Asante kwa kutembelea Nature.com.Toleo la kivinjari unachotumia lina usaidizi mdogo kwa CSS.Kwa matumizi bora zaidi, tunapendekeza utumie kivinjari kilichosasishwa (au zima hali ya uoanifu katika Internet Explorer). Kwa sasa, ili kuhakikisha kuendelea kutumia, tutaonyesha tovuti bila mitindo na JavaScript.
Umuhimu wa kufuatilia sampuli za mazingira umethaminiwa sana tangu mwanzo wa janga la COVID-19, na baadhi ya juhudi za ufuatiliaji zinafanywa kwa kutumia kiwango cha dhahabu, ingawa mbinu za msingi za qPCR ni ghali. Sensorer za kielektroniki za DNA zinaweza kutoa gharama inayoweza kuwa nafuu. suluhisho la ufuatiliaji wa sampuli za maji ya mazingira katika nchi za kipato cha chini na cha kati.Katika kazi hii, tunaonyesha ugunduzi wa kemikali wa kielektroniki wa amplikoni zilizopatikana kutoka kwa fagio la Phi6 zilizotengwa na sampuli za maji ya ziwa spiked (mbadala maarufu wa SARS-CoV-2), kwa kutumia ENIG. kukamilisha elektroni za PCB bila urekebishaji wa uso.sex. Mwitikio wa kihisi cha kielektroniki ulibainishwa kikamilifu kwa vipande viwili vya DNA vya urefu tofauti (\({117}\,\hbox {bp}\) na \({503}\,\hbox {bp}\)), na athari za chumvi katika mchanganyiko mkuu wa PCR kwenye mwingiliano wa methylene blue (MB)-DNA.Matokeo yetu yanaonyesha kwamba urefu wa vipande vya DNA huamua kwa kiasi kikubwa unyeti wa kieletrokemikali na kuonyesha katika kazi hii kwamba uwezo wa kugundua amplikoni ndefu bila utakaso wa gel wa bidhaa za PCR ni. muhimu kwa ajili ya kupima sampuli za maji katika situ.Suluhisho la otomatiki kamili kwa mzigo wa virusi huonyesha vizuri.
Uambukizaji wa virusi vinavyotokana na maji umejulikana kama hatari kwa afya ya umma tangu miaka ya 1940, na ushahidi wa kwanza wa maambukizi ya polio na hepatitis E1. Shirika la Afya Ulimwenguni (WHO) limeainisha viini kadhaa vya magonjwa yatokanayo na maji yenye umuhimu wa wastani hadi wa juu kiafya2.Virusi vya jadi. mbinu za kugundua zinategemea mbinu za msingi za qPCR za kiwango cha dhahabu, ambazo ni nyeti sana na mahususi, lakini zinahitaji wafanyakazi wenye ujuzi kupima katika maabara kwa kutumia vyombo vya gharama kubwa. Hata hivyo, katika nchi za kipato cha chini na cha kati (LMICs) zenye rasilimali chache, binadamu. upimaji wa sampuli huenda ukachukua nafasi ya kwanza kuliko ufuatiliaji wa sampuli za mazingira. Kwa hiyo, mbinu mbadala za gharama nafuu zinahitajika kwa ufuatiliaji endelevu, wa wakati halisi wa sampuli za maji na maji machafu katika nchi za kipato cha chini na cha kati kama maonyo ya mapema ya milipuko ya magonjwa yanayoibuka, na hivyo kuwalinda kutokana na athari kali za kijamii na kiuchumi za janga la virusi.Vipimo vya biokemikali vya bei ya chini vya asidi ya nukleiki vinaweza kutoa suluhu ya uwezekano wa hitaji hili ambalo halijatimizwa.Nyingi za hizi sensa za kibayolojia za DNA hufanya kazi kwa ukweli kwamba nyuzi za DNA za ziada hazisogezwi kwenye elektrodi. uso na kuchanganya wakati mfuatano unaolingana upo kwenye sampuli.Hii inaweza kisha kubadilishwa kuwa mawimbi kwa mbinu mbalimbali za kielektroniki kwa kutumia vipatanishi vya redoksi kama vile potasiamu iron/ferrocyanide.Methylene blue (MB) ni mojawapo ya molekuli amilifu ya redoksi, ambayo ina imeripotiwa kuingiliana katika DNA yenye nyuzi-mbili (dsDNA) pamoja na kumfunga kwake isiyo maalum zaidi kwa DNA ya kamba moja5,6. Asili ya kuingiliana ya MB na kuunda muundo wa MB-DNA inazifanya kuwa chaguo maarufu kama wapatanishi wa redox katika DNA nyingi za kielektroniki. usanidi wa sensa5,6,7,8,9.Ingawa muingiliano wa MB hadi DNA si maalum, na umaalum wa kihisi hiki cha kielektroniki hutegemea sana usafi wa vianzio vinavyotumika kwa PCR au upanuzi wa isothermal, inafaa vyema kwa utekelezaji halisi. qPCR yenye msingi wa kielektroniki wa wakati au upanuzi wa isothermal wa fluorescence kama mbadala wa kipimo cha ukolezi wa DNA 9 .Katika utekelezaji mmoja kama huo, Won et al. Sehemu ya elektrodi za dhahabu ilirekebishwa kwa 6-mercapto-1-hexanol (MCH) kwa muda halisi. kipimo cha amplikoni za PCR zenye MB kwa kutumia tofauti ya voltammetry ya mpigo (DPV)9.Katika hali nyingine, Ramirez et al.Ugunduzi wa SARS-CoV-2 kwenye maji machafu kwa mmenyuko wa RT-LAMP kwa kutumia MB yenye elektrodi zilizochapishwa skrini.Elektrodi za Platinum pia zimepatikana. kutumika kama katika situ elektroni katika microfluidic PCR jukwaa iliyoundwa na electrochemically kutambua amplikoni wakati wa athari 8. Masomo haya yote yanahitaji marekebisho ya uso wa elektrodi, ikimaanisha kuongezeka kwa gharama za uzalishaji na uendeshaji kutokana na mahitaji maalum ya kuhifadhi kwa ajili ya utulivu wa elektrodi hizi utendaji kazi.
