پي سي بي اليڪٽروڊس استعمال ڪندي پاڻي جي نمونن ۾ وائرل نيوڪليڪ ايسڊز جي اليڪٽررو ڪيميڪل سينسنگ لاءِ ڊگھا ايمپليڪن بهتر حساسيت فراهم ڪن ٿا

Nature.com تي وڃڻ لاءِ توهان جي مهرباني. توهان جيڪو برائوزر ورشن استعمال ڪري رهيا آهيو ان ۾ CSS لاءِ محدود سپورٽ آهي. بهترين تجربي لاءِ، اسان تجويز ڪريون ٿا ته توهان هڪ اپڊيٽ ٿيل برائوزر استعمال ڪريو (يا انٽرنيٽ ايڪسپلورر ۾ مطابقت واري موڊ کي بند ڪريو). ان دوران، پڪ ڪرڻ لاءِ جاري مدد، اسان سائيٽ کي بغير اسٽائل ۽ جاوا اسڪرپٽ ڏيکارينداسين.
ماحولياتي نمونن جي نگراني جي اهميت کي COVID-19 جي وبائي مرض جي شروعات کان وٺي تمام گهڻو ساراهيو ويو آهي، ۽ ڪجهه مانيٽرنگ ڪوششون سون جي معيار کي استعمال ڪندي انجام ڏنيون ويون آهن، جيتوڻيڪ qPCR تي ٻڌل ٽيڪنالاجيون قيمتي آهن. اليڪٽررو ڪيميڪل ڊي اين اي بايوسينسر هڪ ممڪن طور تي قيمتي اثرائتي مهيا ڪري سگھن ٿا. گھٽ ۽ وچين آمدني وارن ملڪن ۾ ماحولياتي پاڻي جي نمونن جي نگراني لاءِ حل. هن ڪم ۾، اسان ENIG استعمال ڪندي Phi6 phage مان حاصل ڪيل amplicons جي اليڪٽرڪ ڪيميڪل چڪاس جو مظاهرو ڪريون ٿا جيڪي اسپيڪ ٿيل ڍنڍ جي پاڻيءَ جي نمونن (SARS-CoV-2 لاءِ مشهور سروگيٽ) کان الڳ ٿيل آهن. مٿاڇري ترميم کان سواء PCB electrodes مڪمل ڪرڻ لاء.جنس. اليڪٽررو ڪيميڪل سينسر جو جواب مڪمل طور تي ٻن ڊي اين اي حصن جي مختلف ڊگھائي (\({117}\,\hbox {bp}\) ۽ \({503}\,\hbox {bp}\))، ۽ پي سي آر ماسٽر ميڪس ۾ لوڻ جو اثر ميٿيلين بليو (ايم بي) ڊي اين اي رابطي تي. اسان جا نتيجا ظاهر ڪن ٿا ته ڊي اين اي جي ٽڪڙن جي ڊيگهه خاص طور تي اليڪٽررو ڪيميڪل حساسيت کي طئي ڪري ٿي ۽ هن ڪم ۾ ڏيکاري ٿو ته پي سي آر شين جي جيل صاف ڪرڻ کان سواءِ ڊگھي امپليڪن کي ڳولڻ جي صلاحيت آهي. پاڻي جي نموني جي صحيح ماپ لاء اهم.وائرل لوڊ لاء مڪمل طور تي خودڪار حل چڱي طرح.
