O ṣeun fun ṣibẹwo si Nature.com.Ẹya ẹrọ aṣawakiri ti o nlo ni atilẹyin to lopin fun CSS.Fun iriri ti o dara julọ, a ṣeduro pe ki o lo ẹrọ aṣawakiri ti a ṣe imudojuiwọn (tabi pa ipo ibaramu ni Internet Explorer) lakoko, lati rii daju tesiwaju support, a yoo han ojula lai aza ati JavaScript.
Pataki ti ibojuwo awọn ayẹwo ayika ni a ti mọrírì pupọ lati ibẹrẹ ti ajakaye-arun COVID-19, ati pe diẹ ninu awọn akitiyan ibojuwo ni a ṣe ni lilo iwọn goolu, botilẹjẹpe awọn imọ-ẹrọ ti o da lori qPCR jẹ gbowolori. Electrochemical DNA biosensors le pese agbara iye owo to munadoko. ojutu fun ibojuwo awọn ayẹwo omi ayika ni awọn orilẹ-ede kekere ati ti owo-aarin.Ninu iṣẹ yii, a ṣe afihan wiwa elekitiroki ti awọn amplicon ti o gba lati Phi6 phage ti o ya sọtọ lati awọn ayẹwo omi adagun ti spiked (apo olokiki fun SARS-CoV-2), ni lilo ENIG lati pari PCB amọna lai dada iyipada.ibalopo. Idahun sensọ elekitiroki ni a ṣe afihan daradara fun awọn ajẹkù DNA meji ti o yatọ gigun (\({117}\,\hbox {bp}\) ati \({503}\,\hbox {bp}\)), ati awọn ipa ti awọn iyọ ni PCR titunto si awọn apopọ lori methylene blue (MB) -DNA awọn ibaraẹnisọrọ.Awọn abajade wa fihan pe ipari ti awọn ajẹkù DNA ṣe pataki ipinnu ifamọ elekitirokemika ati ṣe afihan ni iṣẹ yii pe agbara lati ṣawari awọn amplicon gigun lai si mimọ gel ti awọn ọja PCR jẹ pataki fun wiwọn ipo ti awọn ayẹwo omi.Ojutu adaṣe ni kikun fun awọn bode fifuye gbogun ti daradara.
Gbigbe ọlọjẹ ti omi ni a ti mọ bi eewu ilera gbogbo eniyan lati awọn ọdun 1940, pẹlu ẹri akọkọ ti gbigbe omi ti roparose ati jedojedo E1. Ajo Agbaye fun Ilera (WHO) ti pin ọpọlọpọ awọn aarun ọlọjẹ ti omi ti iwọntunwọnsi si pataki ilera ilera2. awọn ọna wiwa da lori awọn ilana orisun qPCR ti goolu, eyiti o ni itara pupọ ati ni pato, ṣugbọn nilo awọn oṣiṣẹ ti oye lati ṣe idanwo ni yàrá-yàrá nipa lilo awọn ohun elo gbowolori.Sibẹsibẹ, ni awọn orilẹ-ede kekere ati aarin-owo (LMICs) pẹlu awọn ohun elo to lopin, eniyan Ayẹwo ayẹwo ni o le ṣe iṣaaju lori ibojuwo ayẹwo omi ayika.Nitorina, awọn ọna idiyele kekere miiran ni a nilo fun alagbero, ibojuwo akoko gidi ti omi ati awọn ayẹwo omi idọti ni awọn orilẹ-ede kekere- ati arin-owo-owo bi awọn ikilọ tete ti awọn ajakale arun ti o nwaye, nitorina idabobo wọn lati awọn ipa ti eto-ọrọ ti ọrọ-aje ti o nira ti ajakaye-arun ọlọjẹ. dada ati hybridize nigbati ilana ti o baamu kan wa ninu apẹẹrẹ.Eyi le lẹhinna yipada si ifihan agbara nipasẹ ọpọlọpọ awọn ilana elekitirokemika nipa lilo awọn olulaja redox gẹgẹbi iron / ferrocyanide. A ti royin lati intercalate sinu DNA ti o ni ilopo meji (dsDNA) ni afikun si isọdọkan ti kii ṣe pato diẹ sii si DNA5,6 ti o ni ibatan. sensọ atunto5,6,7,8,9.Biotilẹjẹpe awọn intercalation ti MB to DNA jẹ nonspecific, ati awọn pato ti yi electrochemical sensọ da lori ibebe ti nw ti awọn alakoko ti a lo fun PCR tabi isothermal ampilifaya, o jẹ daradara ti baamu fun imuse gidi. -time electrochemical-based qPCR tabi fluorescence isothermal amplification bi yiyan si DNA fojusi wiwọn 9 .Ni ọkan iru imuse, Won et al.The dada ti goolu amọna ti a títúnṣe pẹlu 6-mercapto-1-hexanol (MCH) fun gidi-akoko. wiwọn ti PCR amplicons pẹlu MB lilo iyato pulse voltammetry (DPV) 9.Ni awọn igba miiran, Ramirez et al.Detection ti SARS-CoV-2 ni omi idọti nipasẹ RT-LAMP lenu nipa lilo MB pẹlu iboju-tejede electrodes.Platinum amọna ti tun ti a ti. ti a lo bi awọn amọna ipo ni aaye PCR microfluidic ti a ṣe apẹrẹ lati ṣe awari awọn amplicons ni awọn aati 8. Gbogbo awọn ijinlẹ wọnyi nilo iyipada dada ti awọn amọna, ti o tumọ si iṣelọpọ pọ si ati awọn idiyele iṣẹ nitori awọn ibeere ipamọ pataki fun iduroṣinṣin ti awọn amọna amọna wọnyi.
Sikematiki ti iṣan-iṣẹ fun wiwa elekitirokiki ti awọn amplicon ti a gba lati awọn patikulu gbogun ti ogidi ni awọn ayẹwo omi adagun.
