gevorm met behulp van N1 vorentoe en N1 terugwaartse primer stelle. Hierdie studies word gerapporteer deur gebruik te maak van DNA verdunnings wat in nukleasevrye water voorberei is. Die platform is ook gebruik om SARS-CoV op te spoor -2 amplikone in gesimuleerde afvalwatermonsters (verkry deur totale RNA-monsters met SARS-CoV-2-RNA te spik). Aangesien RNA vatbaar is vir skeerwerk tydens isolasie en stroomaf-verwerking,12,13 is dit moeilik om langer fragmente met hierdie heterogene monster te versterk. Daarom is die demonstrasie van elektrochemiese waarneming van SARS-CoV-2 amplikon in afvalwater beperk tot die korter \(72\,\hbox {bp}\) N1-fragment.
In hierdie werk het ons die haalbaarheid ondersoek van ENIG PCB-gebaseerde elektrochemiese waarneming van faag Phi6 gekonsentreer en geïsoleer uit meerwatermonsters (Fig. 1). Phi6-fage is in grootte (80-100 nm) vergelykbaar met SARS-CoV-2 en het ook 'n lipiedmembraan en 'n piekproteïen.Om hierdie redes is bakteriofaag Phi6 'n gewilde surrogaat vir SARS-CoV-2 en ander omhulde patogeniese RNA-virusse14,15. RNS wat uit faagdeeltjies geïsoleer is, is as 'n sjabloon vir cDNA-sintese gebruik, gevolg deur PCR om twee DNA-fragmente van 117 en 503 basispare lank te verkry. Gegewe die uitdaging om \(943\,\hbox {bp}\) N1-N2-fragmente in ons vorige werk te versterk, teiken ons intermediêre lengte fragmente (\(117) \,\hbox {bp}\) en \(503 \,\hbox {bp}\)), gebaseer op beskikbare primers. Die elektrochemiese sensorrespons is sistematies bestudeer oor 'n wye konsentrasiereeks (\({10}\,{ \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) na \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\))) Vir beide fragmente in die teenwoordigheid van MB, is die effek van sout op die sensorrespons gekenmerk en deur spektrofotometriese metings gekruisgevalideer. Die belangrikste bydraes van hierdie werk is soos volg:
DNA-fragmentlengte en die teenwoordigheid van sout in die monster beïnvloed sensitiwiteit sterk.Ons resultate toon dat elektrochemiese aktiwiteit afhang van verskillende meganismes van die interaksie van MB, DNA en die sensor in die voltammetriese reaksie, afhangende van DNA-konsentrasie en lengte, met langer Fragmente toon hoër sensitiwiteit, alhoewel sout 'n negatiewe effek op elektrostatiese interaksies tussen MB en DNA.
DNA-konsentrasie bepaal die meganisme van MB-DNA-interaksie in ongemodifiseerde elektrodes Ons demonstreer dat verskillende meganismes van MB-DNA-interaksie afhang van DNA-konsentrasie. By DNA-konsentrasies onder 'n klein hoeveelheid van \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox) {l}}}\), het ons waargeneem dat die elektrochemiese stroomreaksie hoofsaaklik bepaal is deur die adsorpsie van MB-DNA op die elektrode, terwyl by laer konsentrasies By hoë DNS-konsentrasies, die elektrochemiese stroomreaksie bepaal is deur die steriese inhibisie van redoks aktiwiteit as gevolg van MB-invoeging tussen DNA-basispare.
ENIG PCB-gebaseerde elektrochemiese waarneming van virale nukleïensure in meerwatermonsters Die waarnemings is bekragtig deur elektrochemiese opsporing van Phi6-toegevoegde \(503\,\hbox {bp}\) DNA-fragmente verkry uit watermonsters van Powai Lake, IIT Mumbai Campus Resultaat faag.
Lae koste van implementering en potensiaal vir integrasie in ten volle outomatiese moniteringstelsels, oligonukleotiede of aptamere op elektrodes met langer raklewe.