Mpangilio wa utiririshaji wa kazi wa utambuzi wa kielektroniki wa amplikoni zilizopatikana kutoka kwa chembechembe za virusi zilizokolea katika sampuli za maji ya ziwa.
Hivi majuzi tulionyesha hisia za kielektroniki za amplikoni za SARS-CoV-2 zilizo na elektroni za bei ya chini za bodi ya mzunguko iliyochapishwa (PCB) kulingana na DPV na cyclic voltammetry (CV) iliyochochewa na utangazaji wa muundo wa MB-DNA kwenye uso wa elektrodi ambazo hazijarekebishwa ) mabadiliko katika kilele ya sasa11.Tunaripoti kwamba vipande virefu vya DNA (N1-N2, \({943}\, \hbox) vilivyoundwa kwa kutumia N1 ya mbele iliyopendekezwa na CDC na vianzio vya nyuma vya N2 ikilinganishwa na vipande vifupi zaidi {bp}\)) vilionyesha usawa bora katika mwitikio wa kihisi. ( N1, \(72\,\hbox {bp}\)) iliyoundwa kwa kutumia N1 forward na N1 reverse primer seti. Tafiti hizi zinaripotiwa kwa kutumia michanganyiko ya DNA iliyotayarishwa katika maji yasiyo na viini. Jukwaa lilitumika pia kugundua SARS-CoV Amplikoni 2 katika sampuli za maji machafu zilizoigwa (zinazopatikana kwa kunyunyiza jumla ya sampuli za RNA na SARS-CoV-2 RNA). Kwa kuwa RNA huathiriwa na ukataji wa manyoya wakati wa kutengwa na usindikaji wa chini ya mkondo,12,13 ni vigumu kukuza vipande virefu kwa sampuli hii isiyo ya kawaida. Kwa hiyo, maonyesho ya hisia ya electrochemical ya amplicon ya SARS-CoV-2 katika maji machafu ni mdogo kwa kipande cha \(72\,\hbox {bp}\) N1 kifupi zaidi.
Katika kazi hii, tulichunguza upembuzi yakinifu wa hisi za kielektroniki za ENIG PCB za fagio Phi6 iliyokolezwa na kutengwa na sampuli za maji ya ziwa (Mchoro 1). pia zina utando wa lipid na protini ya mwiba. Kwa sababu hizi, bacteriophage Phi6 ni mbadala maarufu wa SARS-CoV-2 na virusi vingine vya RNA vilivyofunikwa14,15.RNA vilivyotengwa na chembe za fagi ilitumiwa kama kiolezo cha usanisi wa cDNA na kufuatiwa na PCR ili kupata vipande viwili vya DNA vya urefu wa jozi 117 na 503 za msingi. Kwa kuzingatia changamoto ya kukuza vipande \(943\,\hbox {bp}\) N1-N2 katika kazi yetu ya awali, tunalenga vipande vya urefu wa kati (\(117) \,\hbox {bp}\) na \(503 \,\hbox {bp}\)), kulingana na vianzio vinavyopatikana. Mwitikio wa kihisia cha kielektroniki ulichunguzwa kwa utaratibu juu ya anuwai kubwa ya mkusanyiko (\({10}\,{ \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) hadi \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}}\)) Kwa vipande vyote viwili katika uwepo wa MB, athari ya chumvi kwenye mwitikio wa sensor imeonyeshwa na kuthibitishwa na vipimo vya spectrophotometric. Michango kuu ya kazi hii ni kama ifuatavyo.
Urefu wa kipande cha DNA na uwepo wa chumvi kwenye sampuli huathiri sana usikivu.Matokeo yetu yanaonyesha kuwa shughuli za kielektroniki hutegemea mifumo tofauti ya mwingiliano wa MB, DNA, na kihisi katika mwitikio wa voltammetric, kulingana na ukolezi wa DNA na urefu, na Vipande virefu vinaonyesha unyeti wa juu, ingawa chumvi ina athari mbaya kwenye mwingiliano wa kielektroniki kati ya. MB na DNA.
Mkusanyiko wa DNA huamua utaratibu wa mwingiliano wa MB-DNA katika elektrodi ambazo hazijarekebishwa. Tunaonyesha kwamba mifumo tofauti ya mwingiliano wa MB-DNA hutegemea ukolezi wa DNA. Katika viwango vya DNA chini ya kiasi kidogo cha \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox). {l}}}\), tuliona kuwa mwitikio wa sasa wa kieletrokemikali uliamuliwa hasa na utangazaji wa MB-DNA kwenye elektrodi, ilhali katika viwango vya chini Katika viwango vya juu vya DNA, majibu ya sasa ya elektrokemikali yaliamuliwa na kizuizi kikali cha redoksi. shughuli kutokana na kuingizwa kwa MB kati ya jozi za msingi za DNA.
Tathmini ya Kielektroniki ya Asidi ya Nyuklia ya Virusi katika Sampuli za Maji ya Ziwa kwa ENIG PCB Uchunguzi ulithibitishwa na ugunduzi wa kemikali wa kielektroniki wa vipande vya Phi6 vilivyoongezwa \(503\,\hbox {bp}\) vilivyopatikana kutoka kwa sampuli za maji kutoka Ziwa la Powai, Chuo cha IIT Mumbai. Phage ya matokeo.
