Nature.com-a gireniňiz üçin sag boluň. Ulanylýan brauzer wersiýaňyzda CSS-iň çäkli goldawy bar. Iň oňat tejribe üçin täzelenen brauzeri ulanmagy maslahat berýäris (ýa-da Internet Explorer-de gabat geliş tertibini öçüriň). Şol aralykda, üpjün etmek üçin dowamly goldaw, sahypany stil we JavaScript bolmazdan görkezeris.
COVID-19 pandemiýasynyň başyndan bäri daşky gurşaw nusgalaryna gözegçilik etmegiň ähmiýeti ýokary baha berildi we qPCR esasly usullar gymmat bolsa-da, altyn standartdan peýdalanyp käbir gözegçilik işleri alnyp barylýar. Elektrokimiki DNK biosensorlary tygşytly bolup biler pes we orta girdejili ýurtlarda daşky gurşawyň suw nusgalaryna gözegçilik etmek üçin çözgüt. Bu işde, ENIG ulanyp, köl suwunyň nusgalaryndan izolirlenen Phi6 fazasyndan alnan amplikonlaryň elektrokimiki tapylyşyny görkezýäris. PCB elektrodlaryny ýerüsti üýtgetmän tamamlamak.jyns. Elektrokimiki datçigiň jogaby dürli uzynlykdaky iki DNK bölegi (\ ({117} \, \ hbox {bp} \) we \ ({503} \, \ hbox {bp} \)) we PCR ussasyndaky duzlaryň metilen gök (MB) -DNA täsirine garyşmagy. Biziň netijelerimiz, DNK bölekleriniň uzynlygynyň elektrokimiki duýgurlygy ep-esli kesgitleýändigini we bu işde PCR önümlerini gel arassalamazdan uzyn amplikonlary ýüze çykarmak ukybynyň bardygyny görkezýär. suw nusgalaryny situ ölçemek üçin möhümdir.Wirus ýükleri üçin doly awtomatlaşdyrylan çözgüt gowy.
Suwdan wirus ýokaşmagy, poliomielit we gepatit E1-den suw bilen ýokaşmagynyň ilkinji subutnamasy bilen 1940-njy ýyllardan bäri jemgyýetiň saglygyna howp hökmünde bellidir. Bütindünýä saglygy goraýyş guramasy suwdan geçýän wirusly patogenleri orta we ýokary saglyk ähmiýetli toparlara böldi. Adaty wirus ýüze çykarmak usullary ýokary duýgur we aýratyn, ýöne gymmat bahaly gurallary ulanyp laboratoriýada synagdan geçirmegi talap edýän altyn standart qPCR esasly usullara daýanýar. Şeýle-de bolsa, çäkli serişdeleri bolan pes we orta girdejili ýurtlarda (LMIC) synag synaglary daşky gurşawyň suw nusgalaryna gözegçilik etmekden ileri tutulmagy ähtimal. Şonuň üçin pes we orta girdejili ýurtlarda ýüze çykýan keselleriň ýüze çykmagy barada öňünden duýduryş hökmünde pes we orta girdejili ýurtlarda suw we hapa suwlaryň nusgalaryny durnukly, hakyky wagtda gözegçilik etmek üçin alternatiw arzan usullar zerurdyr, şeýlelik bilen olary wirus pandemiýasynyň agyr sosial-ykdysady täsirlerinden goraýar. Nuklein kislotalary üçin az çykdajyly elektrohimiki biosensorlar bu kanagatlandyrylmadyk zerurlygy çözmek üçin geljegi uly potensial çözgüt berip biler. Bu DNK biosensorlarynyň köpüsi goşmaça DNK zolaklarynyň elektrodda hereketsiz bolmagy bilen işleýär. nusgada gabat gelýän yzygiderlilik ýüze çykanda ýerüsti we gibridleşdiriň. Soňra kaliý demir / ferrosýanid ýaly redoks araçylaryny ulanyp, dürli elektrokimiki usullar arkaly signala öwrülip biler. Metilen gök (MB) şeýle redoks-işjeň molekuladyr. iki hatar DNK (dsDNA) bilen bir hatar DNK bilen has kesgitli baglanyşygyndan başga-da birleşjekdigi habar berildi. MB-DNK toplumlaryny emele getirýän MB-leriň biri-birine bagly tebigaty, birnäçe elektrokimiki DNK-da redoks araçylary hökmünde meşhur saýlanýar. datçigiň konfigurasiýalary5,6,7,8,9. MB-nyň DNK bilen interkalýasiýasy belli däl bolsa-da, bu elektrokimiki datçigiň aýratynlygy PCR ýa-da izotermiki güýçlendirmek üçin ulanylýan primerleriň arassalygyna bagly bolsa-da, hakyky durmuşa geçirmek üçin amatlydyr DNK konsentrasiýasyny ölçemegiň alternatiwasy hökmünde elektrokimiki esasly qPCR ýa-da floresan izotermiki güýçlendirme 9 .Bu amallaryň birinde Won we başgalar. Altyn elektrodlaryň üstü hakyky wagtda 6-merkapto-1-heksanol (MCH) bilen üýtgedildi. Differensial impuls woltammetri (DPV) ulanyp PCR amplikonlaryny ölçemek 9. Beýleki ýagdaýlarda Ramirez we başgalar. Ekranda çap edilen elektrodlar bilen MB ulanyp, RT-LAMP reaksiýasy bilen hapa suwlarda SARS-CoV-2 kesgitlemek. Platin elektrodlary hem boldy. reaksiýalar wagtynda amplikonlary elektrokimiki taýdan kesgitlemek üçin döredilen mikrofliid PCR platformasyndaky situ elektrodlarda bolşy ýaly ulanylýar .Bu gözlegleriň hemmesi, bu işleýän elektrodlaryň durnuklylygy üçin ýörite saklaýyş talaplary sebäpli önümçiligiň we iş çykdajylarynyň ýokarlanmagyny göz öňünde tutup, elektrodlaryň ýerüsti üýtgedilmegini talap edýär.