Phage Phi6 is 'n omhulde dsRNA-virus van die Cytoviridae-familie wat Pseudomonas syringae infekteer. Die genoom van Phi6-faag bestaan in die vorm van 3 fragmente: S (\(2.95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4.07) \,\hbox {Kb}\)) en L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\))16,17. Aangesien die Phi6-faag 'n nie-patogeniese BSL-1 Pseudomonas-stam infekteer, is dit veilig om te gebruik en kan maklik in die laboratorium gekweek word.Phage Phi6 en sy gasheer Pseudomonas syringae is aangekoop by die Felix d'Herelle-verwysingsentrum vir bakteriese virusse, Laval Universiteit, Kanada (verwysingsentrumkatalogusnommers is onderskeidelik HER-102 en HER-1102) .Phi6-faag en sy gasheer is herleef soos deur die verwysingsentrum aangedui. Faag Phi6 is gesuiwer deur plaatlise en eluering om finale titers te verkry met \(\ongeveer 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { ml}}\) (gedenkplaatvormende eenhede/ milliliter). RNS is geïsoleer uit gesuiwerde faagdeeltjies deur gebruik te maak van die GenElute™ Universal Total RNA Purification Kit (Sigma-Aldrich) volgens die vervaardiger se instruksies. Kortliks, 'n gesuiwerde faag Phi6-suspensie\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) is gelys en die lysaat is op 'n spinkolom gelaai om RNA aan die harkolom te laat bind. Die RNA word dan in die elueringsoplossing geëlueer \({ 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) verskaf deur die kit. Skat die konsentrasie van RNA deur absorpsie by \(260\,\hbox {nm}\).RNA is gestoor in aliquots in \ ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) tot verdere gebruik.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) Die iScript cDNA Sintesestel (Bio -Rad Laboratories) is gebruik as 'n sjabloon vir cDNA-sintese volgens die vervaardiger se instruksies. Kortliks bestaan 'n cDNA-sintese-reaksie uit 3 stappe: priming by \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min} }\) , omgekeerde transkripsie van \({20}\,{\hbox {min}}\) by \({46}\,{^{\circ }\hbox {C}}\), en omgekeerd Die blokfluit is in \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) vir \({1}\,{\hbox {min. }}\).Wanneer dit op 'n 1% agarosegel uitgevoer is, het die cDNA drie bande getoon wat ooreenstem met die verwagte drie RNA-fragmente (data nie gewys nie). Die volgende primers is gebruik om twee DNA-fragmente van 117 en 503 bp lank te amplifiseer, gebruik cDNA as sjabloon vir PCR in 'n miniPCR® mini8 termiese siklus:
Die primers vir \(117\,\hbox {bp}\) en \(503\,\hbox {bp}\) stem ooreen met 1476-1575 nukleotiede van die M-segment en 458-943 nukleotiede van die L-segment, onderskeidelik suur .Alle geamplifiseerde PCR produkte is geëlektroforeer op 1% agarose gels, en geamplifiseerde teiken DNA is gesuiwer deur gebruik te maak van die GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Fisher Scientific).
'n Meer by die IIT Mumbai-kampus (Powai Lake, Powai, Mumbai) is gebruik om faagdeeltjies by te voeg. Die meerwater is deur 'n \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) membraan gefiltreer om te verwyder gesuspendeerde deeltjies, en dan is Phi6-faag bygevoeg. Voeg \({1}\,{\hbox {ml}}\) van \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} by \) na \( {100}\ ,{\hbox {ml}}\) gefiltreerde meerwater, in \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\).'n Klein portie was gereserveer vir virale ladingmeting deur plaaktoets. Ons het twee verskillende metodes getoets om gepunte Phi6-virusdeeltjies te konsentreer: (1) die aluminiumhidroksied adsorpsie-presipitasie-metode,19 wat bekragtig is vir die konsentrasie van verskeie omhulde RNA-virusse uit omgewingsmonsters, en (2) ) Die poliëtileenglikol (PEG)-gebaseerde viruskonsentrasiemetode is aangepas vanaf Flood et al.20 .Aangesien gevind is dat die herwinningsdoeltreffendheid van die PEG-gebaseerde metode beter is as dié van die aluminiumhidroksiedmetode, is die PEG-gebaseerde metode gebruik om Phi6-deeltjies uit meerwatermonsters te konsentreer.