Laipẹ a ṣe afihan imọ-kemikali elekitironi ti awọn amplicons SARS-CoV-2 pẹlu awọn amọna atẹwe iye owo kekere (PCB) ti o da lori DPV ati cyclic voltammetry (CV) ti o fa nipasẹ adsorption ti awọn eka MB-DNA lori dada ti awọn amọna ti ko yipada) awọn ayipada ni tente oke. lọwọlọwọ11.A jabo pe awọn ajẹkù DNA ti o gun (N1-N2, \({943}\, \hbox) ti a ṣe pẹlu lilo CDC-niyanju N1 siwaju ati awọn alakoko yiyipada N2 ni akawe pẹlu awọn ajẹkù kukuru {bp} \)) ṣe afihan laini to dara julọ ninu esi sensọ ( N1, \ (72 \, \ hbox {bp} \)) akoso nipa lilo N1 siwaju ati N1 yiyipada alakoko sets. Awọn wọnyi-ẹrọ ti wa ni royin nipa lilo DNA dilutions pese sile ni nuclease-free water.The Syeed ti a tun lo lati ri SARS-CoV. -2 amplicons ni awọn ayẹwo omi idọti afarawe (ti o gba nipasẹ gbigbe awọn ayẹwo RNA lapapọ pẹlu SARS-CoV-2 RNA) .Niwọn igba ti RNA jẹ ifaragba si irẹrun lakoko ipinya ati sisẹ isalẹ, 12,13 o nira lati pọ si awọn ajẹkù gigun pẹlu apẹẹrẹ oniruuru yii. Nitorinaa, iṣafihan imọ-ẹrọ elekitiroki ti amplicon SARS-CoV-2 ninu omi idọti jẹ opin si kukuru \(72 \, \ hbox {bp} \) N1 ajeku.
Ninu iṣẹ yii, a ṣe iwadii iṣeeṣe ti oye elekitirokemika-orisun ENIG PCB ti phage Phi6 ogidi ati ti o ya sọtọ lati awọn ayẹwo omi adagun (Fig. 1) .Phi6 phages jẹ afiwera ni iwọn (80-100 nm) si SARS-CoV-2 ati tun ni awọ ara ọra ati amuaradagba iwasoke. Fun awọn idi wọnyi, bacteriophage Phi6 jẹ aropọ olokiki fun SARS-CoV-2 ati awọn ọlọjẹ RNA pathogenic miiran ti enveloped14,15.RNA ti o ya sọtọ lati awọn patikulu phage ni a lo bi awoṣe fun iṣelọpọ cDNA ti o tẹle nipasẹ PCR lati gba awọn ajẹkù DNA meji ti 117 ati 503 awọn orisii ipilẹ ni ipari. Ti a fun ni ipenija ti amplifying \ (943 \, \ hbox {bp} \) N1-N2 awọn ajẹkù ninu iṣẹ iṣaaju wa, a fojusi awọn ajẹku gigun agbedemeji (\(117) \, \ hbox {bp} \) ati \(503 \, \ hbox {bp} \)), da lori awọn alakoko ti o wa. Idahun sensọ elekitiroki ni a ṣe iwadi ni ọna ṣiṣe lori iwọn ifọkansi jakejado (\({10}\,{10} \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}} \) si \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) Fun awọn ajẹkù mejeeji ni niwaju MB, ipa ti iyọ lori idahun sensọ ti jẹ afihan ati agbelebu nipasẹ awọn wiwọn spectrophotometric. Awọn ipa akọkọ ti iṣẹ yii jẹ bi atẹle:
Gigun ajẹkù DNA ati wiwa iyọ ninu ayẹwo ni ipa lori ifamọ.Awọn abajade wa fihan pe iṣẹ ṣiṣe elekitiroki da lori awọn ọna oriṣiriṣi ti ibaraenisepo ti MB, DNA, ati sensọ ninu idahun voltammetric, da lori ifọkansi DNA ati gigun, pẹlu awọn abọ gigun ṣe afihan ifamọ ti o ga julọ, botilẹjẹpe iyọ ni ipa odi lori awọn ibaraenisepo electrostatic laarin MB ati DNA.
Idojukọ DNA ṣe ipinnu ilana ti ibaraenisepo MB-DNA ni awọn amọna ti ko yipada A ṣe afihan pe awọn ọna oriṣiriṣi ti ibaraenisepo MB-DNA da lori ifọkansi DNA. {l}}}\), a ṣe akiyesi pe esi elekitirokemika lọwọlọwọ jẹ ipinnu nipataki nipasẹ adsorption ti MB-DNA lori elekiturodu, lakoko ti o wa ni awọn ifọkansi kekere Ni awọn ifọkansi DNA ti o ga, idahun lọwọlọwọ elekitirokemika jẹ ipinnu nipasẹ idinamọ sitaki ti redox iṣẹ-ṣiṣe nitori ifibọ MB laarin awọn orisii ipilẹ DNA.
ENIG PCB-orisun Electrochemical Sensing of Viral Nucleic Acids in Lake Water Awọn ayẹwo Awọn akiyesi ni a fọwọsi nipasẹ wiwa elekitiroki ti Phi6-fikun \(503 \, hbox {bp}\) DNA ajẹkù ti a gba lati awọn ayẹwo omi lati Powai Lake, IIT Mumbai Campus Abajade phage.
Iye owo kekere ti imuse ati agbara fun iṣọpọ sinu awọn eto ibojuwo adaṣe ni kikun, oligonucleotides tabi awọn aptamers lori awọn amọna pẹlu igbesi aye selifu to gun.