Gharama ya chini ya utekelezaji na uwezekano wa kuunganishwa katika mifumo otomatiki ya ufuatiliaji , oligonucleotidi au aptamers kwenye elektrodi zenye muda mrefu wa kuhifadhi.
Phage Phi6 ni virusi vya dsRNA vilivyofunikwa vya familia ya Cytoviridae ambavyo huambukiza Pseudomonas syringae.Genomu ya Phi6 phage ipo katika umbo la vipande 3: S (\(2.95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4.07) \,\hbox {Kb}\)) na L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\)) 16,17 na inaweza kukuzwa kwa urahisi katika maabara.Phage Phi6 na mwenyeji wake Pseudomonas syringae zilinunuliwa kutoka Kituo cha Marejeleo cha Felix d'Herelle cha Virusi vya Bakteria, Chuo Kikuu cha Laval, Kanada (nambari za orodha ya kituo cha marejeleo ni HER-102 na HER-1102, mtawalia) .Phi6 phage na mwenyeji wake walifufuliwa kama ilivyoelekezwa na kituo cha marejeleo. Phage Phi6 ilisafishwa kwa kusawazisha sahani na kupata alama za mwisho kwa \(\takriban 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { ml}}\) (vitengo vya kutengeneza plaque/ mililita).RNA ilitengwa kutoka kwa chembe za fagio zilizosafishwa kwa kutumia Jedwali la GenElute™ Universal Total RNA Purification Kit (Sigma-Aldrich) kulingana na maagizo ya mtengenezaji.Kwa ufupi, fagio iliyosafishwa Phi6 kusimamishwa\({{ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) ilitolewa na lilisati ilipakiwa kwenye safu wima inayozunguka ili kuruhusu RNA kujifunga kwenye safu wima ya resin .RNA kisha inatolewa katika suluhisho la elution \({ 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) iliyotolewa na kit.Kadiria mkusanyiko wa RNA kwa kunyonya katika \(260\,\hbox {nm}\).RNA ilihifadhiwa katika aliquots katika \ ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) hadi itakapotumika zaidi.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) Kifurushi cha Usanisi cha cDNA cha iScript (Wasifu -Rad Laboratories) ilitumika kama kiolezo cha usanisi wa cDNA kufuatia maagizo ya mtengenezaji. Kwa ufupi, majibu ya usanisi ya cDNA yana hatua 3: priming katika \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min} }\) , unukuzi wa kinyume wa \({20}\,{\hbox {min}}\) kwa \({46}\,{^{\circ }\hbox {C}}\), na kinyume Kinasa sauti kiko katika \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) kwa \({1}\,{\hbox {min }}\).Ilipoendeshwa kwa gel ya agarose ya 1%, cDNA ilionyesha bendi tatu zinazolingana na vipande vitatu vya RNA vilivyotarajiwa (data haijaonyeshwa). Vielelezo vifuatavyo vilitumiwa kukuza vipande viwili vya DNA vya urefu wa 117 na 503 bp. kutumia cDNA kama kiolezo cha PCR katika kiendesha baisikeli cha joto cha miniPCR® mini8:
Vianzilishi vya \(117\,\hbox {bp}\) na \(503\,\hbox {bp}\) vinalingana na nyukleotidi 1476-1575 za sehemu ya M na nyukleotidi 458-943 za sehemu ya L, mtawalia asidi. .Bidhaa zote za PCR zilizoimarishwa zilipigwa picha za kielektroniki kwenye gel ya agarose 1%, na DNA lengwa iliyoimarishwa ilisafishwa kwa kutumia Kifurushi cha Kuchimba Gel cha GeneJET (Thermo Fisher Scientific).
Ziwa katika chuo cha IIT Mumbai (Ziwa la Powai, Powai, Mumbai) lilitumiwa kuongeza chembe za feji. Maji ya ziwa yalichujwa kupitia utando \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) ili kuondoa chembe zilizoahirishwa, na kisha Phi6 fagio iliongezwa.Ongeza \({1}\,{\hbox {ml}}\) ya \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}}} \) hadi \( {100}\ ,{\hbox {ml}}\) iliyochujwa maji ya ziwa, katika \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\).Aliquot ndogo ilikuwa imehifadhiwa kwa kipimo cha mzigo wa virusi kwa kutumia plaque assay.Tulijaribu mbinu mbili tofauti za kukazia chembechembe za virusi vya Phi6: (1) njia ya alumini hidroksidi adsorption-precipitation,19 ambayo imethibitishwa kwa mkusanyiko wa virusi kadhaa vya RNA vilivyofunikwa kutoka kwa sampuli za mazingira, na (2) ) Mbinu ya mkusanyiko wa virusi vya polyethilini glikoli (PEG) ilichukuliwa kutoka kwa mafuriko et al.20 .Kwa kuwa ufanisi wa ufufuaji wa mbinu ya msingi wa PEG ulipatikana kuwa bora zaidi kuliko njia ya hidroksidi ya alumini, mbinu ya msingi wa PEG ilitumiwa kuzingatia chembe za Phi6 kutoka kwa sampuli za maji ya ziwa.