Die PEG-metode wat gebruik is, was soos volg: PEG 8000 en \(\hbox {NaCl}\) is by Phi6-puntige meerwatermonsters gevoeg om 8 % PEG 8000 en \(0.2\,\hbox {M} \) \( \ hbox {NaCl}\).Monsters is op 'n skudder geïnkubeer\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), dan gesentrifugeer by \(4700 \,\hbox {g}\) is \({45}\,{\hbox {min}}\). Gooi die supernatant weg en hersuspendeer die korrel in \({1}\, {\hbox {ml}}\) in dieselfde supernatant. Alle spik- en viruskonsentrasie-eksperimente is in drievoud uitgevoer. Na konsentrasie is 'n klein hoeveelheid gereserveer vir meting van herwinningsdoeltreffendheid deur plaaktoets. RNS is geïsoleer soos voorheen beskryf en geëlueer in kit-verskafde elueringsbuffer\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\). Aangesien die RNA-konsentrasie van monster tot monster in drievoud sal verskil, sal die \({2}\,{\upmu \ hbox {l}}\) van RNA word vir al drie gebruik ongeag die konsentrasie daarvan cDNA-sintese van monsters.cDNA-sintese is uitgevoer soos voorheen beskryf.\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNA is gebruik as sjabloon vir \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR vir 35 siklusse om \ (117\,\hbox {bp}\) en \(503\,\hbox { te versterk) bp}\) fragmente. Hierdie monsters word voorgestel as "1:1", dws sonder verdunning. 'n Geen-sjabloonkontrole (NTC) is opgestel as 'n negatiewe kontrole, terwyl 'n cDNA gesintetiseer met RNA wat uit gesuiwerde faag geïsoleer is, opgestel is as 'n sjabloon vir 'n positiewe kontrole (PC). Kwantitatiewe PCR (qPCR) is uitgevoer in 'n Stratagene Mx3000P RT-PCR instrument met behulp van Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies). Reaksies is in drievoud opgestel soos voorheen beskryf. Die siklusdrempel (Ct) is vir alle monsters aangeteken. Boonop was die verdunde monsters \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) met behulp van cDNA verdun 1:100 in gefiltreerde meerwater as \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR vir 35 siklusse. Hierdie monsters word voorgestel as “1:100″.
Die PCB elektrodes word vervaardig deur gebruik te maak van 'n kommersieel beskikbare laekoste Elektrolose Nikkel Immersion Gold (ENIG) proses sonder die behoefte aan bykomende goudplatering.ENIG PCB elektrode spesifikasies word in ons vorige werk uiteengesit11.Vir ENIG PCB elektrodes, tradisionele elektrode skoonmaak metodes soos bv. piranha oplossing of swaelsuur sikliese voltammetrie word nie aanbeveel nie aangesien dit afskilfering van die dun goudlaag (dikte \(\ongeveer\) \(100\,\hbox {nm }\)) kan veroorsaak en die onderliggende koperlae wat geneig is, kan blootstel tot korrosie 21, 22, 23, 24, 25. Maak dus die elektrodes skoon met 'n pluisvrye lap wat met IPA bevochtig is. Die monster wat getoets moet word, is geïnkubeer met \({50}\,{\upmu \hbox {M} }\) MB in \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({1}\,{\hbox {h}}\) vir maklike invoeging.In ons vorige werk , het ons waargeneem dat die sensitiwiteit en lineariteit van die sensor verbeter is deur die MB-konsentrasie 11 te verhoog. Gebaseer op optimaliserings wat in ons vroeëre werk gerapporteer is, het ons \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB gebruik konsentrasies om DNA in hierdie studie in te sluit.Elektrochemiese opsporing van dubbelstring-DNA (ds-DNA) kan bereik word deur gebruik te maak van anioniese of kationiese interkalators. Alhoewel anioniese interkalators DNS met beter selektiwiteit opspoor, benodig hulle oornag inkubasie, wat langer opsporingstye tot gevolg het. aan die ander kant vereis kationiese interkalators soos MB korter inkubasietye, ongeveer \({1}\,{\hbox {h}}\) vir elektrochemiese opsporing van ds-DNA6. Elke meting behels die reseptering van die monster wat getoets moet word op die elektrode\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), maak dan skoon met 'n IPA-bevochtigde lap, voordat jy voortgaan met 'n ander monster.een meting.Elke monster is op 5 verskillende elektrodes getoets, tensy anders vermeld.DPV en CV metings is uitgevoer met behulp van 'n PalmSens Sensit Smart potensiostaat, en PSTrace sagteware is gebruik vir potensiostaat konfigurasie en data verkryging, insluitend piek stroom berekeninge.Die volgende instellings word gebruik vir DPV- en CV-metings:
DPV: Ekwilibrium Tyd = \(8\,\hbox {s}\), Spanning Stap = \(3\,\hbox {mV}\), Polsspanning = \(25\,\hbox {mV}\) , polsduur = \(50\,\hbox {ms}\), skanderingstempo = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: Ekwilibrium Tyd = \(8\,\hbox {s}\), Spanning Stap = \(3\,\hbox {mV}\), Sweep Tempo = \({300}\,\hbox {mV/ s }\)
Piekstrome verkry van voltammogramme van DNA wat met \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) gekomplekseer is MB: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
DPV- en CV-voltammogramme is verkry op ENIG PCB-elektrodes \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB gekomplekseer met DNA (by konsentrasies van 10–\({20}\,{\ hbox {ng) }/{\upmu \hbox {l}}}\) dws 0.13–\({0.26}\,{\upmu \hbox {M}}\) vir \(117\,\hbox {bp}\ ) en 0.03 –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) vir \(503\,\hbox {bp}\)).Verteenwoordigende voltammogramme word in Figuur S1 in Aanvullende Inligting getoon.Figuur 2 wys die resultate van DPV- en CV-metings (piekstroom) met behulp van gel-gesuiwerde PCR-produkte.Vergeleke met CV-metings toon DPV-metings hoër sensitiwiteit (stroom as 'n funksie van DNA-konsentrasie) omdat die agtergrond kapasitiewe strome in CV-metings Faradaiese strome verberg 26 .Die data vir elke boks in die boksplot bevat metings vanaf 5 elektrodes. Alle metings gebruik dieselfde stel elektrodes om meetfoute as gevolg van elektrode-tot-elektrode variasie te vermy. Ons het 'n toenemende neiging in DPV en CV gemeet piekstrome vir laer konsentrasies van DNA waargeneem , langer (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ in vergelyking met \(117) ) fragment. Dit stem ooreen met die verwagte neiging van elektrode-adsorpsie wat in ons vorige werk gerapporteer is. adsorpsie van die MB-DNA-kompleks vergemaklik die ladingoordrag op die elektrode, wat bydra tot die verhoging van die piekstroom. Ander studies het die effek van oligonukleotiedgrootte en -volgorde op MB-DNA-interkalasie getoon27,28,29,30.Die guanien -sitosien (GC) inhoud van die twee amplikone (\(117\,\hbox {bp}\) en \(503\,\hbox {bp}\)) was ongeveer 50%, wat aandui dat die waarneming Die verskil is te wyte tot amplikonlengte. Vir hoër DNS-konsentrasies (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), vir \(503\,\hbox {bp}) \) en \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) vir \(117\,\hbox {bp}\)), neem ons twee versterkings waar. piekstrome van die subs word verminder in beide DPV- en CV-metings. Dit is omdat MB versadig en interkaleer tussen basispare van DNA, wat lei tot steriese inhibisie van die redoksaktiwiteit van die reduseerbare groep in MB31,32.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV。
Soute teenwoordig in PCR-meestermengsels meng in met elektrostatiese interaksies tussen MB en DNA, dus deur \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) by te voeg met \({50} \,{\ upmu \hbox {M}}\) MB-gel-gesuiwerde produk om die effek van sout op MB-DNA-interaksie te bestudeer. Soos getoon in Figuur 3, het ons waargeneem dat vir hoër DNA-konsentrasies (\(>{2}\,{\ hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) en \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) vir \(117\,\hbox {bp} \)), in DPV en CV Die byvoeging van sout het nie die metings noemenswaardig beïnvloed nie (sien Figuur S2 in Aanvullende Inligting vir verteenwoordigende voltammogramme). laer DNA-konsentrasies, verminder die byvoeging van sout sensitiwiteit aansienlik, wat geen noemenswaardige verandering in stroom met DNA-konsentrasie tot gevolg het nie. Soortgelyke negatiewe effekte van sout op MB-DNA-interaksies en interkalasie is voorheen deur ander navorsers aangemeld33,34.\(\hbox { Mg}^{2+}\) katione bind aan die negatiewe fosfaat-ruggraat van DNA, en belemmer daardeur die elektrostatiese interaksie tussen MB en DNA. By hoër DNA-konsentrasies lei steriese inhibisie van redoks-aktiewe MB's tot laer piekstrome, dus elektrostatiese interaksies beïnvloed nie die sensorrespons beduidend nie. Die sleutelpunt is dat hierdie biosensor beter geskik is om hoër DNS-konsentrasies op te spoor (selde \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) of hoër), vir volledig- Geoutomatiseerde verwerking van omgewingswatermonsters, waar gelsuiwering van PCR-produkte moontlik nie haalbaar is nie.