Phage Phi6 jẹ ọlọjẹ dsRNA ti o ni enveloped ti idile Cytoviridae ti o nfa Pseudomonas syringae. Jiini ti Phi6 phage wa ni irisi awọn ajẹkù 3: S (\ (2.95 \, hbox {Kb}\)), M (\ (4.07) \, \ hbox {Kb} \)) ati L (\ (6.37 \ , \ hbox {Kb} \)) 16,17.Niwọn igba ti Phi6 phage nfa ipalara BSL-1 Pseudomonas ti kii ṣe pathogenic, o jẹ ailewu lati lo. ati pe o le ni irọrun dagba ni yàrá-yàrá.Phage Phi6 ati ogun rẹ Pseudomonas syringae ni a ra lati Ile-iṣẹ Itọkasi Felix d'Herelle fun Awọn ọlọjẹ Bacterial, Ile-ẹkọ giga Laval, Canada (awọn nọmba katalogi ile-itọkasi jẹ HER-102 ati HER-1102, lẹsẹsẹ) .Phi6 phage ati agbalejo rẹ ti sọji bi a ti ṣe itọsọna nipasẹ ile-iṣẹ itọkasi. Phage Phi6 ti sọ di mimọ nipasẹ lysis awo ati elution lati gba awọn titers ikẹhin pẹlu \ (\ nipa 10 ^ {12} \, {\ hbox {PFU} / hbox { ml}} \) ( plaque forming units/ milliliters) RNA ti ya sọtọ lati awọn patikulu phage ti a sọ di mimọ nipa lilo Apo Isọdipo GenElute ™ Universal Total RNA (Sigma-Aldrich) ni ibamu si awọn itọnisọna olupese. Ni soki, idadoro phage Phi6 ti a sọ di mimọ \({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) jẹ́ lysed a sì kó lysate náà sórí àwọ̀n ọ̀wọ̀n kan láti jẹ́ kí RNA lè so mọ́ ọ̀wọ̀n ọ̀wọ̀n resini .Nigbana ni a ti yọ RNA naa jade ni ojutu elution \({ 50} \, {{\upmu \ hbox {l}}} \) ti a pese nipasẹ kit. Ṣe iṣiro ifọkansi ti RNA nipasẹ gbigba ni \ (260 \, \ hbox {nm}). RNA ti wa ni ipamọ ni awọn aliquots ni \ ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) titi o fi lo siwaju.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) Apo iScript cDNA Synthesis (Bio) -Rad Laboratories) ni a lo bi awoṣe fun iṣelọpọ cDNA ni atẹle awọn itọnisọna olupese. Ni kukuru, iṣesi iṣelọpọ cDNA ni awọn igbesẹ mẹta: priming ni \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) )\({5}\,{\hbox {min} }\) , yiyipada transcription ti \({20}\,{\hbox {min}}\) ni \({46}\,{^{\circ }\hbox {C}} \), ati yiyipada Agbohunsile wa ni \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) fun \({1}\,{\hbox {min) }} \) .Nigbati o ba n ṣiṣẹ lori 1% agarose gel, cDNA ṣe afihan awọn ẹgbẹ mẹta ti o ni ibamu si awọn ajẹkù RNA mẹta ti a reti (data ko han). lilo cDNA bi awoṣe fun PCR ni miniPCR® mini8 cycler:
Awọn alakoko fun \ (117 \, \ hbox {bp} \) ati \ (503 \, \ hbox {bp} \) ni ibamu si 1476-1575 nucleotides ti apakan M ati 458-943 nucleotides ti L apakan, lẹsẹsẹ acid .Gbogbo awọn ọja PCR ti o ni ilọsiwaju ni a ṣe itanna lori awọn gels agarose 1%, ati pe DNA ti o pọju ti a ti sọ di mimọ nipa lilo GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Fisher Scientific).
Adagun kan ti o wa ni ogba IIT Mumbai (Powai Lake, Powai, Mumbai) ni a lo lati fi awọn patikulu phage kun. awọn patikulu ti a daduro, lẹhinna Phi6 phage ti wa ni afikun. Ṣafikun \ ({1}\,{\hbox {ml}}\) ti \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} \) si \( {100} \ , {\ hbox {ml}} \) omi adagun ti a ti yo, ni \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\).Aliquot kekere kan je Ni ipamọ fun wiwọn fifuye gbogun ti nipasẹ plaque assay.A ṣe idanwo awọn ọna oriṣiriṣi meji lati ṣojumọ awọn patikulu ọlọjẹ Phi6 spiked: (1) ọna ojoriro adsorption aluminiomu hydroxide, 19 eyiti o jẹ ifọwọsi fun ifọkansi ti ọpọlọpọ awọn ọlọjẹ RNA enveloped lati awọn apẹẹrẹ ayika, ati (2) Awọn ọna ifọkansi ọlọjẹ ti o da lori polyethylene glycol (PEG) ni a mu lati Ikun omi et al.20 .Niwọn igba ti atunṣe atunṣe ti ọna orisun PEG ti a ri pe o dara ju ọna ti aluminiomu hydroxide, ọna ti o wa ni PEG ti a lo lati ṣojumọ awọn patikulu Phi6 lati awọn ayẹwo omi adagun.