Köl suwunyň nusgalarynda konsentrirlenen wirus bölejiklerinden alnan amplikonlary elektrohimiki kesgitlemek üçin iş prosesiniň shemasy.
Recentlyakynda DPV we MB-DNA toplumlarynyň kodlanmadyk elektrodlaryň üstünde adsorbsiýasy netijesinde döredilen arzan bahaly çap edilen elektron tagtasy (PCB) elektrodly SARS-CoV-2 amplikonlaryň elektrohimiki duýgurlygyny görkezdik. häzirki11.CDC maslahat berilýän N1 öňe we gysga bölekler bilen deňeşdirilende N2 ters primerleri ulanyp döredilen has uzyn DNK bölekleriniň (N1-N2, \ ({943} \, \ hbox)) datçigiň jogabynda has gowy çyzyklydygyny görkezýäris; (N1, \. Simulýasiýa hapa suwlarynyň nusgalarynda -2 amplikon (umumy RNK nusgalaryny SARS-CoV-2 RNA bilen köpeltmek arkaly alnan) .RK izolýasiýa we aşaky akymda gaýtadan işlenende gyrkylma ähtimallygy sebäpli, 12,13 bu birmeňzeş nusga bilen has uzyn bölekleri güýçlendirmek kyn. Şonuň üçin SARS-CoV-2 amplikonyň elektrohimiki duýgurlygynyň hapa suwlarda görkezilmegi gysga \ (72 \, \ hbox {bp} \) N1 bölegi bilen çäklenýär.
Bu işimizde, köl suwunyň nusgalaryndan konsentrirlenen we izolirlenen Phi6 tapgyrynyň ENIG PCB esasly elektrokimiki duýgurlygynyň mümkinçiligini derňedik .Phi6 tapgyrlary ululygy (80-100 nm) bilen SARS-CoV-2 we deňeşdirilýär Şeýle hem lipid membranasy we süýümli belok bar. Şol sebäplere görä, Phi6 bakteriofagy SARS-CoV-2 üçin meşhur surogatdyr we beýleki bölejik patogen RNK wiruslary14,15.RNA faza bölejiklerinden izolirlenen CDNA sintezi üçin şablon hökmünde ulanyldy. Uzynlygy 117 we 503 esasy jübütden iki sany DNK bölek almak üçin PCR. Öňki işimizde \ (943 \, \ hbox {bp} \) N1-N2 böleklerini güýçlendirmek meselesini beriň, aralyk uzynlyk böleklerini nyşana alýarys (\ (117) Bar bolan primerlere esaslanýan \, \ hbox {bp} \) we \ (503 \, \ hbox {bp} \)). Elektrokimiki datçigiň jogaby giň konsentrasiýa aralygynda yzygiderli öwrenildi (\ ({10} \, { \ hbox {pg} / {\ upmu \ hbox {l}}} \) to \ ({20} \, {\ hbox {ng} / {\ upmu \ hbox {l}}} \)) Iki bölek üçin MB-iň bolmagy, duzuň datçigiň täsirine täsiri spektrofotometrik ölçegler bilen häsiýetlendirildi we biri-biri bilen tassyklandy. Bu işiň esasy goşantlary aşakdakylar:
DNK bölekleriniň uzynlygy we nusgada duzuň bolmagy duýgurlyga güýçli täsir edýär.Netijelerimiz, elektrokimiki işjeňligiň DNK konsentrasiýasyna we uzynlygyna baglylykda MB, DNK we datçigiň woltammetrik täsiriniň dürli mehanizmlerine baglydygyny görkezýär, uzyn bölekler has ýokary duýgurlygy görkezýär, duzuň elektrostatik täsirine ýaramaz täsir edýär MB we DNK.
DNK konsentrasiýasy kodlanmadyk elektrodlarda MB-DNK täsiriniň mehanizmini kesgitleýär MB-DNK täsiriniň dürli mehanizmleriniň DNK konsentrasiýasyna baglydygyny görkezýäris. DNK konsentrasiýalarynda az mukdarda \ ({\ hbox {ng} / {\ upmu \ hbox {} DNK esasy jübütleriň arasynda MB goýulmagy sebäpli işjeňlik.
ENIG PCB esasly wirus nuklein kislotalarynyň köl suw nusgalarynda elektrohimiki duýgurlygy Gözegçilikler, Powai kölüniň IIT Mumbay şäherçesindäki suw nusgalaryndan alnan Phi6 goşulan \ (503 \, \ hbox {bp} \) DNK bölekleriniň elektrohimiki tapylmagy bilen tassyklandy. Netije tapgyry.
Dolandyryşyň arzan bahasy we doly awtomatiki gözegçilik ulgamlaryna, oligonukleotidlere ýa-da uzak möhletli elektrodlarda aptamerlere integrasiýa mümkinçiligi.