Oppervlakte onder die absorpsiekurwe vir die golflengtereeks 600–700 \(\hbox {nm}\) vir verskeie konsentrasies DNA wat met \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) gekomplekseer is MB: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) met en sonder sout (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) met en sonder sout (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) DNA-konsentrasies wat ooreenstem met \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB-monsters Geen DNA.
Om bogenoemde resultate verder te verifieer, het ons optiese metings uitgevoer met behulp van 'n UV/Vis spektrofotometer (Thermo Scientific Multiskan GO), die monsters \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) is gebruik vir elke Meting.Die absorpsiehandtekening neem af met toenemende DNA-konsentrasie, soos gesien kan word uit die tendens van die area onder die absorpsiekurwe vir die golflengtereeks \(600\,\hbox {nm}\) tot \(700\,\hbox { nm}\), soos getoon in Fig. 4 (absorpsiespektrum getoon in Fig. S3 in Aanvullende Inligting).Vir monsters met DNA-konsentrasies minder as \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), was daar geen beduidende verskil in opname tussen DNA-bevattende en MB-alleen monsters (vir \(503\,\hbox {bp}\) en \(117\,\hbox {bp}\) ) lengtefragmente), wat die afwesigheid van steriese inhibisie van redoksaktiewe MB aandui. By hoër DNS-konsentrasies het ons 'n geleidelike afname in die absorpsiesein waargeneem en 'n mindere afname in absorpsie in die teenwoordigheid van sout opgemerk. Hierdie resultate is toegeskryf aan molekulêre interaksies en steriese inhibisie met basisstapeling in DNA-basters. Ons resultate stem ooreen met verslae in die literatuur oor spektroskopiese studies van MB-DNA-interkalasie wat hipochromatiesiteit assosieer met verminderde energievlakke in \(\pi\)–\(\pi ^*\ ) elektroniese oorgange as gevolg van interkalasie Lae 36, 37, 38.
Agarosegelelektroforese van faag Phi6: PKR-produkte van lengte \(117\,\hbox {bp}\) en \(503\,\hbox {bp}\) van meerwatermonsters.M-DNA-merker;NTC-geen-sjabloonbeheer, primers wat ooreenstemmende amplikone bevat;PC positiewe beheer;1, 2, 3-onverdunde (1:1) meer watermonsters in drievoud. 'n Band is sigbaar by \(\ongeveer 50\,\hbox {bp}\) as gevolg van ongebruikte oligonukleotiede in die \(503\,\ hbox {bp}\) baan.
Ons het die bruikbaarheid van die sensor geëvalueer deur gebruik te maak van Powai Lake-watermonsters met Phi6-faag. Die RNA-konsentrasies wat geïsoleer is uit faag-gepunte watermonsters het gewissel van 15.8–\({19.4}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox { ml}}\), terwyl dié wat uit gesuiwerde faagsuspensies geïsoleer is. Die RNA is geskat as \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) met 'n herwinningsdoeltreffendheid van ongeveer 1 %.RNA is omgekeerd getranskribeer in cDNA en gebruik as sjabloon vir PCR en qPCR. Produkgrootte is bevestig deur agarose gel elektroforese (Figuur 5) voor toetsing met die sensor. Hierdie monsters is nie jel gesuiwer nie en bevat dus alle komponente van PCR as Die Ct-waardes wat tydens qPCR (Tabel 1) aangeteken is, korreleer met die konsentrasie RNA wat geïsoleer is uit die ooreenstemmende gepunte watermonsters. Die Ct-waarde toon die aantal siklusse wat benodig word vir die fluoresserende sein om die drempel- of agtergrondsein oorskry. Hoër Ct-waardes dui laer sjabloonkonsentrasies aan en omgekeerd. Die Ct-waardes van die NTC-monsters was so hoog as wat verwag is. Die verskil in \(\ongeveer 3\) Ct-waardes tussen die positiewe kontrole en die toetsmonster dui verder aan dat elke toetsmonster ongeveer 1% sjabloon het in vergelyking met die positiewe kontrole.Ons het voorheen bespreek dat langer amplikone tot beter sensitiwiteit lei.Amplifikasie van langer fragmente wat uit heterogene omgewingsmonsters geïsoleer is, is uitdagend gegewe die nadele van lae virale konsentrasie en RNA-afbraak. Met ons virusverryking en PCR-amplifikasieprotokol kon ons egter die \(503\,\hbox {bp}\)-fragment vir elektrochemiese waarneming suksesvol versterk.