Ọna PEG ti a lo ni atẹle yii: PEG 8000 ati \ (\ hbox {NaCl} \) ni a ṣafikun si awọn ayẹwo omi adagun-pikisi ti Phi6 lati gba 8 % PEG 8000 ati \ (0.2 \, \ hbox {M} \) \ ( \ hbox {NaCl}\) .Apejuwe won dabo lori a shaker \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\) ), lẹhinna ni centrifuged ni \(4700 \,\hbox {g}\) ni \({45}\,{\hbox {min}}\) . Danu supernatant naa ki o si da pellet pada ni \({1}\, {\hbox {ml}} \) ni supernatant kanna. Gbogbo spiking ati awọn adanwo ifọkansi kokoro ni a ṣe ni ẹẹmẹta. Lẹhin ifọkansi, aliquot kekere kan ti wa ni ipamọ fun wiwọn ṣiṣe imularada nipasẹ plaque assay.RNA ti ya sọtọ gẹgẹbi a ti ṣalaye tẹlẹ ati eluted ni kit-supplied elution buffer\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\) .Niwọn igbati ifọkansi RNA yoo yatọ lati apẹẹrẹ si apẹẹrẹ ni ẹẹmẹta, \({2}\,{\upmu \) hbox {l}} \) ti RNA ni a lo fun gbogbo awọn mẹtẹẹta laibikita ifọkansi cDNA ti iṣelọpọ ti awọn ayẹwo. ni a lo bi apẹrẹ fun \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR fun awọn yipo 35 lati mu iwọn \ (117 \, \ hbox {bp} \) pọ si ati \ (503 \, \ hbox {) bp} \) awọn ajẹkù. Awọn ayẹwo wọnyi jẹ aṣoju bi "1: 1", ie laisi fomipo. A ko si-awoṣe iṣakoso (NTC) ti ṣeto bi iṣakoso odi, nigba ti cDNA ti a ṣepọ nipa lilo RNA ti o ya sọtọ lati phage mimọ ti ṣeto soke. bi awoṣe fun iṣakoso rere (PC) .Quantitative PCR (qPCR) ni a ṣe ni ohun elo Stratagene Mx3000P RT-PCR nipa lilo Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies) . ti a ṣe apejuwe.Iwọn oju-ọna ọmọ (Ct) ti gba silẹ fun gbogbo awọn ayẹwo. Ni afikun, awọn ayẹwo ti a ti fomi jẹ \ ({1}\,{\upmu \ hbox {l}} \) nipa lilo cDNA ti fomi 1: 100 ni omi adagun ti a ti yo bi \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR fun cycles 35. Awọn ayẹwo wọnyi jẹ aṣoju bi “1:100″.
Awọn amọna PCB ti wa ni iṣelọpọ pẹlu lilo iṣowo ti o wa ni iye owo kekere Electroless Nickel Immersion Gold (ENIG) ilana laisi iwulo fun afikun goolu. ojutu piranha tabi sulfuric acid cyclic voltammetry ko ṣe iṣeduro nitori wọn le fa peeling ti fẹlẹfẹlẹ goolu tinrin (sisanra \ (\ isunmọ \) \ (100 \, \ hbox {nm } \)) ati ṣiṣafihan awọn ipele idẹ ti o wa labẹ ti o ni itara. si ipata 21, 22, 23, 24, 25. Nitorina, nu awọn elekitirodu pẹlu asọ ti ko ni lint ti o tutu pẹlu IPA. Apeere ti o yẹ lati ṣe idanwo ni a fi sii pẹlu \({50}\,{\upmu \hbox {M}) }\) MB ninu \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({1}\,{\hbox {h}}\) fun fifi sii rorun.Ninu ise wa tele , a ṣe akiyesi pe ifamọ ati laini ti sensọ ti ni ilọsiwaju nipasẹ jijẹ ifọkansi MB 11. Da lori awọn iṣapeye ti a royin ninu iṣẹ iṣaaju wa, a lo \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB awọn ifọkansi lati fi sii DNA ninu iwadi yii.Iwari elekitiroki ti DNA ti o ni ilọpo meji (ds-DNA) le ṣee waye nipa lilo anionic tabi cationic intercalators.Biotilẹjẹpe awọn intercalators anionic ṣe awari DNA pẹlu yiyan ti o dara julọ, wọn nilo isunmọ ni alẹ, ti o mu ki awọn akoko wiwa gun gun. Lori ni ọwọ miiran, awọn intercalators cationic gẹgẹbi MB nilo awọn akoko idabo kuru, ni isunmọ \({1}\,{\hbox {h}}\) fun wiwa elekitirokimiki ti ds-DNA6. Wiwọn kọọkan pẹlu fifun ayẹwo lati ṣe idanwo lori elekitirodu\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), leyin naa nu pẹlu akisa tutu IPA kan, ṣaaju ki o to tẹsiwaju pẹlu apẹẹrẹ miiran.ọkan wiwọn.Ọkọọkan ayẹwo ni idanwo lori 5 o yatọ si amọna ayafi ti bibẹkọ ti so.DPV ati CV wiwọn won ošišẹ ti lilo a PalmSens Sensit Smart potentiostat, ati PSTrace software ti a lo fun potentiostat iṣeto ni ati data akomora, pẹlu tente oke lọwọlọwọ isiro.Awọn wọnyi ni eto ti wa ni lilo. fun DPV ati awọn wiwọn CV:
DPV: Akoko Idogba = \ (8 \, \ hbox {s} \), Igbesẹ Foliteji = \ (3 \, \ hbox {mV} \), Pulse Voltage = \ (25 \, \ hbox {mV} \) , pulse duration = \(50\,\hbox {ms}\), ìwọn àyẹ̀wò = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: Akoko Idogba = \ (8 \, \ hbox {s} \), Igbesẹ Foliteji = \ (3 \, \ hbox {mV} \), Oṣuwọn Sweep = \ ({300} \, \ hbox {mV/ s) }\)
Awọn ṣiṣan ti o ga julọ ti a gba lati awọn voltammogram ti DNA ti o ni idapọ pẹlu \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503 \, \ hbox {bp} \) CV, (c) \ (117 \, \ hbox {bp} \) DPV, (d) \ (117 \, \ hbox {bp} \) CV.