Phi6 Phi6, Pseudomonas şprisine ýokaşýan Cytoviridae maşgalasynyň ýapyk dsRNA wirusydyr. Phi6 tapgyrynyň genomy 3 bölek görnüşinde bar: S (\ (2.95 \, \ hbox {Kb} \)), M (\ (4.07) \, \ hbox {Kb} \)) we L (\ (6.37 \, \ hbox {Kb} \)) 16,17. Phi6 tapgyry patogen däl BSL-1 Pseudomonas ştamyna ýokaşanlygy sebäpli, ulanmak ygtybarlydyr laboratoriýada aňsatlyk bilen ösdürilip bilner. Phi6 Phi6 we onuň eýesi Pseudomonas şpris, Felix d'Herelle bakteriýa wiruslary salgylanma merkezinden, Kanadanyň Laval uniwersiteti (salgy merkeziniň katalog belgileri degişlilikde HER-102 we HER-1102) satyn alyndy. .Phi6 tapgyry we onuň eýesi salgylanma merkeziniň görkezmesi boýunça janlandy. Phi6 Phi6, \ (\ takmynan 10 ^ {12} \, {\ hbox {PFU} / \ hbox {) bilen soňky titrleri almak üçin plastinka lizasy we arassalama bilen arassalandy. ml}} \). 100} \, {{\ upmu \ hbox {} Kit bilen üpjün edilen 50} \, {{\ upmu \ hbox {l}}} \). RNK-nyň konsentrasiýasyny \ (260 \, \ hbox {nm} \) derejesinde siňdiriň. ({-80} \, {^ {\ circ} \ hbox {C}} \) mundan beýläk ulanylýança. \ ({2} \, {\ upmu \ hbox {g}} \) iScript cDNA sintez toplumy (Bio -Rad Laboratories) öndürijiniň görkezmesine laýyklykda cDNA sintezi üçin şablon hökmünde ulanyldy. Gysgaça aýdylanda, cDNA sintez reaksiýasy 3 ädimden ybarat: \ ({25} \, {^ {\ circ} \ hbox {C}} \ ) \ ({5} \, {\ hbox {min}} \), \ ({20} \, {\ hbox {min}} \) tersine transkripsiýasy ({46} \, {^ {\ circ } \ hbox {C}} \), we tersine Diktofon \ ({95} \, {^ {\ circ} \ hbox {C}} \) \ ({1} \, {\ hbox {min %}). miniPCR® mini8 termiki welosipedinde PCR üçin şablon hökmünde cDNA ulanmak:
\ (117 \, \ hbox {bp} \) we \ (503 \, \ hbox {bp} \) üçin desgalar M segmentiniň 1476-1575 nukleotidlerine we L segmentiniň 458-943 nukleotidlerine laýyk gelýär. .Her güýçlendirilen PCR önümleri 1% agarose jelinde elektroforez edildi we güýçlendirilen maksatly DNK GeneJET Gel çykarmak toplumy (Termo Fisher Scientific) arkaly arassalandy.
IIT Mumbay şäherçesindäki bir köl (Powai köli, Powai, Mumbay) faj bölejiklerini goşmak üçin ulanyldy. Köl suwy aýyrmak üçin \ ({5} \, {\ upmu \ hbox {m}} \) membranasy arkaly süzüldi togtadylan bölejikler, soň bolsa Phi6 fazasy goşuldy. \ (10 ^ {6} \, {\ hbox {PFU} / \ hbox {ml}}) \) to \ ({100} \, {\ hbox {ml}} \) süzülen köl suwy, \ ({4} \, {^ {\ tegelek} \ hbox {C}} \). kiçijik alikot Wirus ýüküni ölçemek üçin niýetlenendir. Düwürtikli Phi6 wirus bölejiklerini jemlemek üçin iki dürli usuly synagdan geçirdik: (1) alýumin gidroksid adsorbsion-ýagyş usuly, daşky gurşaw nusgalaryndan birnäçe RNK wiruslarynyň konsentrasiýasy üçin tassyklanan 19 we (2)) Polietilen glikol (PEG) esasly wirus konsentrasiýa usuly Flood we ş.m.20 .PEG esasly usulyň dikeldiş netijeliliginiň alýumin gidroksid usulyndan has gowudygy ýüze çykarylandan soň, Phi6 bölejiklerini köl suwunyň nusgalaryndan jemlemek üçin PEG esasly usul ulanyldy.
Ulanylan PEG usuly aşakdaky ýalydy: 8% PEG 8000 we \ (0.2 \, \ hbox {M} \) \ (8% PEG 8000 we \ (\ hbox {NaCl} \) Phi6 görnüşli köl suw nusgalaryna goşuldy. \ hbox {NaCl} \). Nusgalar sarsdyryjyda inkubasiýa edildi \ ({4} \, {^ {\ circ} \ hbox {C}} \) \ ({4} \, {\ hbox {h}} \ ), soňra \ (4700 \, \ hbox {g} \) merkezden gaçyrylýar \ ({45} \, {\ hbox {min}} \). Adatdan daşary tebigaty taşlaň we pelleti \ ({1} \, sup \ hbox {ml}} \) şol bir adatdan daşary tebigatda. inghli möwç urmak we wirus konsentrasiýasy synaglary üç nusgada geçirildi. Konsentrasiýadan soň dikeldiş netijeliligini ölçemek üçin kiçijik alikot saklandy. RNA öň beýan edilişi ýaly we izolirlendi. toplum bilen üpjün edilen elýusiýa buferinde \ ({40} \, {\ upmu \ hbox {l}} \). RNK konsentrasiýasy nusgada üç nusgada üýtgäp biljekdigi sebäpli, \ ({2} \, {\ upmu \ RNK-nyň hbox {l}} \) üçüsinde-de ulanylýar, konsentrasiýasyna garamazdan CDNA sintezi nusgalaryň sintezi öň beýan edilişi ýaly ýerine ýetirildi. \ ({1} \, {\ upmu \ hbox {l}} \) cDNA \ (117 \, \ hbox {bp} \) we \ (503 \, \ hbox {) güýçlendirmek üçin 35 aýlaw üçin PCR (\ {20} \, {\ upmu \ hbox {l}} \) şablon hökmünde ulanyldy. bp} \) bölekler. Bu nusgalar “1: 1 ″” görnüşinde görkezilýär, ýagny eritmesiz. polo positiveitel gözegçilik (PC) üçin şablon hökmünde .Kuantitative PCR (qPCR) Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies) ulanyp, Stratagene Mx3000P RT-PCR guralynda ýerine ýetirildi. beýan edildi. cyclehli nusgalar üçin sikl bosagasy hasaba alyndy. Mundan başga-da, süzülen köl suwlarynda 1: 100 suwuklandyrylan cDNA ulanyp, suwuklandyrylan nusgalar \ ({1} \, {\ upmu \ hbox {l}} \) boldy. \ ({20} \, {\ upmu \ hbox {l}} \) 35 aýlaw üçin PCR. Bu nusgalar “1: 100 ″” görnüşinde görkezilýär.