Mbinu ya PEG iliyotumika ilikuwa kama ifuatavyo: PEG 8000 na \(\hbox {NaCl}\) ziliongezwa kwenye sampuli za maji ya ziwa yenye miiba ya Phi6 ili kupata 8 % PEG 8000 na \(0.2\,\hbox {M} \) \( \ hbox {NaCl}\).Sampuli ziliwekwa kwenye kitetemeshi\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), kisha centrifuged katika \(4700 \,\hbox {g}\) ni \({45}\,{\hbox {min}}\).Tupa supernatant na kusimamisha pellet katika \({1}\, {\hbox {ml}}\) katika supernatant ile ile. Majaribio yote ya kuruka na kuongeza virusi yalifanywa katika triplicate. Baada ya mkusanyiko, aliquot ndogo ilihifadhiwa kwa ajili ya kupima ufanisi wa uokoaji kwa kutumia plaque assay.RNA ilitengwa kama ilivyoelezwa hapo awali na kutolewa. katika bafa ya elution inayotolewa na vifaa\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\). Kwa kuwa mkusanyiko wa RNA utatofautiana kutoka sampuli hadi sampuli katika nakala tatu, \({2}\,{\upmu \\) hbox {l}}\) ya RNA inatumika kwa zote tatu bila kujali ukolezi wake wa usanisi wa cDNA wa sampuli. Usanisi wa cDNA ulifanyika kama ilivyoelezwa hapo awali.\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNA ilitumika kama kiolezo cha \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR kwa mizunguko 35 ya kukuza \ (117\,\hbox {bp}\) na \(503\,\hbox { bp}\) vipande vipande. Sampuli hizi zinawakilishwa kama “1:1″, yaani bila dilution. Kidhibiti kisicho na kiolezo (NTC) kiliwekwa kama kidhibiti hasi, huku cDNA iliyounganishwa kwa kutumia RNA iliyotengwa na fagio iliyosafishwa iliwekwa. kama kiolezo cha udhibiti chanya (PC). Kiasi cha PCR (qPCR) kilitekelezwa katika chombo cha Stratagene Mx3000P RT-PCR kwa kutumia Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies). Maoni yaliwekwa mara tatu kama hapo awali. ilivyoelezwa.Kiwango cha mzunguko (Ct) kilirekodiwa kwa sampuli zote. Aidha, sampuli zilizochanganywa zilikuwa \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) kwa kutumia cDNA iliyopunguzwa 1:100 katika maji ya ziwa yaliyochujwa kama \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR kwa mizunguko 35. Sampuli hizi zinawakilishwa kama “1:100″.
Elektrodi za PCB zimetungwa kwa kutumia mchakato unaopatikana kibiashara wa bei nafuu wa Kuzamishwa kwa Nikeli ya Nikeli (ENIG) bila kuhitaji uwekaji wa ziada wa dhahabu. Vielelezo vya elektrodi vya PCB vimefafanuliwa katika kazi yetu ya awali11.Kwa elektrodi za ENIG PCB, mbinu za jadi za kusafisha elektrodi kama vile suluji ya piranha au cyclic voltammetry ya asidi ya salfa haipendekezwi kwani inaweza kusababisha kuchubua kwa safu nyembamba ya dhahabu (unene \(\takriban\) \(100\,\hbox {nm }\)) na kufichua tabaka za msingi za shaba ambazo zinaweza kukabiliwa. kwa kutu 21, 22, 23, 24, 25. Kwa hivyo, safisha elektroni kwa kitambaa kisicho na pamba kilichowekwa na IPA. Sampuli ya kupimwa iliwekwa ndani \({50}\,{\upmu \hbox {M}) }\) MB katika \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) kwa kuchomeka kwa urahisi.Katika kazi yetu ya awali , tuliona kuwa unyeti na usawa wa kitambuzi uliboreshwa kwa kuongeza mkusanyiko wa MB 11 .Kulingana na uboreshaji ulioripotiwa katika kazi yetu ya awali, tulitumia \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB viwango vya kupachika DNA katika utafiti huu.Ugunduzi wa kemikali ya kielektroniki wa DNA yenye ncha mbili (ds-DNA) unaweza kufikiwa kwa kutumia viambatanishi vya anionic au cationic.Ingawa viambatanisho vya anionic hugundua DNA kwa uteuzi bora, vinahitaji incubation ya usiku mmoja, na hivyo kusababisha muda mrefu wa utambuzi. kwa upande mwingine, viambatanishi vya cationic kama vile MB vinahitaji muda mfupi zaidi wa incubation, takriban \({1}\,{\hbox {h}}\) kwa utambuzi wa kielektroniki wa ds-DNA6.Kila kipimo kinahusisha kutoa sampuli ili kujaribiwa kwenye elektrodi\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), kisha safisha kwa kitambaa chenye unyevu wa IPA, kabla ya kuendelea na sampuli nyingine.kipimo kimoja. Kila sampuli ilijaribiwa kwenye elektrodi 5 tofauti isipokuwa kama ilivyoelezwa vinginevyo. Vipimo vya DPV na CV vilifanywa kwa kutumia PalmSens Sensit Smart potentiostat, na programu ya PSTrace ilitumika kwa usanidi wa potentiostat na kupata data, ikijumuisha mahesabu ya kilele cha sasa. Mipangilio ifuatayo inatumika. kwa vipimo vya DPV na CV:
DPV: Muda wa Usawa = \(8\,\hbox {s}\), Hatua ya Voltage = \(3\,\hbox {mV}\), Pulse Voltage = \(25\,\hbox {mV}\) , muda wa mapigo ya moyo = \(50\,\hbox {ms}\), kasi ya kuchanganua = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: Muda wa Usawa = \(8\,\hbox {s}\), Hatua ya Voltage = \(3\,\hbox {mV}\), Kiwango cha Kufagia = \({300}\,\hbox {mV/ s }\)
Mikondo ya kilele iliyopatikana kutoka kwa voltammograms za DNA iliyochanganywa na \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