Figuur 6 toon die elektrochemiese sensorresultate van die \(503\,\hbox {bp}\) fragment amplikon, beide met behulp van onverdunde cDNA as templaat (1:1) en 100-voudig verdunde cDNA as templaat (1:100) uitgevoer PCR , in vergelyking met NTC en PC (sien Figuur S4 in Aanvullende Inligting vir verteenwoordigende voltammogramme).Elke boks in die boxplot in Figuur 6 bevat metings van drie monsters by 5 elektrodes.Dieselfde elektrodes is gebruik om alle monsters te meet om foute as gevolg van elektrode te vermy -tot-elektrode-variasie.Vergeleke met CV-metings, toon DPV-metings beter resolusie om toets- en PC-monsters van NTC's te onderskei omdat, soos voorheen genoem, Faradaic-strome versteek is as gevolg van agtergrond-kapasitiewe strome in laasgenoemde. Vir langer amplicons het ons opgemerk dat die negatiewe beheer (NTC) het gelei tot hoër CV- en DPV-piekstrome relatief tot die positiewe kontrole, terwyl positiewe en onverdunde toetsmonsters soortgelyke piekhoogtes van DPV-piekstrome getoon het. Die gemete gemiddelde en mediaanwaardes vir elke onverdunde (1:1) ) toetsmonster en PC kan duidelik opgelos word vanaf die sensoruitset vir die NTC-monster, terwyl die resolusie vir die 1:100 verdunde monster minder uitgesproke is.Vir 'n 100-voudige verdunning van cDNA het ons geen bande tydens gelelektroforese waargeneem (bane nie in Figuur 5 getoon nie), en die ooreenstemmende DPV- en CV-piekstrome was soortgelyk aan dié wat vir NTC verwag is. Die resultate vir die \(117\,\hbox {bp}\)-fragment word in Aanvullende Inligting getoon. beheer het 'n elektrochemiese reaksie vanaf die PCB-sensor geïnduseer as gevolg van die adsorpsie van vry MB op die elektrode en die interaksie van die MB met die enkelstring-primer oligonukleotied. Daarom moet elke keer as 'n monster getoets word, 'n negatiewe kontrole uitgevoer word en die piekstroom van die toetsmonster in vergelyking met die piekstroom verkry deur die negatiewe kontrole om 'n differensiële (relatiewe) meting39,40 te bereik om die toetsmonster as positief of negatief te klassifiseer.
(a) DPV, en (b) CV-piekstroom vir elektrochemiese opsporing van \(503\,\hbox {bp}\) fragmente in meerwatermonsters. Toetsmonsters is in drievoud gemeet en vergelyk met geen sjabloonkontroles (NTC) en positiewe kontroles (PC).
Ons bevindinge illustreer verskillende meganismes wat die werkverrigting van elektrochemiese sensors vir amplikone van verskillende lengtes vir verskillende DNS'e beïnvloed, met konsentrasies wat deur optiese metings met behulp van 'n UV/Vis-spektrofotometer geverifieer is. Ons waarnemings onderstreep die insig dat langer DNS-fragmente tot \(\ongeveer\) \(500\,\hbox {bp}\) kan met hoër sensitiwiteit opgespoor word en dat die teenwoordigheid van sout in die monster nie Sensitiwiteit DNA-konsentrasie wat hoër sensitiwiteit beïnvloed nie (selde \({\hbox {ng}/{\upmu) \hbox {l}}}\) en hoër). Daarbenewens het ons die effek van verskillende soorte monsters ondersoek, insluitend gel-gesuiwerde amplikone met en sonder bygevoegde sout, en byvoeging van meerwatermonsters in DPV- en CV-metings.Ons het opgemerk dat DPV beter resolusie verskaf het, aangesien die agtergrond kapasitiewe stroom ook die CV meting beïnvloed, wat dit minder sensitief maak.