PCB elektrodlary, goşmaça altyn örtük zerurlygy bolmazdan, täjirçilik taýdan elýeterli arzan elektroless Nikel çümdürmek altyn (ENIG) prosesi bilen ýasalýar. ENIG PCB elektrod aýratynlyklary öňki işimizde jikme-jik görkezilýär11. piranha ergini ýa-da kükürt kislotasy siklik woltammetri maslahat berilmeýär, sebäbi inçe altyn gatlagyň (galyňlygy \ (\ takmynan \) \ (100 \, \ hbox {nm} \) gabygynyň döremegine sebäp bolup biler we köplenç mis gatlaklaryny açyp biler. 21, 22, 23, 24, 25. poslamaga. Şonuň üçin elektrodlary IPA bilen nemlendirilen lintsiz mata bilen arassalaň. Synag üçin nusga \ ({50} \, {\ upmu \ hbox {M}) bilen inkubasiýa edildi. Easyeňil goýmak üçin \ ({4} \, {^ {\ circ} \ hbox {C}} \) \ ({1} \, {\ hbox {h}} \) MB-de MB. Öňki işimizde , datçigiň duýgurlygynyň we çyzyklylygynyň MB konsentrasiýasyny 11 ýokarlandyrmak arkaly gowulaşandygyny gördük. Öňki işimizde habar berlen optimizasiýalara esaslanyp, \ ({50} \, {\ upmu \ hbox {M}} \) MB ulanýardyk Bu gözlegde DNK-ny ornaşdyrmak üçin konsentrasiýalar. Iki hatar DNK-nyň (ds-DNK) elektrokimiki tapylmagy anion ýa-da kationiki interkalatorlaryň kömegi bilen gazanylyp bilner. Anion interkalýatorlar DNK-ny has gowy saýlaýan bolsa-da, bir gijäniň dowamynda inkubasiýa talap edýär, netijede has köp ýüze çykarylýar. beýleki tarapdan, MB ýaly kationiki interkalatorlar ds-DNA6-nyň elektrokimiki tapylmagy üçin takmynan \ ({1} \, {\ hbox {h}} \) gysga inkubasiýa wagtyny talap edýär. Her bir ölçeg, synagdan geçiriljek nusgany paýlamagy öz içine alýar elektrod \ ({5} \, {{\ upmu \ hbox {l}}} \), soň başga bir nusga almazdan ozal IPA-nemli eşik bilen arassalaň.bir ölçeg. Başga bir ýagdaý görkezilmedik bolsa, her bir nusga 5 dürli elektrodda synag edildi. DPV we CV ölçegleri PalmSens Sensit Smart potentiostat ulanylyp geçirildi we PSTrace programma üpjünçiligi potensiostat konfigurasiýasy we maglumatlary almak üçin ulanyldy, iň ýokary hasaplamalary goşmak bilen. Aşakdaky sazlamalar ulanylýar DPV we CV ölçegleri üçin:
DPV: Deňagramlylyk wagty = \ (8 \, \ hbox {s} \), naprýa Stepeniýe ädim = \ (3 \, \ hbox {mV} \), impuls naprýa = eniýesi = \ (25 \, \ hbox {mV} \), impulsyň dowamlylygy = \ (50 \, \ hbox {ms} \), skaner tizligi = \ ({20} \, \ hbox {mV / s} \)
CV: Deňagramlylyk wagty = \ (8 \, \ hbox {s} \), naprýa Stepeniýe ädimi = \ (3 \, \ hbox {mV} \), Süpürmek derejesi = \ ({300} \, \ hbox {mV / s } \)
DNK-nyň woltamogrammalaryndan alnan iň ýokary toklar \ ({50} \, {\ upmu \ hbox {M}} \) MB: (a) \ (503 \, \ hbox {bp} \) DPV, (b) \ (503 \, \ hbox {bp} \) CV, (c) \ (117 \, \ hbox {bp} \) DPV, (d) \ (117 \, \ hbox {bp} \) CV.