Voltammograms za DPV na CV zilipatikana kwenye elektrodi za ENIG PCB \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB zilizochanganywa na DNA (katika viwango vya 10–\({20}\,{\ hbox {ng) }/{\upmu \hbox {l}}}\) yaani 0.13–\({0.26}\,{\upmu \hbox {M}}\) kwa \(117\,\hbox {bp}\ ) na 0.03 –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) kwa \(503\,\hbox {bp}\)).Voltammograms wakilishi zinaonyeshwa kwenye Mchoro S1 katika Taarifa ya Ziada.Mchoro 2 unaonyesha matokeo. ya vipimo vya DPV na CV (kilele cha sasa) kwa kutumia bidhaa za PCR zilizosafishwa gel. Ikilinganishwa na vipimo vya CV, vipimo vya DPV vinaonyesha unyeti wa juu (sasa kama kazi ya mkusanyiko wa DNA) kwa sababu mikondo ya usuli ya capacitive katika vipimo vya CV huficha mikondo ya Faradaic 26 .Data kwa kila kisanduku kwenye kisanduku kina vipimo kutoka kwa elektrodi 5. Vipimo vyote vinatumia seti sawa ya elektrodi ili kuepuka makosa ya kipimo kutokana na tofauti ya electrode-to-electrode.Tuliona mwelekeo unaoongezeka wa DPV na CV kupima mikondo ya kilele kwa viwango vya chini vya DNA. , tena (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ ikilinganishwa na \(117) ) fragment.Hii inaambatana na mwelekeo unaotarajiwa wa utangazaji wa elektrodi ulioripotiwa katika kazi yetu ya awali.The adsorption ya tata ya MB-DNA inawezesha uhamisho wa malipo kwenye electrode, ambayo inachangia kuongezeka kwa sasa ya kilele.Tafiti nyingine zimeonyesha athari za ukubwa wa oligonucleotide na mlolongo kwenye mwingiliano wa MB-DNA27,28,29,30.Guanine -yaliyomo ya cytosine (GC) ya amplikoni mbili (\(117\,\hbox {bp}\) na \(503\,\hbox {bp}\)) yalikuwa takriban 50%, ikionyesha kwamba uchunguzi Tofauti inatokana na hadi urefu wa amplikoni.Hata hivyo, kwa viwango vya juu vya DNA (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), kwa \(503\,\hbox {bp} \) na \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) kwa \(117\,\hbox {bp}\)), tunaona vikuzaji viwili mikondo ya kilele cha subs hupunguzwa katika vipimo vya DPV na CV.Hii ni kwa sababu MB hujaa na kuingiliana kati ya jozi za msingi za DNA, na kusababisha kizuizi cha steric cha shughuli ya redox ya kikundi kinachoweza kupunguzwa katika MB31,32.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
Chumvi iliyopo katika mchanganyiko mkuu wa PCR huingilia mwingiliano wa kielektroniki kati ya MB na DNA, kwa hivyo kwa kuongeza \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) na \({50} \,{\ upmu \hbox {M}}\) MB ya bidhaa iliyosafishwa ya gel ili kuchunguza athari ya chumvi kwenye mwingiliano wa MB-DNA. Kama inavyoonyeshwa kwenye Mchoro wa 3, tuliona kwamba kwa viwango vya juu vya DNA (\(>{2}\,{\ hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) na \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) kwa \(117\,\hbox {bp} \)), katika DPV na CV Uongezaji wa chumvi haukuathiri sana vipimo (angalia Mchoro S2 katika Taarifa ya Ziada kwa voltammograms wakilishi). viwango vya chini vya DNA, kuongeza kwa chumvi hupunguza sana unyeti, na kusababisha hakuna mabadiliko makubwa katika sasa na mkusanyiko wa DNA. Athari mbaya sawa za chumvi kwenye mwingiliano wa MB-DNA na kuingiliana zimeripotiwa hapo awali na watafiti wengine33,34.\(\hbox { Mg}^{2+}\) mikondo hufungamana na uti wa mgongo hasi wa fosfeti wa DNA, na hivyo kuzuia mwingiliano wa kielektroniki kati ya MB na DNA. Katika viwango vya juu vya DNA, kizuizi kikali cha MB zinazofanya kazi kwa redoksi husababisha mikondo ya kiwango cha chini, kwa hivyo mwingiliano wa kielektroniki. haiathiri kwa kiasi kikubwa mwitikio wa kihisi. Jambo kuu ni kwamba kihisia hiki kinafaa zaidi kutambua viwango vya juu vya DNA (mara chache \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) au zaidi), kwa kikamilifu- Usindikaji wa kiotomatiki wa sampuli za maji ya mazingira, ambapo utakaso wa jeli wa bidhaa za PCR unaweza usiwezekane.
Eneo lililo chini ya mkondo wa kunyonya kwa masafa ya urefu wa 600–700 \(\hbox {nm}\) kwa viwango mbalimbali vya DNA iliyochanganywa na \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) pamoja na bila chumvi (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) pamoja na bila chumvi (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/) {\upmu \hbox {l}}}\) Viwango vya DNA vinavyolingana na \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB sampuli Hakuna DNA.
Ili kuthibitisha zaidi matokeo yaliyo hapo juu, tulifanya vipimo vya macho kwa kutumia spectrophotometer ya UV/Vis (Thermo Scientific Multiskan GO), sampuli \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) zilitumika kwa kila moja. Kipimo.Sahihi ya unyonyaji hupungua kwa kuongezeka kwa mkusanyiko wa DNA, kama inavyoweza kuonekana kutoka kwa mwelekeo wa eneo chini ya mkondo wa kunyonya kwa masafa ya urefu wa mawimbi \(600\,\hbox {nm}\) hadi \(700\,\hbox { nm}\) , kama inavyoonyeshwa kwenye Kielelezo 4 (wigo wa unyonyaji umeonyeshwa kwenye Mchoro S3 katika Maelezo ya Ziada). Kwa sampuli zilizo na viwango vya DNA chini ya \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), hakukuwa na tofauti kubwa ya uchukuaji kati ya sampuli zenye DNA na MB pekee (kwa \(503\,\hbox {bp}\) na \(117\,\hbox {bp}\) vipande vya urefu), ikionyesha kutokuwepo kwa kizuizi cha steric cha MB ya redox-active. Katika viwango vya juu vya DNA, tuliona kupungua kwa taratibu kwa ishara ya kunyonya na tulibainisha kupungua kidogo kwa kunyonya mbele ya chumvi. Matokeo haya yalihusishwa na molekuli. mwingiliano na uzuiaji steric na mrundikano wa msingi katika mahuluti ya DNA.Matokeo yetu yanawiana na ripoti katika fasihi kuhusu tafiti za kimaadili za mwingiliano wa MB-DNA unaohusisha hipokromatiki na viwango vya nishati vilivyopunguzwa katika \(\pi\)–\(\pi ^*\ ) mabadiliko ya kielektroniki kutokana na mwingiliano wa Tabaka 36, 37, 38.