DPV ati CV voltammograms ni a gba lori awọn amọna ENIG PCB \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB ti o ni idapọ pẹlu DNA (ni awọn ifọkansi ti 10–\({20}\,{\ hbox {ng) }/{\upmu \hbox {l}}} –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) fun \(503\,\hbox {bp}\)) .Voltammograms asoju wa ni aworan S1 ninu Alaye Afikun. Aworan 2 fihan awọn esi. ti DPV ati awọn wiwọn CV (ti o ga julọ lọwọlọwọ) nipa lilo awọn ọja PCR ti a sọ di mimọ.Ti a bawe si awọn wiwọn CV, awọn wiwọn DPV ṣe afihan ifamọ ti o ga julọ (lọwọlọwọ bi iṣẹ ti ifọkansi DNA) nitori awọn ṣiṣan capacitive isale ni awọn wiwọn CV tọju awọn ṣiṣan Faradaic 26. fun apoti kọọkan ti o wa ninu apoti apoti ni awọn wiwọn lati awọn amọna 5. Gbogbo awọn wiwọn lo awọn ọna kanna ti awọn amọna lati yago fun awọn aṣiṣe wiwọn nitori iyatọ-si-electrode. , gun (\(503 \, \ hbox {bp} \)) \, \ hbox {bp} \ akawe si \ (117)) ajẹkù. Eleyi jẹ ibamu pẹlu awọn ti ṣe yẹ aṣa ti elekiturodu adsorption royin ninu wa ti tẹlẹ iṣẹ. adsorption ti eka MB-DNA ṣe iranlọwọ fun gbigbe idiyele lori elekiturodu, eyiti o ṣe alabapin si ilosoke ti lọwọlọwọ tente oke. Awọn ijinlẹ miiran ti fihan ipa ti iwọn oligonucleotide ati ọkọọkan lori intercalation MB-DNA27,28,29,30.Guanin naa. -cytosine (GC) akoonu ti awọn amplicon meji (\ (117 \, \ hbox {bp} \) ati \ (503 \, \ hbox {bp} \)) jẹ isunmọ 50%, nfihan pe akiyesi Iyatọ jẹ nitori si ipari amplicon. Sibẹsibẹ, fun awọn ifọkansi DNA ti o ga julọ (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), fun \(503\,\hbox {bp} \) ati \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) fun \(117\,\hbox {bp}\)), a ṣe akiyesi awọn ampilifaya meji The tente oke sisan ti awọn subs ti wa ni dinku ni mejeji DPV ati CV wiwọn.Eyi jẹ nitori MB saturates ati intercalates laarin mimọ orisii ti DNA, Abajade ni steric idinamọ ti awọn redox aṣayan iṣẹ-ṣiṣe ti awọn reducible ẹgbẹ ni MB31,32.
在存在 \ (2 \, \ hbox {mM} \) \ ({\ hbox {MgCl }_2} \): (a) \ (503 \, \ hbox {bp} \) DPV, (b) \(503 \, \ hbox {bp} \) CV, (c) \ (117 \, \ hbox {bp} \) DPV, (d) \ (117 \, \ hbox {bp} \) CV.
Awọn iyọ ti o wa ninu awọn adapọ oluwa PCR dabaru pẹlu awọn ibaraenisepo electrostatic laarin MB ati DNA, nitorinaa nipa fifi \ (2 \, \ hbox {mM} \) \ (\ hbox {MgCl }_2 \) kun pẹlu \({50} \,{\) upmu \hbox {M}}\) ọja ti a sọ di mimọ-MB MB lati ṣe iwadi ipa iyọ lori ibaraenisepo MB-DNA. Gẹgẹbi a ṣe han ni Nọmba 3, a ṣe akiyesi pe fun awọn ifọkansi DNA ti o ga julọ (\(>{2}\,{\) hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}} \) (503\,\hbox {bp }\) àti \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}} awọn ifọkansi DNA kekere, afikun iyọ dinku ifamọ pupọ, eyiti ko ni iyipada pataki ninu lọwọlọwọ pẹlu ifọkansi DNA.Awọn ipa odi ti o jọra ti iyọ lori awọn ibaraenisepo MB-DNA ati intercalation ti sọ tẹlẹ nipasẹ awọn oniwadi miiran33,34.\(\ hbox { Mg}^{2+}\) cations sopọ mọ egungun fosifeti odi ti DNA, nitorinaa idilọwọ ibaraenisepo electrostatic laarin MB ati DNA. Ni awọn ifọkansi DNA ti o ga julọ, idinamọ steric ti awọn MBs redox ti nṣiṣe lọwọ awọn abajade ni awọn ṣiṣan tente oke kekere, nitorinaa awọn ibaraenisepo electrostatic maṣe ni ipa ni pataki idahun sensọ. Koko bọtini ni pe biosensor yii dara julọ lati ṣawari awọn ifọkansi DNA ti o ga julọ (ṣọwọn \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) tabi ga julọ), fun ṣiṣe adaṣe adaṣe ni kikun ti awọn ayẹwo omi ayika, nibiti iwẹnumọ gel ti awọn ọja PCR le ma ṣee ṣe.
Àgbègbè tí ó wà lábẹ́ ìséra gbígbẹ́ fún ìwọ̀n ìgbì ìgbì 600–700 \(\hbox {nm}\) fún oríṣiríṣi ìfojúsùn ti DNA tí a kópọ̀ pẹ̀lú \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) pelu ati laisi iyo (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2 \)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) pelu ati laisi iyo (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2 \)).\({0}\,{\hbox {pg}/) {\upmu \hbox {l}}} \) Awọn ifọkansi DNA ti o baamu \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) Awọn ayẹwo MB Ko si DNA.