Amplifikasie van langer fragmente hang af van die integriteit van die virale genomiese RNA. Verskeie studies het getoon dat amplifikasie van langer fragmente nie altyd doeltreffend is nie as gevolg van afbraak van RNA in die omgewing en die potensiaal vir splitsing tydens isolasie11,41,42,43,44 .Ons het waargeneem dat die PEG-gebaseerde viruskonsentrasiemetode meer effektief was om faag Phi-6 wat in meerwatermonsters gespik is te konsentreer as die aluminiumhidroksied-gebaseerde viruskonsentrasiemetode. Die vermoë om lang DNA-fragmente op te spoor het bewys dat dit die vereiste vir multipleks-PKR oorkom om veelvuldige korter lengte sjablone te versterk en die moontlikheid van kruisspesifisiteit te verminder.
Biologiese monsters is skaars, so daar is 'n behoefte om 'n biosensor te ontwerp wat minimale monsters vir toetsing benodig. Die ENIG PCB-elektrodes wat in hierdie studie gebruik is, het slegs \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ benodig ) monsters vir toetsing om die effektiewe area van die elektrodes te bedek. Boonop kan dieselfde elektrode hergebruik word nadat dit skoongemaak is voordat die volgende monster uitgegee word. Versterkte monsters vereis nie die byvoeging van enige ander chemikalieë as metileenblou nie, wat 'n goedkoop is en algemeen gebruikte chemikalieë.Aangesien elke elektrode sowat $0,55 (of INR 40) kos om te vervaardig, kan hierdie biosensor 'n koste-effektiewe alternatief vir bestaande opsporingstegnologieë wees.Tabel 2 toon 'n vergelyking van hierdie werk met ander sensors wat lank in die literatuur gerapporteer word DNA-fragmente in heterogene monsters.
Aangesien MB-gebaseerde elektrochemiese opsporingsprotokolle op die spesifisiteit van PCR staatmaak, is 'n groot beperking van hierdie metode die potensiaal vir nie-spesifieke amplifikasie in heterogene monsters soos afvalwater en meerwater of die gebruik van lae-suiwer primers. Om die sensitiwiteit van elektrochemiese opsporingsmetodes vir DNS-opsporing van ongesuiwerde PCR-produkte deur gebruik te maak van ongemodifiseerde ENIG PCB-elektrodes, is dit nodig om foute wat deur ongebruikte dNTP's en primers ingelei word beter te verstaan, en om reaksietoestande en toetsprotokolle te optimaliseer. Bykomende fisieschemiese parameters soos pH, temperatuur en biologiese suurstofverbruik (BOD) van die watermonster moet dalk ook gemeet word om die akkuraatheid van die meting te verbeter.
Ten slotte stel ons 'n laekoste elektrochemiese ENIG PCB-sensor voor vir virusopsporing in omgewings (meerwater) monsters. Anders as geïmmobiliseerde oligonukleotiedelektrodes of pasgemaakte substrate vir DNA-waarneming wat kriogene berging benodig om sensitiwiteit te behou,53,54 gebruik ons tegniek ongemodifiseerde PCB elektrodes met 'n langer raklewe en geen spesifieke bergingsvereistes nie en dus geskik vir die ontwikkeling van meetoplossings met outomatiese monsterverwerking wat in LMIC's ontplooi word. Die biosensor gebruik goedkoop DNA-interkalerende redokskleurstowwe (MB) vir vinnige opsporing van teikenamplikone. Die niespesifieke amplifikasie algemeen in omgewingsmonsters verminder die spesifisiteit van hierdie waarnemingsmetode as gevolg van die nie-spesifieke binding van MBs aan enkel- en dubbelstring oligonukleotiede.Daarom hang die spesifisiteit van hierdie toets af van die optimalisering van primers en PCR-reaksietoestande.Daarbenewens is die CV en DPV-piekstrome wat van die getoetste monsters verkry is, moet geïnterpreteer word relatief tot die response verkry vanaf die negatiewe kontrole (NTC) vir elke toets. Die elektrochemiese sensorontwerpe en metodes wat in hierdie werk aangebied word, kan geïntegreer word met outo-monsters om 'n ten volle outomatiese en lae -koste-oplossing wat monsters kan versamel en ontleed en resultate draadloos na die laboratorium kan stuur.