Electrophoresis ya jeli ya Agarose ya fagio Phi6: Bidhaa za PCR za urefu \(117\,\hbox {bp}\) na \(503\,\hbox {bp}\) kutoka kwa sampuli za maji ya ziwa.M-DNA marker;Udhibiti wa NTC-no-template, primers zenye amplicons sambamba;Udhibiti mzuri wa PC;Sampuli za maji ya ziwa 1, 2, 3-isiyochanganywa (1:1) kwa rangi tatu. Mkanda unaonekana kwenye \(\takriban 50\,\hbox {bp}\) kutokana na oligonucleotidi ambazo hazijatumika katika \(503\,\ hbox {bp}\) njia.
Tulikagua matumizi ya kitambuzi kwa kutumia sampuli za maji ya Ziwa la Powai zilizowekwa kwa Phi6 phage. Viwango vya RNA vilivyotenganishwa kutoka kwa sampuli za maji ya spiked ni kati ya 15.8–\({19.4}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox { ml}}\), huku zile zilizotengwa na kusimamishwa kwa fagi iliyosafishwa RNA ilikadiriwa kuwa \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) yenye ufanisi wa uokoaji wa takriban 1. %.RNA ilinakiliwa kinyume kuwa cDNA na kutumika kama kiolezo cha PCR na qPCR. Ukubwa wa bidhaa ulithibitishwa na electrophoresis ya jeli ya agarose (Mchoro 5) kabla ya kufanyiwa majaribio na kitambuzi. Sampuli hizi hazijasafishwa jeli na kwa hivyo zina vipengele vyote vya PCR kama pamoja na amplikoni zinazovutia. Thamani za Ct zilizorekodiwa wakati wa qPCR (Jedwali la 1) zilionyeshwa kuwiana na mkusanyiko wa RNA iliyotengwa kutoka kwa sampuli za maji zilizoinuka. Thamani ya Ct huonyesha idadi ya mizunguko inayohitajika kwa mawimbi ya umeme. kuzidi kizingiti au mawimbi ya mandharinyuma. Thamani za juu zaidi za Ct zinaonyesha viwango vya chini vya violezo na kinyume chake. Thamani za Ct za sampuli za NTC zilikuwa za juu kama ilivyotarajiwa. Tofauti katika \(\takriban 3\) thamani za Ct kati ya udhibiti chanya na sampuli ya jaribio inaonyesha zaidi kuwa kila sampuli ya jaribio ina takriban kiolezo cha 1% ikilinganishwa na kidhibiti chanya.Tumejadili hapo awali kwamba amplikoni ndefu husababisha usikivu bora.Kukuza vipande virefu vilivyotengwa kutoka kwa sampuli za mazingira tofauti ni changamoto kutokana na hasara. ya ukolezi mdogo wa virusi na uharibifu wa RNA. Hata hivyo, kwa uboreshaji wa virusi vyetu na itifaki ya ukuzaji wa PCR, tuliweza kuimarisha kwa ufanisi kipande cha \(503\,\hbox {bp}\) kwa ajili ya hisia za kielektroniki.
Mchoro wa 6 unaonyesha matokeo ya kihisia cha kielektroniki cha amplikoni ya \(503\,\hbox {bp}\) ya kipande, vyote vikitumia cDNA isiyochanganyika kama kiolezo (1:1) na cDNA iliyochanganywa mara 100 kama kiolezo (1:100 ) iliyotekelezwa ya PCR. , ikilinganishwa na NTC na PC (angalia Kielelezo S4 katika Taarifa ya Ziada kwa voltammograms wakilishi).Kila kisanduku kwenye sehemu ya sanduku kwenye Mchoro 6 kina vipimo kutoka kwa sampuli tatu kwenye elektrodi 5. Elektrodi sawa zilitumiwa kupima sampuli zote ili kuepuka makosa kutokana na electrode Tofauti ya -to-electrode. Ikilinganishwa na vipimo vya CV, vipimo vya DPV vinaonyesha azimio bora zaidi ili kutofautisha sampuli za majaribio na Kompyuta kutoka kwa NTCs kwa sababu, kama ilivyotajwa hapo awali, mikondo ya Faradaic imefichwa kwa sababu ya mikondo ya nyuma ya capacitive katika mwisho. Kwa amplikoni ndefu, tuliona kwamba udhibiti hasi (NTC) ulisababisha mikondo ya juu ya CV na DPV inayohusiana na udhibiti chanya, ilhali sampuli za majaribio chanya na zisizo na kipimo zilionyesha urefu sawa wa mikondo ya kilele cha DPV. Thamani iliyopimwa na wastani kwa kila isiyojumuishwa (1: 1) ) sampuli ya majaribio na Kompyuta inaweza kutatuliwa kwa uwazi kutoka kwa pato la kihisi kwa sampuli ya NTC, wakati azimio la sampuli iliyoyeyushwa ya 1:100 haijatamkwa kidogo. (njia ambazo hazijaonyeshwa kwenye Kielelezo 5), na mikondo ya kilele cha DPV na CV zilifanana na zile zilizotarajiwa kwa NTC. Matokeo ya kipande cha \(117\,\hbox {bp}\) yanaonyeshwa kwenye Taarifa ya Ziada. Udhibiti ulisababisha mwitikio wa kielektroniki kutoka kwa sensor ya PCB kwa sababu ya utangazaji wa MB ya bure kwenye elektrodi na mwingiliano wa MB na oligonucleotide ya msingi yenye nyuzi moja. Kwa hivyo, kila wakati sampuli inapojaribiwa, udhibiti hasi lazima uendeshwe na kilele cha sasa cha sampuli ya jaribio ikilinganishwa na kiwango cha juu kinachopatikana kwa udhibiti hasi ili kufikia kipimo cha tofauti (jamaa)39,40 ili kuainisha sampuli ya jaribio kuwa chanya au hasi.