Lati mọ daju awọn abajade ti o wa loke, a ṣe awọn wiwọn opiti nipa lilo UV/Vis spectrophotometer (Thermo Scientific Multiskan GO), awọn apẹẹrẹ \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) ni a lo fun ọkọọkan. Measurement. Ibuwọlu gbigba dinku pẹlu ifọkansi DNA ti o pọ si, bi a ṣe le rii lati aṣa ti agbegbe ti o wa labẹ ọna gbigbe fun iwọn igbi gigun \ (600 \, \ hbox {nm} \) si \ (700 \, \ hbox {) nm} \) , bi a ṣe han ni aworan 4 (aworan gbigba ti o han ni aworan S3 ni Alaye Afikun).Fun awọn ayẹwo pẹlu awọn ifọkansi DNA ti o kere ju \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox) {l}}} \), ko si iyato pataki ninu gbigba laarin DNA ti o ni DNA ati awọn ayẹwo MB-nikan (fun \ (503 \, \ hbox {bp} \) ati \ (117 \, \ hbox {bp}\) ) awọn ajẹkù gigun), ti o nfihan isansa ti idinaduro steric ti MB redox-active.Ni awọn ifọkansi DNA ti o ga julọ, a ṣe akiyesi idinku diẹdiẹ ninu ifihan agbara gbigba ati ki o ṣe akiyesi idinku diẹ ninu ifasilẹ ni iwaju iyọ.Awọn abajade wọnyi ni a sọ si molikula. awọn ibaraẹnisọrọ ati idinamọ sitẹriki pẹlu ipilẹ ipilẹ ni awọn hybrids DNA. Awọn abajade wa ni ibamu pẹlu awọn iroyin ninu awọn iwe-iwe lori awọn iwadi spectroscopic ti MB-DNA intercalation ti o ṣepọ hypochromaticity pẹlu awọn ipele agbara ti o dinku ni \ (\ pi \) - \ (\ pi ^ * \ ) awọn iyipada itanna nitori intercalation Layers 36, 37, 38.
Agarose gel electrophoresis ti phage Phi6: PCR awọn ọja ti ipari \ (117 \, \ hbox {bp} \) ati \ (503 \, \ hbox {bp} \) lati awọn ayẹwo omi adagun.M-DNA asami;NTC-ko si-awoṣe iṣakoso, awọn alakoko ti o ni awọn amplicon ti o baamu;Iṣakoso rere PC;1, 2, 3-undiluted (1: 1) spiked lake water samples ni triplicate. A iye wa ni han ni \ (\ nipa 50 \, \ hbox {bp} \) nitori awọn oligonucleotides ti ko lo ninu \ (503 \, \) hbox {bp} \) ona.
A ṣe ayẹwo iwulo ti sensọ nipa lilo awọn ayẹwo omi Powai Lake ti a fiwe pẹlu Phi6 phage. Awọn ifọkansi RNA ti o ya sọtọ lati awọn ayẹwo omi phage-spiked wa lati 15.8 – \ ({19.4} \, {\upmu \ hbox {g}/\ hbox { ml}} \), lakoko ti awọn ti o ya sọtọ si awọn idaduro phage mimọ RNA naa ni ifoju-lati jẹ \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) pẹlu ṣiṣe imularada ti isunmọ 1 % RNA ti yi pada si cDNA ati pe a lo bi awoṣe fun PCR ati qPCR. Iwọn ọja jẹ iṣeduro nipasẹ agarose gel electrophoresis (Figure 5) ṣaaju idanwo pẹlu sensọ. Awọn ayẹwo wọnyi kii ṣe jeli ti a wẹ ati nitorina ni gbogbo awọn irinše ti PCR bi daradara bi awọn amplicons ti iwulo.Awọn iye Ct ti o gbasilẹ lakoko qPCR (Table 1) ni a fihan lati ṣe ibamu pẹlu ifọkansi ti RNA ti o ya sọtọ lati awọn ayẹwo omi spiked ti o baamu. Iye Ct ṣafihan nọmba awọn iyipo ti o nilo fun ifihan agbara Fuluorisenti si kọja ẹnu-ọna tabi ifihan agbara lẹhin. Awọn iye Ct ti o ga julọ tọka si awọn ifọkansi awoṣe kekere ati ni idakeji. Awọn iye Ct ti awọn ayẹwo NTC ga bi a ti ṣe yẹ. Iyatọ ninu \ (\ isunmọ 3 \) awọn iye Ct laarin iṣakoso rere ati ayẹwo ayẹwo siwaju sii tọkasi pe ayẹwo idanwo kọọkan ni iwọn 1% awoṣe ti a fiwe si iṣakoso rere. A ti sọrọ tẹlẹ pe awọn amplicons gigun ti o yorisi ifamọ ti o dara julọ.Amplification ti awọn ajẹkù gigun ti o ya sọtọ lati awọn ayẹwo ayika orisirisi jẹ nija fun awọn alailanfani. ti ifọkansi gbogun ti kekere ati ibajẹ RNA. Bibẹẹkọ, pẹlu imudara ọlọjẹ wa ati ilana imudara PCR, a ni anfani lati pọsi ni aṣeyọri \ (503 \, \ hbox {bp} \) ajẹkù fun imọ imọ-ẹrọ elekitiroki.