DPV we CV woltamogrammalar ENIG PCB elektrodlarynda ({50} \, {\ upmu \ hbox {M}} \) DNK bilen çylşyrymly MB (10 - \ ({20} \, {\ hbox {ng) konsentrasiýalarynda alyndy ((117 \, \ hbox {bp} \) we 0.03 üçin} / {\ upmu \ hbox {l}}} \), ýagny 0,13 - \ - ((50 0.06} \, {\ upmu \ hbox {M}} \) üçin (503 \, \ hbox {bp} \)). Wekil woltamogrammalar goşmaça maglumat S1-nji suratda görkezilýär. Gel bilen arassalanan PCR önümlerini ulanyp, DPV we CV ölçegleri (iň ýokary tok). CV ölçegleri bilen deňeşdirilende, DPV ölçegleri has ýokary duýgurlygy görkezýär (tok DNK konsentrasiýasynyň funksiýasy hökmünde), sebäbi CV ölçeglerindäki fon kuwwatly toklar Faradaik toklaryny gizleýär 26. Maglumatlar guty gutusyndaky her guty üçin 5 elektroddan ölçegler bar. Hemme ölçegler elektroddan elektrodyň üýtgemegi sebäpli ölçeg ýalňyşlyklaryndan gaça durmak üçin birmeňzeş elektrodlary ulanýar. DNK-nyň pes konsentrasiýalary üçin DPV we CV ölçenen iň ýokary akymlaryň artýandygyny gördük. , has uzyn (\ (503 \, \ hbox {bp} \)) \, \ (117)) bölegi bilen deňeşdirilende \ hbox {bp} \ .Bu öňki işimizde habar berlen elektrod adsorbsiýasynyň garaşylýan tendensiýasyna laýyk gelýär. MB-DNK toplumynyň adsorbsiýasy, iň ýokary tokyň ýokarlanmagyna goşant goşýan elektrodda zarýadyň geçirilmegini aňsatlaşdyrýar. Beýleki gözlegler oligonukleotidiň ululygynyň we yzygiderliliginiň MB-DNK interkalasiýasyna täsirini görkezdi 27,28,29,30.Ganin iki amplikonyň (\ (117 \, \ hbox {bp} \) we \ (503 \, \ hbox {bp} \)) sitosin (GC) mazmuny takmynan 50% bolup, syn etmegiň tapawudyň bolmalydygyny görkezýär amplikonyň uzynlygyna. Şeýle-de bolsa, has ýokary DNK konsentrasiýalary üçin (\ (> {2} \, {\ hbox {ng} / {\ upmu \ hbox {l}}} \), \ (503 \, \ hbox {bp}) üçin \) we \ (> {10} \, {\ hbox {ng} / {\ upmu \ hbox {l}}} \) üçin \ (117 \, \ hbox {bp} \)), iki sany güýçlendirmäni synlaýarys Subs-iň iň ýokary akymlary DPV we CV ölçeglerinde azalýar. Munuň sebäbi MB DNK-nyň esasy jübütleriniň arasynda doýýar we birleşýär, netijede MB31,32-de azalýan toparyň redoks işjeňliginiň steriki gadagan edilmegine sebäp bolýar.
在 存在 \ (2 \, \ hbox {mM} \) \ ({\ hbox {MgCl} _2} \): (a) \ (503 \, \ hbox {bp} \) DPV, (b) \ (503 \, \ hbox {bp} \) CV, (c) \ (117 \, \ hbox {bp} \) DPV ， (d) \ (117 \, \ hbox {bp} \) CV。
PCR ussasynda bar bolan duzlar MB bilen DNK-nyň arasyndaky elektrostatik täsirlere päsgel berýär, şonuň üçin \ (2 \, \ hbox {mM} \) \ (\ hbox {MgCl} _2 \) \ ({50} \, {\ upmu \ hbox {M}} \) MB-DNK täsirine duzuň täsirini öwrenmek üçin MB jel bilen arassalanan önüm. 3-nji suratda görkezilişi ýaly, ýokary DNK konsentrasiýalary üçin (\ (> {2} \, {\) hbox {ng} / {\ upmu \ hbox {l}}} \) (503 \, \ hbox {bp} \) we \ (> {10} \, {\ hbox {ng} / {\ upmu \ hbox { l}}} \) \ (117 \, \ hbox {bp} \)), DPV we CV-de duzuň goşulmagy ölçeglere ep-esli täsir etmedi (wekil woltamogrammalar üçin goşmaça maglumat S2 surata serediň) .Höne, DNK konsentrasiýalarynyň pes bolmagy, duzuň goşulmagy duýgurlygy ep-esli peseldýär, netijede DNK konsentrasiýasy bilen tokda düýpli üýtgeşiklik bolmaz. Duzyň MB-DNK täsirine we interkalasiýa meňzeş ýaramaz täsiri öň beýleki gözlegçiler tarapyndan habar berildi33,34. \ (\ hbox { Mg} ^ {2 +} \) kationlar DNK-nyň otrisatel fosfat oňurgasy bilen baglanyşýar we şeýlelik bilen MB bilen DNK-nyň arasyndaky elektrostatik täsirleşmä päsgel berýär. DNK konsentrasiýalarynyň has ýokary bolmagy, redoks-aktiw MB-leriň steriki gadaganlygy pes akymlara sebäp bolýar, şonuň üçin elektrostatik täsirleşmeler datçigiň jogabyna ep-esli täsir etmez. Esasy zat, bu biosensoryň has ýokary DNK konsentrasiýalaryny kesgitlemek üçin has laýyk bolmagydyr (seýrek \ ({\ hbox {ng} / {\ upmu \ hbox {l}}} \) ýa-da has ýokary), PCR önümlerini jel arassalamak mümkin bolmadyk ýerlerde daşky gurşaw suw nusgalaryny doly awtomatiki işlemek üçin.
\ ({50} \, {\ upmu \ hbox {M}} \) MB bilen çylşyrymly DNK-nyň dürli konsentrasiýalary üçin tolkun uzynlygy 600–700 \ (\ hbox {nm} \) aralygyndaky meýdan. ) \ (503 \, \ hbox {bp} \) duzsyz we (\ (2 \, \ hbox {mM} \) \ (\ hbox {MgCl} _2 \)), (b) \ (117 \, \ hbox {bp} \) duzsyz we (\ (2 \, \ hbox {mM} \) \ (\ hbox {MgCl} _2 \)). \ ({0} \, {\ hbox {pg} / {\ upmu \ hbox {l}}} \) \ ({50} \, {\ upmu \ hbox {M}} \) MB nusgalaryna laýyk gelýän DNK konsentrasiýalary DNK ýok.