(a) DPV, na (b) Mkondo wa kilele wa CV kwa utambuzi wa kemikali ya kielektroniki wa vipande vya \(503\,\hbox {bp}\) katika sampuli za maji ya ziwa. Sampuli za majaribio zilipimwa katika nakala tatu na ikilinganishwa na hakuna vidhibiti vya violezo (NTC) na udhibiti chanya (PC).
Matokeo yetu yanaonyesha njia tofauti zinazoathiri utendaji wa vihisi vya kielektroniki vya amplikoni za urefu tofauti kwa DNA tofauti, na viwango vinavyothibitishwa na vipimo vya macho kwa kutumia spectrophotometer ya UV/Vis. Uchunguzi wetu unasisitiza umaizi kwamba vipande virefu vya DNA hufikia \(\takriban\) \(500\,\hbox {bp}\) inaweza kugunduliwa kwa unyeti wa juu zaidi na kwamba uwepo wa chumvi kwenye sampuli hauathiri unyeti wa DNA unaoathiri unyeti wa juu (mara chache \({\hbox {ng}/{\upmu) \hbox {l}}}\) na zaidi).Aidha, tulichunguza athari za aina tofauti za sampuli, ikiwa ni pamoja na amplikoni zilizosafishwa gel na bila kuongezwa chumvi, na kuongeza sampuli za maji ya ziwa katika vipimo vya DPV na CV.Tuliona kuwa DPV ilitoa azimio bora zaidi, kwa kuwa mkondo wa nyuma wa capacitive pia huathiri kipimo cha CV, na kuifanya kuwa nyeti sana.
Ukuzaji wa vipande virefu hutegemea uadilifu wa RNA ya virusi vya jenasi. Tafiti kadhaa zimeonyesha kwamba upanuzi wa vipande virefu sio ufanisi kila wakati kutokana na uharibifu wa RNA katika mazingira na uwezekano wa kuunganisha wakati wa kutengwa11,41,42,43,44 .Tuliona kwamba mbinu ya mkusanyiko wa virusi vya PEG ilikuwa na ufanisi zaidi katika kuzingatia fagio Phi-6 iliyochongoka katika sampuli za maji ya ziwa kuliko mbinu ya mkusanyiko wa virusi inayotokana na hidroksidi ya alumini.Uwezo wa kugundua vipande virefu vya DNA ulithibitika kushinda hitaji la multiplex PCR. ili kukuza violezo vingi vya urefu mfupi na kupunguza uwezekano wa kutofautisha mahususi.
Sampuli za kibayolojia ni chache, kwa hivyo kuna haja ya kuunda kihisia kibayolojia ambacho kinahitaji sampuli chache zaidi za majaribio.Elektroni za ENIG PCB zilizotumika katika utafiti huu zilihitaji tu \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\\" ) sampuli za majaribio ili kufunika eneo linalofaa la elektrodi. Zaidi ya hayo, elektrodi hiyo hiyo inaweza kutumika tena baada ya kusafisha kabla ya kutoa sampuli inayofuata. Sampuli zilizoimarishwa hazihitaji kuongezwa kwa kemikali zozote isipokuwa buluu ya methylene, ambayo ni ya bei nafuu. na kemikali inayotumika kwa kawaida. Kwa kuwa kila elektrodi hugharimu takriban $0.55 (au INR 40) kutengeneza, kihisia hiki kinaweza kuwa mbadala wa gharama nafuu kwa teknolojia zilizopo za ugunduzi.Jedwali la 2 linaonyesha ulinganisho wa kazi hii na vitambuzi vingine vilivyoripotiwa katika fasihi kwa muda mrefu. Vipande vya DNA katika sampuli tofauti.
Ikizingatiwa kwamba itifaki za ugunduzi wa kemikali za kielektroniki zenye msingi wa MB zinategemea umaalum wa PCR, kizuizi kikubwa cha njia hii ni uwezekano wa ukuzaji usio maalum katika sampuli tofauti kama vile maji machafu na maji ya ziwa au kutumia vianzilishi vya kiwango cha chini cha usafi. Ili kuboresha usikivu wa mbinu za utambuzi wa kielektroniki kwa ajili ya kutambua DNA ya bidhaa za PCR ambazo hazijasafishwa kwa kutumia elektrodi za ENIG PCB ambazo hazijarekebishwa, ni muhimu kuelewa vyema hitilafu zinazoletwa na dNTP na vianzio visivyotumika, na kuboresha hali ya athari na itifaki za majaribio. Vigezo vya ziada vya fizikia kama vile pH, halijoto na kibayolojia. mahitaji ya oksijeni (BOD) ya sampuli ya maji yanaweza pia kuhitaji kupimwa ili kuboresha usahihi wa kipimo.