Cashdollar, J. & Wymer, L. Metodes vir aanvanklike konsentrasie van virusse uit watermonsters: 'n oorsig en meta-analise van onlangse studies.J.Application.microorganism.115, pp. 1-11 (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL Watergedraagde virusse: Hindernisse vir veilige drinkwater. PLoS Patogene.11, E1004867 (2015).
Shrestha, S. et al. Afvalwater-epidemiologie vir koste-effektiewe grootskaalse toesig van COVID-19 in lae- en middelinkomstelande: uitdagings en geleenthede. Water 13, 2897 (2021).
Palecek, E. & Bartosik, M. Nucleic acid electrochemistry.Chemical.Rev.112, 3427–3481 (2012).
Tani, A., Thomson, AJ & Butt, JN Metileenblou as 'n elektrochemiese diskrimineerder van enkel- en dubbelstring-oligonukleotiede wat op goue substrate geïmmobiliseer is.Analyst 126, 1756–1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ Vergelyking van katioon- en anioon-interkaleerders vir elektrochemiese transduksie van DNA-hibridisering deur langafstand-elektronoordrag.Electrochemistry.comminicate.6, 648–654 (2004).
Wong, EL & Gooding, JJ Ladingoordrag deur DNA: 'n selektiewe elektrochemiese DNA-biosensor.anus.Chemical.78, 2138–2144 (2006).
Fang, TH et al.Intydse PCR-mikrofluïdiese toestel met gelyktydige elektrochemiese opsporing.biologiese sensor.Bioelectronics.24, 2131–2136 (2009).
Win, BY et al.Signaalmeganismestudie en prestasieverifikasie van 'n elektrochemiese intydse PKR-stelsel gebaseer op die interaksie van metileenblou met DNA.Analyst 136, 1573–1579 (2011).
Ramirez-Chavarria, RG et al.Loop-gemedieerde isotermiese versterking-gebaseerde elektrochemiese sensor vir opsporing van sars-cov-2 in afvalwatermonsters.J.Environment.Chemical.Britain.10, 107488 (2022).
Kumar, M. et al.Elektrochemiese waarneming van SARS-CoV-2-amplikone met PCB-elektrodes.Die sensor is geaktiveer.B Chemistry.343, 130169 (2021).
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. & Yoshida, H. Doeltreffende opsporing van SARS-CoV-2 RNA in die vaste fraksie van afvalwater.science.general environment.763, 144587 (2021).
Alygizakis, N. et al. Analytical Methods for SARS-CoV-2 Detection in Wastewater: Protocol and Future Perspectives.TraC trending anal.Chemical.134, 116125 (2020).
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. & Kashtan, N. Oorlewing van die omhulde bakteriofaag Phi6 ('n surrogaat vir SARS-CoV-2) in verdampte speekseldruppels wat op glasoppervlaktes neergelê word.wetenskap.Rep.10, 1–10 (2020).
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ Omgewingsvolharding van 'n SARS-CoV-2-surrogaat (Phi6) in vrylewende amoebe.J.Water Health 20, 83 (2021).
Mindich, L. Presiese verpakking van drie genomiese fragmente van dubbelstring-RNA-bakteriofaag\(\varphi\)6.mikroorganisme.Moore.biology.Rev.63, 149–160 (1999).
Pirttimaa, MJ & Bamford, Sekondêre struktuur van die DH RNA-faag\(\varphi\)6 verpakkingsgebied.RNA 6, 880–889 (2000).
Bonilla, N. et al.Phages on the Tap – 'n Vinnige en doeltreffende protokol vir die voorbereiding van laboratoriumvoorrade van bakteriofage.PeerJ 4, e2261 (2016).
Postyd: Mei-27-2022