Aboveokardaky netijeleri has-da barlamak üçin UV / Vis spektrofotometrini (Termo Scientific Multiskan GO) ulanyp, optiki ölçegleri ýerine ýetirdik, nusgalar \ ({50} \, {{\ upmu \ hbox {l}}} \) ulanyldy Ölçeg. Siňdiriş goly, DNK konsentrasiýasynyň ýokarlanmagy bilen azalýar, tolkun uzynlygy diapazony \ (600 \, \ hbox {nm} \) -den \ (700 \, \ hbox {) nm} \), 4-nji suratda görkezilişi ýaly (Goşmaça maglumatlarda S3 suratda görkezilen siňdiriş spektri). \ ({1} \, {\ hbox {ng} / {\ upmu \ hbox-dan az DNK konsentrasiýasy bolan nusgalar üçin {l}}} \), DNK-ny öz içine alýan we diňe MB-den alnan nusgalaryň arasynda (\ (503 \, \ hbox {bp} \) we \ (117 \, \ hbox {bp} \) arasynda düýpli tapawut ýokdy. ) uzyn bölekler), redoks-aktiw MB-de steriki inhibisiýanyň ýokdugyny görkezýär. DNK konsentrasiýalarynyň has ýokary bolmagynda, siňdiriş signalynyň kem-kemden azalýandygyny gördük we duzuň barlygynda siňdirişiň az azalandygyny belledik. Bu netijeler molekulalar bilen baglanyşyklydy DNK gibridlerinde esasy berkitme bilen özara täsirler we steriki inhibisiýalar. Netijelerimiz, gipohromatikligi \ (\ pi \) - \ (\ pi ^ * \ -de energiýa derejesiniň peselmegi bilen baglanyşdyrýan MB-DNK interkalasiýasynyň spektroskopiki gözlegleri baradaky edebiýatdaky hasabatlara laýyk gelýär. ) 36, 37, 38 gatlaklar sebäpli elektron geçişler.
Phi6 tapgyrynyň agarose gel elektroforezi: kölüň suw nusgalaryndan uzynlykdaky PCR önümleri \ (117 \, \ hbox {bp} \) we \ (503 \, \ hbox {bp} \) .M-DNA markeri;NTC-şablon gözegçiligi, degişli amplikonlary öz içine alýan primerler;Kompýuteriň oňyn gözegçiligi;1, 2, 3 suwsyz (1: 1) üçburçlukda köl suwunyň nusgalary. \ (503 \, \ hbox {bp} \) zolak.
Phi6 fazasy bilen çaýylan Powai kölüniň suw nusgalaryny ulanyp, datçigiň peýdasyna baha berdik. Sahypa görnüşli suw nusgalaryndan izolirlenen RNK konsentrasiýalary 15,8 - \ ({19.4} \, {\ upmu \ hbox {g} / \ hbox {) ml}} \), arassalanan faza süspansiýalaryndan izolirlenenler bolsa, RNK takmynan dikeldiş netijeliligi bilen \ ({1945} \, {\ upmu \ hbox {g} / \ hbox {ml}} \) hasaplanýar. % .RNA tersine cDNA görnüşine geçirildi we PCR we qPCR üçin şablon hökmünde ulanyldy. Önümiň ululygy datçik bilen synag etmezden ozal agarose gel elektroforezi bilen tassyklandy. qPCR (1-nji tablisa) döwründe ýazylan Ct bahalary, degişli suwly nusgalardan izolirlenen RNK konsentrasiýasy bilen arabaglanyşygy görkezildi. bosagadan ýa-da fon signalyndan ýokary polo positiveitel gözegçilik we synag nusgasy mundan başga-da her synag nusgasynyň polo positiveitel gözegçilik bilen deňeşdirilende takmynan 1% şablonynyň bardygyny görkezýär. Öň amplikonlaryň has duýgurlyga sebäp bolýandygyny öňem ara alyp maslahatlaşypdyk. Birmeňzeş daşky gurşaw nusgalaryndan izolirlenen uzyn bölekleri güýçlendirmek kyn. wirusyň pes konsentrasiýasy we RNK zaýalanmagy. Şeýle-de bolsa, wirusy baýlaşdyrmak we PCR güýçlendirmek protokoly bilen, elektrokimiki duýgurlyk üçin \ (503 \, \ hbox {bp} \) böleklerini üstünlikli güýçlendirip bildik.
6-njy suratda, ((50: , NTC we PC bilen deňeşdirilende (wekil woltamogrammalar üçin goşmaça maglumatlardaky S4 surata serediň). 6-njy suratdaky guty gutusynyň her gutusynda 5 elektrodda üç nusgadan ölçeg bar. Şol elektrodlar elektrod sebäpli ýalňyşlyklaryň öňüni almak üçin ähli nusgalary ölçemek üçin ulanyldy. - elektrodyň üýtgemegi. CV ölçegleri bilen deňeşdirilende, DPV ölçegleri synag we kompýuter nusgalaryny NTC-lerden tapawutlandyrmak üçin has gowy çözgüdi görkezýär, sebäbi ýokarda belläp geçişimiz ýaly, Faradaik toklary soňky fonda geçiriji toklar sebäpli gizlenýär. Uzyn amplikonlar üçin otrisatel gözegçilik (NTC) polo positiveitel gözegçilik bilen deňeşdirilende has ýokary CV we DPV tok akymlaryna sebäp boldy, polo positiveitel we işlenmedik synag nusgalary DPV pik toklarynyň iň ýokary belentliklerini görkezdi. Her bir kesgitlenmedik ortaça ölçeg we orta bahalar (1: 1) ) synag nusgasy we kompýuter NTC nusgasy üçin datçigiň çykyşyndan anyk çözülip bilner, şol bir wagtyň özünde 1: 100 seýreklenen nusganyň çözgüdi az aýdylýar. CDNA-nyň 100 esse eremegi üçin gel elektroforezi wagtynda hiç hili zolak görmedik. (5-nji suratda görkezilmeýän zolaklar) we degişli DPV we CV iň ýokary toklary NTC-de garaşylýanlara meňzeýärdi. \ (117 \, \ hbox {bp} \) bölegi üçin netijeler Goşmaça maglumatlarda görkezilýär. gözegçilik PCB datçiginden elektrodda erkin MB-nyň adsorbsiýasy we MB-nyň bir hatar primer oligonukleotid bilen täsiri sebäpli elektrokimiki jogap berdi. Şonuň üçin her gezek bir synag geçirilende negatiw gözegçilik edilmeli we Synag nusgasynyň polo positiveitel ýa-da otrisatel diýip klassifikasiýa etmek üçin diferensial (otnositel) ölçege ýetmek üçin otrisatel gözegçilik bilen alnan iň ýokary tok bilen deňeşdirilende synag nusgasynyň iň ýokary toky.