Kwa kumalizia, tunapendekeza kihisi cha kielektroniki cha ENIG PCB cha bei ya chini kwa ajili ya kugundua virusi katika sampuli za mazingira (maji ya ziwa). Tofauti na elektrodi za oligonucleotide zisizohamishika au substrates maalum za kuhisi DNA ambazo zinahitaji hifadhi ya cryogenic ili kudumisha usikivu,53,54 mbinu yetu inatumia PCB ambayo haijabadilishwa. elektroni zenye maisha marefu ya rafu na zisizo na mahitaji maalum ya uhifadhi na kwa hivyo zinafaa kwa uundaji wa suluhu za kipimo kwa uchakataji otomatiki wa sampuli uliowekwa katika LMICs. Kichunguzi kinatumia rangi za bei ghali za DNA-intercalating redox (MB) ili kugundua haraka amplikoni lengwa. Ukuzaji usio maalum. kawaida katika sampuli za kimazingira hupunguza umaalum wa njia hii ya kuhisi kwa sababu ya ufungaji usio maalum wa MB kwa oligonucleotides zenye nyuzi moja na mbili. Kwa hiyo, umaalum wa mtihani huu unategemea uboreshaji wa primers na hali ya majibu ya PCR. Aidha, CV na mikondo ya kilele cha DPV inayopatikana kutoka kwa sampuli zilizojaribiwa inapaswa kufasiriwa kulingana na majibu yaliyopatikana kutoka kwa udhibiti hasi (NTC) kwa kila jaribio. Miundo ya kihisia cha kielektroniki na mbinu zilizowasilishwa katika kazi hii zinaweza kuunganishwa na sampuli otomatiki ili kuunda kiotomatiki kikamilifu na cha chini. -cost solution ambayo inaweza kukusanya na kuchambua sampuli na kusambaza matokeo bila waya kwenye maabara .
Cashdollar, J. & Wymer, L. Mbinu za mkusanyiko wa awali wa virusi kutoka kwa sampuli za maji: mapitio na uchambuzi wa meta wa tafiti za hivi karibuni.J.Application.microorganism.115, ukurasa wa 1-11 (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL Virusi vya Maji: Vizuizi vya maji salama ya kunywa.PLoS Pathogens.11, E1004867 (2015).
Shrestha, S. et al.Wastewater epidemiology kwa uchunguzi wa kiwango kikubwa wa gharama nafuu wa COVID-19 katika nchi zenye kipato cha chini na cha kati: changamoto na fursa.Water 13, 2897 (2021).
Palecek, E. & Bartosik, M. Nucleic acid electrochemistry.Kemikali.Rev.112, 3427–3481 (2012).
Tani, A., Thomson, AJ & Butt, JN Methylene bluu kama kibaguzi wa kemikali ya kielektroniki wa oligonucleotides yenye nyuzi moja na mbili isiyosogezwa kwenye substrates za dhahabu. Mchambuzi 126, 1756–1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ Kulinganisha kwa Cation na Anion Intercalators kwa Upitishaji wa Electrochemical wa Mchanganyiko wa DNA na Uhamisho wa Electron wa Muda Mrefu.Electrochemistry.comminicate.6, 648-654 (2004).
Wong, EL & Gooding, JJ Uhamishaji wa malipo kupitia DNA: DNA ya kielektroniki inayochaguliwa biosensor.anus.Chemical.78, 2138–2144 (2006).
Fang, TH et al.Kifaa cha microfluidic cha wakati halisi cha PCR chenye utambuzi wa elektroni.kihisio cha kibiolojia.Bioelectronics.24, 2131–2136 (2009).
Shinda, BY et al.Utafiti wa utaratibu wa kuashiria na uthibitishaji wa utendaji wa mfumo wa PCR wa kielektroniki wa wakati halisi kulingana na mwingiliano wa methylene bluu na DNA.Mchambuzi 136, 1573–1579 (2011).
Ramirez-Chavarria, RG et al.Loop-mediated isothermal-based amplification electrochemical sensor kwa ajili ya kugundua sars-cov-2 katika sampuli za maji machafu.J.Mazingira.Kemikali.Uingereza.10, 107488 (2022).
Kumar, M. et al.Electrochemical sensing ya amplikoni za SARS-CoV-2 zenye elektrodi za PCB. Kihisi kimewashwa.B Kemia.343, 130169 (2021).
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. & Yoshida, H. Ugunduzi mzuri wa SARS-CoV-2 RNA katika sehemu ngumu ya mazingira ya jumla ya maji machafu.science.763, 144587 (2021).
Alygizakis, N. et al.Njia za Uchambuzi za Utambuzi wa SARS-CoV-2 katika Maji Machafu: Itifaki na Mielekeo ya Wakati Ujao.TraC inayovuma anal.Chemical.134, 116125 (2020).
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. & Kashtan, N. Kunusurika kwa bacteriophage Phi6 iliyofunikwa (kinafasi cha SARS-CoV-2) katika matone ya mate yaliyovukizwa yaliyowekwa kwenye nyuso za kioo.science.Rep.10, 1–10 (2020).
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ Udumifu wa kimazingira wa mrithi wa SARS-CoV-2 (Phi6) katika maisha bila malipo amoeba.J.Afya ya Maji 20, 83 (2021).
Mindich, L. Ufungaji sahihi wa vipande vitatu vya genomic vya bacteriophage ya RNA yenye nyuzi mbili\(\varphi\)6.microorganism.Moore.biology.Rev.63, 149–160 (1999).
Pirttimaa, MJ & Bamford, Muundo wa Sekondari wa eneo la ufungaji la DH RNA\(\varphi\)6.RNA 6, 880–889 (2000).
Bonilla, N. et al.Phages on the Tap - Itifaki ya haraka na bora ya kuandaa hifadhi ya maabara ya bacteriophages.PeerJ 4, e2261 (2016).
Muda wa kutuma: Mei-27-2022