Nọmba 6 ṣe afihan awọn abajade sensọ elekitirokemika ti \ (503 \, \ hbox {bp} \) amplicon ajẹkù, mejeeji ni lilo cDNA ti ko ni dilu bi awoṣe (1: 1) ati 100-fold ti fomi cDNA gẹgẹbi awoṣe (1: 100) ti a ṣe PCR , akawe si NTC ati PC (wo Nọmba S4 ni Alaye Afikun fun awọn voltammograms aṣoju) .Apoti kọọkan ninu apoti apoti ni Nọmba 6 ni awọn wiwọn lati awọn ayẹwo mẹta ni awọn amọna 5. Awọn amọna kanna ni a lo lati wiwọn gbogbo awọn ayẹwo lati yago fun awọn aṣiṣe nitori elekiturodu. -to-electrode variation.Ti a bawe si awọn wiwọn CV, awọn wiwọn DPV ṣe afihan ipinnu to dara julọ lati ṣe iyatọ idanwo ati awọn ayẹwo PC lati awọn NTCs nitori pe, bi a ti sọ tẹlẹ, awọn ṣiṣan Faradaic ti wa ni ipamọ nitori awọn iṣan agbara agbara lẹhin ni igbehin.Fun awọn amplicons to gun, a ṣe akiyesi pe. iṣakoso odi (NTC) yorisi CV ti o ga julọ ati awọn ṣiṣan tente oke DPV ti o ni ibatan si iṣakoso rere, lakoko ti awọn ayẹwo idanwo rere ati ailopin fihan iru awọn giga giga giga ti awọn ṣiṣan oke DPV. ) ayẹwo ayẹwo ati PC le ṣe ipinnu ni kedere lati inu iṣelọpọ sensọ fun apẹẹrẹ NTC, nigba ti ipinnu fun 1: 100 ti a ti fomi ni o kere ju ti o sọ. (awọn ọna ti ko han ni Figure 5), ati awọn ti o baamu DPV ati CV tente ṣiṣan jẹ iru awọn ti a reti fun NTC. Awọn esi fun \ (117 \, \ hbox {bp} \) ajẹkù ti han ni Afikun Alaye. Awọn odi iṣakoso ti fa idahun elekitirokemika kan lati inu sensọ PCB nitori ipolowo ti MB ọfẹ lori elekiturodu ati ibaraenisepo MB pẹlu alakoko oligonucleotide. lọwọlọwọ tente oke ti ayẹwo idanwo ni akawe si lọwọlọwọ tente ti o gba nipasẹ iṣakoso odi lati ṣaṣeyọri iyatọ (ibaramu) wiwọn39,40 lati ṣe lẹtọ apẹẹrẹ idanwo bi rere tabi odi.
(a) DPV, ati (b) CV tente oke lọwọlọwọ fun wiwa elekitirokemika ti \ (503 \, \ hbox {bp} \) awọn ajẹkù ni awọn ayẹwo omi adagun. rere idari (PC).
Awọn awari wa ṣe apejuwe awọn ọna ṣiṣe ti o yatọ ti o ni ipa lori iṣẹ ti awọn sensọ elekitirokemika fun awọn amplicons ti awọn gigun oriṣiriṣi fun awọn DNA oriṣiriṣi, pẹlu awọn ifọkansi ti a rii daju nipasẹ awọn wiwọn opiti nipa lilo spectrophotometer UV/Vis. Awọn akiyesi wa ṣe afihan oye pe DNA gun gun to \ (\ approx \) \(500 \, \ hbox {bp} \) ni a le rii pẹlu ifamọ ti o ga julọ ati pe wiwa iyọ ninu apẹẹrẹ kii ṣe ifọkansi DNA ti o ni ipa lori ifamọ ti o ga julọ (ṣọwọn \({\hbox {ng}/{\upmu) \hbox {l}}}A ṣe akiyesi pe DPV pese ipinnu to dara julọ, nitori lọwọlọwọ capacitive lọwọlọwọ tun ni ipa lori wiwọn CV, ti o jẹ ki o ni itara.
Imudara ti awọn ajẹkù gigun da lori iduroṣinṣin ti RNA genomic gbogun ti.Ọpọlọpọ awọn ijinlẹ ti fihan pe imudara ti awọn ajẹkù gigun kii ṣe nigbagbogbo daradara nitori ibajẹ ti RNA ni agbegbe ati agbara fun splicing lakoko ipinya11,41,42,43,44 .A ṣe akiyesi pe ọna ifọkansi ọlọjẹ ti o da lori PEG jẹ imunadoko diẹ sii ni ifọkansi phage Phi-6 spiked ni awọn ayẹwo omi adagun ju ọna ifọkansi ọlọjẹ ti o da lori aluminiomu hydroxide. Agbara lati ṣe awari awọn ajẹku DNA gigun fihan lati bori ibeere fun multiplex PCR lati amplify ọpọ kikuru ipari awọn awoṣe ki o si din awọn seese ti agbelebu-pato.
Awọn ayẹwo ti isedale ko to, nitorinaa iwulo lati ṣe apẹrẹ biosensor ti o nilo awọn ayẹwo kekere fun idanwo. Awọn amọna ENIG PCB ti a lo ninu iwadi yii nilo nikan \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) ) awọn ayẹwo fun idanwo lati bo agbegbe ti o munadoko ti awọn amọna. Ni afikun, elekiturodu kanna le tun lo lẹhin mimọ ṣaaju ki o to pin apẹẹrẹ atẹle. ati kemikali ti a lo nigbagbogbo.Niwọn igba ti elekiturodu kọọkan n san nipa $0.55 (tabi INR 40) lati ṣe iṣelọpọ, biosensor yii le jẹ yiyan ti o munadoko-doko si awọn imọ-ẹrọ wiwa ti o wa tẹlẹ.Table 2 ṣe afiwe iṣẹ yii pẹlu awọn sensọ miiran ti a royin ninu awọn iwe-kikọ fun pipẹ. Awọn ajẹkù DNA ni awọn ayẹwo oniruuru.
Fun pe awọn ilana wiwa elekitirokemika ti o da lori MB da lori pato PCR, aropin pataki ti ọna yii ni agbara fun imudara ti kii ṣe pato ni awọn apẹẹrẹ oriṣiriṣi bii omi idọti ati omi adagun tabi lilo awọn alakoko mimọ-kekere.Lati mu ifamọ ti Awọn ọna wiwa elekitirokemika fun wiwa DNA ti awọn ọja PCR ti a ko sọ di mimọ nipa lilo awọn amọna ENIG PCB ti ko yipada, o jẹ dandan lati ni oye awọn aṣiṣe ti o dara julọ ti a ṣafihan nipasẹ awọn dNTPs ti ko lo ati awọn alakoko, ati lati mu awọn ipo ifasẹ pọ si ati awọn ilana idanwo. Ibeere atẹgun (BOD) ti ayẹwo omi le tun nilo lati ni iwọn lati le mu ilọsiwaju ti wiwọn naa dara.