) polo positiveitel dolandyryşlar (HK).
Gözleglerimiz, dürli DNK üçin dürli uzynlykdaky amplikonlar üçin elektrokimiki datçikleriň işleýşine täsir edýän dürli mehanizmleri görkezýär, konsentrasiýalar UV / Vis spektrofotometrini ulanyp optiki ölçegler bilen barlanýar. Biziň gözegçiliklerimiz, DNK bölekleriniň \ (\ takmynan \) çenli uzynlygyny görkezýär. \ (500 \, \ hbox {bp} \) has ýokary duýgurlyk bilen kesgitlenip bilner we nusgada duzuň bolmagy ýokary duýgurlyga täsir edýän duýgurlyk DNK konsentrasiýasyna täsir etmeýär (seýrek \ ({\ hbox {ng} / {\ upmu) \ hbox {l}}} \) we ýokarda). Mundan başga-da, dürli görnüşli nusgalaryň, şol sanda duz bilen we goşulmazdan jel bilen arassalanan amplikonlaryň, DPV we CV ölçeglerinde köl suw nusgalarynyň täsirini derňedik.DPV-iň has gowy çözgüdi üpjün edendigini gördük, sebäbi fon geçirijilik togy CV ölçegine täsir edýär we ony has duýgur edýär.
Uzyn bölekleriň güýçlendirilmegi wirusly genom RNK-nyň bitewiligine baglydyr. Käbir gözlegler daşky gurşawdaky RNK-nyň zaýalanmagy we izolýasiýa wagtynda bölünmek mümkinçiligi sebäpli uzyn bölekleriň güýçlendirilmeginiň hemişe täsirli däldigini görkezdi11,41,42,43,44 .PEG esasly wirus konsentrasiýa usulynyň, alýumin gidroksid esasly wirus konsentrasiýa usulyna garanyňda köl suw nusgalarynda sepilen Phi-6 fazasyny jemlemekde has täsirlidigine göz ýetirdik. Uzyn DNK böleklerini kesgitlemek ukyby multiplex PCR talaplaryny ýeňip geçendigini subut etdi. birnäçe gysga uzynlyk şablonlaryny güýçlendirmek we biri-birine baglylyk mümkinçiligini azaltmak.
Biologiki nusgalar gaty az, şonuň üçin synag üçin iň az nusgalary talap edýän biosensor dizaýn etmeli. Bu işde ulanylýan ENIG PCB elektrodlary diňe talap edilýär ({5} \, {{\ upmu \ hbox {l}}} \ ) elektrodlaryň täsirli ýerini gurşap almak üçin synag üçin nusgalar. Mundan başga-da, indiki nusgany paýlamazdan ozal şol bir elektrod arassalanandan soň gaýtadan ulanylyp bilner. Güýçlendirilen nusgalarda metilen gökden başga himiki maddalaryň goşulmagy talap edilmeýär, bu arzan we köplenç ulanylýan himiki önümler. Her elektrodyň öndürilmegi üçin takmynan 0,55 dollar (ýa-da INR 40) sarp edilýändigi sebäpli, bu biosensor bar bolan ýüze çykaryş tehnologiýalaryna tygşytly alternatiwa bolup biler. 2-nji tablisada bu eseriň uzak wagtlap edebiýatda habar berlen beýleki datçikler bilen deňeşdirilişi görkezilýär. Geterogen nusgalarda DNK bölekleri.
MB esasly elektrohimiki kesgitleýiş protokollarynyň PCR-iň aýratynlygyna bil baglaýandygyny göz öňünde tutup, bu usulyň esasy çäklendirmesi, hapa suwlar we köl suwlary ýaly birmeňzeş nusgalarda ýa-da pes arassalaýjy desgalary ulanmak üçin aýratyn güýçlendirme mümkinçiligidir. Duýgurlygy ýokarlandyrmak üçin kodlanmadyk ENIG PCB elektrodlaryny ulanyp, tassyklanmadyk PCR önümlerini DNK kesgitlemek üçin elektrohimiki kesgitleme usullary, ulanylmadyk dNTP we primerler tarapyndan girizilen ýalňyşlyklara has gowy düşünmek we reaksiýa şertlerini optimizirlemek we protokollary barlamak. PH, temperatura we biologiki goşmaça fiziki-himiki parametrler Suw nusgasynyň kislorod islegi (BOD), ölçegiň takyklygyny ýokarlandyrmak üçin ölçemeli bolup biler.
Sözümiziň ahyrynda, daşky gurşaw (köl suwy) nusgalarynda wirus tapmak üçin arzan bahaly elektrohimiki ENIG PCB datçigini teklip edýäris. Duýgurlygy saklamak üçin kriogen saklamagy talap edýän immobilizirlenen oligonukleotid elektrodlaryndan ýa-da adaty substratlardan tapawutlylykda, 53,54 usulymyz kodlanmadyk PCB ulanýar has uzak saklanylýan we belli bir saklaýyş talaplary bolmadyk elektrodlar, şonuň üçin LMIC-de ýerleşdirilen awtomatiki nusga gaýtadan işlemek bilen ölçeg çözgütlerini işläp düzmek üçin amatly. Biosensor maksatly amplikonlary çalt tapmak üçin arzan DNK-biri-biri bilen baglanyşýan redoks boýaglaryny (MB) ulanýar. Kesgitli güýçlendirme Daşky gurşaw nusgalarynda giňden ýaýran, MB-leriň bir we iki hatar oligonukleotidler bilen kesgitli baglanyşygy sebäpli bu duýgurmagyň usulynyň aýratynlygyny peseldýär. Şonuň üçin bu synagyň aýratynlygy primerleriň we PCR reaksiýa şertleriniň optimizasiýasyna baglydyr. Mundan başga-da, CV Synag nusgalaryndan alnan DPV pik toklary, her synag üçin otrisatel gözegçilikden (NTC) alnan jogaplara görä düşündirilmelidir. Bu işde görkezilen elektrokimiki datçigiň dizaýnlary we usullary, awtomatiki we pes derejede ösmek üçin awtosampler bilen birleşdirilip bilner. - nusgalary ýygnap we analiz edip bilýän we simsiz netijeleri laboratoriýa geçirip bilýän çykdajy çözgüdi.
Cashdollar, J. & Wymer, L. Suw nusgalaryndan wiruslaryň başlangyç konsentrasiýasynyň usullary: soňky gözleglere syn we meta-analiz.J.Programma.mikroorganizm.115, 1-11 sahypa (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL Suwdan çykýan wiruslar: Içimlik suwuň päsgelçilikleri.PLoS Pathogens.11, E1004867 (2015).
Şresta, S. we başgalar. Orta we orta girdejili ýurtlarda COVID-19-yň tygşytly uly göwrümli gözegçiligi üçin hapa suw epidemiologiýasy: kynçylyklar we mümkinçilikler. Suw 13, 2897 (2021).
Palecek, E. & Bartosik, M. Nuklein kislotasynyň elektrohimiýasy.Himiki.Rew.112, 3427–3481 (2012).
Tani, A., Tomson, AJ & Butt, JN Metilen gök altyn substratlarda hereketsiz bir we iki hatar oligonukleotidleriň elektrokimiki diskriminatory hökmünde. Analiz 126, 1756–1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ Uzyn aralykdaky elektron geçiriş arkaly DNK gibridizasiýasynyň elektrohimiki transduksiýasy üçin kation we anion interkalýatorlaryny deňeşdirmek. Elektrokimiýa.comminicate.6, 648–654 (2004).
Wong, EL & Gooding, JJ DNK arkaly zarýad geçirmek: saýlanan elektrokimiki DNK biosensor.anus.Chemical.78, 2138–2144 (2006).
Fang, TH we başgalar. Şol bir wagtyň özünde elektrokimiki kesgitleme.biologiki datçik bilen PCR mikrofliid enjamy. Bioelektronika.24, 2131–2136 (2009).
Win, BY we başgalar. Metilen göküň DNK bilen özara täsirine esaslanýan elektrokimiki real wagt PCR ulgamynyň signalizasiýa mehanizmini öwrenmek we öndürijiligi barlamak. Analiz 136, 1573–1579 (2011).
Ramirez-Çawarria, RG we başgalar. Hapa suwlaryň nusgalarynda sars-cov-2-ni ýüze çykarmak üçin aýlawly izotermiki güýçlendirme esasly elektrokimiki datçik.J.Daşky gurşaw.Himiki.Britain.10, 107488 (2022).
Kumar, M. we başgalar. PCB elektrodlary bilen SARS-CoV-2 amplikonlaryň elektrokimiki duýgusy. Sensor işjeňleşdirildi.B Himiýa.343, 130169 (2021).
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. & Yoshoşida, H. Hapa suwlaryň gaty böleginde SARS-CoV-2 RNK-ny netijeli tapmak.science.general gurşaw.763, 144587 (2021).
Alygizakis, N. we başgalar. Hapa suwlarda SARS-CoV-2 kesgitlemegiň analitiki usullary: Protokol we geljekki perspektiwalar. TraC tendensiýa anal. Himiýa.134, 116125 (2020).
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orewi, T. & Kaştan, N. Aýna ýüzlerine goýlan bugarýan tüýkülik damjalarynda Phi6 (SARS-CoV-2 üçin emele gelen) bakteriofagdan halas bolmak.Science.Rep.10, 1-10 (2020).
Deý, R., Dlusskaýa, E. & Aşbolt, NJ SARS-CoV-2 surogatynyň (Phi6) erkin ýaşaýyş amyeba.J-de daşky gurşawyň dowamlylygy.Suw saglygy 20, 83 (2021).
Mindich, L. Iki hatar RNK bakteriofagynyň üç genom bölekleriniň takyk gaplanylyşy \ (\ varphi \) 6.mikroorganizm.More.biology.Rew.63, 149-160 (1999).
Pirttimaa, MJ & Bamford, DH RNA tapgyrynyň ikinji gurluşy \ (\ varphi \) 6 gaplaýyş sebiti.RNA 6, 880–889 (2000).
Bonilla, N. we ş.m. Çeçotkadaky tapgyrlar - Bakteriofaglaryň laboratoriýa ätiýaçlyklaryny taýýarlamak üçin çalt we täsirli protokol.PeerJ 4, e2261 (2016).
Iş wagty: 27-2022-nji maý