Ni ipari, a dabaa sensọ elekitirokemika ENIG PCB ti o ni iye owo kekere fun wiwa ọlọjẹ ni awọn apẹẹrẹ ayika (omi adagun omi).Laibikita awọn amọna oligonucleotide ti ko ni iṣipopada tabi awọn sobusitireti aṣa fun sensọ DNA ti o nilo ibi ipamọ cryogenic lati ṣetọju ifamọ, 53,54 ilana wa nlo PCB ti ko yipada. awọn amọna pẹlu igbesi aye selifu gigun ati pe ko si awọn ibeere ibi ipamọ kan pato ati nitorinaa o dara fun idagbasoke awọn iṣeduro wiwọn pẹlu adaṣe adaṣe adaṣe ti a fi ranṣẹ ni awọn LMICs.The biosensor nlo ilamẹjọ DNA-intercaating redox dyes (MB) fun wiwa iyara ti awọn amplicons afojusun.The nonspecific amplification ti o wọpọ ni awọn ayẹwo ayika n dinku iyasọtọ ti ọna imọ-imọran yii nitori idinamọ ti ko ni iyasọtọ ti MBs si awọn oligonucleotides nikan- ati meji-stranded.Nitorina, iyasọtọ ti idanwo yii da lori iṣapeye ti awọn alakoko ati awọn ipo iṣeduro PCR. Ni afikun, CV CV. ati awọn ṣiṣan ti o ga julọ ti DPV ti a gba lati awọn ayẹwo idanwo yẹ ki o tumọ ni ibatan si awọn idahun ti a gba lati iṣakoso odi (NTC) fun idanwo kọọkan.Awọn apẹrẹ sensọ elekitirokemika ati awọn ọna ti a gbekalẹ ninu iṣẹ yii ni a le ṣepọ pẹlu awọn autosamplers lati ṣe agbekalẹ adaṣe ni kikun ati kekere. Ojutu idiyele ti o le gba ati itupalẹ awọn ayẹwo ati gbejade awọn abajade lailowadi pada si yàrá-yàrá.
Cashdollar, J. & Wymer, L. Awọn ọna fun ifọkansi akọkọ ti awọn ọlọjẹ lati inu awọn ayẹwo omi: atunyẹwo ati iṣiro-meta ti awọn iwadii to ṣẹṣẹ.J.Ohun elo.microorganism.115, oju-iwe 1-11 (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL Waterborne virus: Awọn idena si omi mimu ailewu.PLoS Pathogens.11, E1004867 (2015).
Shrestha, S. et al. Wastewater ajakalẹ-arun fun iwo-kakiri iwọn-nla ti iye owo ti COVID-19 ni awọn orilẹ-ede kekere- ati aarin-owo oya: awọn italaya ati awọn anfani.Omi 13, 2897 (2021).
Palecek, E. & Bartosik, M. Nucleic acid electrochemistry.Chemical.Rev.112, 3427-3481 (2012).
Tani, A., Thomson, AJ & Butt, JN Methylene blue gẹgẹbi oluyatọ elekitirokimiki ti awọn oligonucleotides ti o ni ẹyọkan ati ti o ni ilopo-meji ti ko ni iyipada lori awọn sobusitireti goolu. Oluyanju 126, 1756-1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ Comparison of Cation and Anion Intercalators for Electrochemical Transduction of DNA Hybridization by Long-Range Electron Transfer.Electrochemistry.comminicate.6, 648-654 (2004).
Wong, EL & Gooding, JJ Gbigbe agbara nipasẹ DNA: a yan elekitirokemika DNA biosensor.anus.Chemical.78, 2138-2144 (2006).
Fang, TH et al.Real-akoko PCR microfluidic ẹrọ pẹlu wiwa elekitirokemika nigbakanna.biological sensor.Bioelectronics.24, 2131-2136 (2009).
Win, BY et al.Iwadi ilana ṣiṣe ifihan ati iṣeduro iṣẹ ti eto PCR gidi-akoko elekitirokemika ti o da lori ibaraenisepo ti buluu methylene pẹlu DNA.Analyst 136, 1573-1579 (2011).
Ramirez-Chavarria, RG et al.Loop-mediated isothermal amplification-orisun elekitirokemika sensọ fun wiwa ti sars-cov-2 ni omi idọti awọn ayẹwo.J.Ayika.Chemical.Britain.10, 107488 (2022).
Kumar, M. et al.Electrochemical sensing of SARS-CoV-2 amplicons with PCB electrodes.The sensor is activated.B Chemistry.343, 130169 (2021).
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. & Yoshida, H. Iwari daradara ti SARS-CoV-2 RNA ni ida ti o lagbara ti wastewater.science.general ayika.763, 144587 (2021).
Alygizakis, N. et al.Analytical Awọn ọna fun SARS-CoV-2 erin ni Wastewater: Ilana ati ojo iwaju Irisi.TraC trending anal.Chemical.134, 116125 (2020).
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. & Kashtan, N. Iwalaaye ti bacteriophage enveloped Phi6 (a surrogate fun SARS-CoV-2) ni evaporated itọ droplets nile lori gilasi roboto.science.Rep.10, 1–10 (2020).
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ Ayika itẹramọṣẹ ti a SARS-CoV-2 surrogate (Phi6) ni free-alãye amoeba.J.Omi Health 20, 83 (2021).
Mindich, L. Apoti kongẹ ti awọn ajẹkù genomic mẹta ti RNA bacteriophage-meji-stranded \ (\varphi \) 6.microorganism.Moore.biology.Rev.63, 149-160 (1999).
Pirttimaa, MJ & Bamford, Atẹle eto ti DH RNA phage \ (\ varphi \) agbegbe iṣakojọpọ. RNA 6, 880-889 (2000).
Bonilla, N. et al.Phages lori Tẹ ni kia kia - Ilana ti o yara ati lilo daradara fun ṣiṣe awọn akojopo yàrá yàrá ti awọn bacteriophages.PeerJ 4, e2261 (2016).
Akoko ifiweranṣẹ: Oṣu Karun-27-2022