پاڻي مان پيدا ٿيندڙ وائرس جي منتقلي کي 1940 واري ڏهاڪي کان وٺي عوامي صحت لاءِ خطرناڪ قرار ڏنو ويو آهي، پوليو ۽ هيپاٽائيٽس E1 جي پاڻيءَ مان منتقلي جي پهرين ثبوت سان. ورلڊ هيلٿ آرگنائيزيشن (ڊبليو ايڇ او) ڪيترن ئي واٽر بورن وائرل پيٿوجنز جي درجه بندي ڪئي آهي جيڪي اعتدال کان اعليٰ صحت جي اهميت رکن ٿا.2. روايتي وائرس ڳولڻ جا طريقا سون جي معياري qPCR تي ٻڌل ٽيڪنالاجي تي ڀاڙين ٿا، جيڪي انتهائي حساس ۽ مخصوص آهن، پر ماهر اهلڪارن جي ضرورت هوندي آهي ته اهي قيمتي اوزار استعمال ڪندي ليبارٽري ۾ ٽيسٽ ڪن. جڏهن ته، گهٽ ۽ وچين آمدني وارن ملڪن (LMICs) ۾ محدود وسيلن سان، انساني ماحولياتي پاڻي جي نموني جي نگراني جي مقابلي ۾ نموني جي جاچ کي ترجيح ڏيڻ جو امڪان آهي. ان ڪري، گهٽ ۽ وچين آمدني وارن ملڪن ۾ پاڻي ۽ گندي پاڻي جي نمونن جي پائيدار، حقيقي وقت مانيٽرنگ لاءِ متبادل گهٽ لاڳت جا طريقا گهربل آهن، جيئن بيماريءَ جي پکڙجڻ جي ابتدائي خبرداري، ان ڪري انهن کي وائرس جي وبائي مرض جي سخت سماجي معاشي اثرن کان بچائي ٿو. نيوڪليڪ ايسڊز لاءِ گهٽ قيمت وارا اليڪٽرڪ ڪيميڪل بايوسينسر هن غير ضروري ضرورت کي پورو ڪرڻ لاءِ هڪ امڪاني امڪاني حل فراهم ڪري سگهن ٿا. انهن مان ڪيترائي ڊي اين اي بائيو سينسر ان حقيقت سان ڪم ڪن ٿا ته مڪمل ڪندڙ ڊي اين اي اسٽرينڊز اليڪٽرروڊ تي متحرڪ آهن. مٿاڇري ۽ هائبرڊائيز ڪريو جڏهن هڪ ملندڙ تسلسل نموني ۾ موجود آهي. ان کان پوء ريڊڪس ميڊيٽرز جهڙوڪ پوٽاشيم آئرن/فيروڪائنائيڊ استعمال ڪندي مختلف برقي ڪيميائي ٽيڪنالاجي ذريعي سگنل ۾ تبديل ٿي سگهي ٿو. ميٿيلين بليو (ايم بي) هڪ اهڙو ريڊڪس-فعال ماليڪيول آهي، جنهن ۾ ڊبل اسٽرينڊ ڊي اين اي (dsDNA) ۾ وچڙجڻ جي خبر ڏني وئي آهي ان کان علاوه سنگل اسٽرينڊ ڊي اين اي 5,6 سان ان جي وڌيڪ غير مخصوص پابند. MB-DNA ڪمپليڪس ٺاهڻ لاءِ MBs جي وچ واري نوعيت انهن کي ڪيترن ئي الیکٹرو ڪيميڪل ڊي اين اي ۾ ريڊڪس ميڊييٽرز جي طور تي هڪ مشهور انتخاب بڻائي ٿي. sensor configurations5,6,7,8,9.جيتوڻيڪ MB کان DNA جو وچڙ غير مخصوص آهي، ۽ هن اليڪٽرڪ ڪيميڪل سينسر جي خصوصيت جو دارومدار گهڻو ڪري PCR يا isothermal amplification لاءِ استعمال ٿيندڙ پرائمر جي پاڪيزگي تي آهي، پر اهو اصل کي لاڳو ڪرڻ لاءِ مناسب آهي. DNA ڪنسنٽريشن ماپ 9 جي متبادل جي طور تي اليڪٽررو ڪيميڪل تي ٻڌل qPCR يا فلوروسينس isothermal amplification. هڪ اهڙي عمل ۾، Won et al. سون جي اليڪٽرروڊس جي مٿاڇري کي حقيقي وقت لاءِ 6-mercapto-1-hexanol (MCH) سان تبديل ڪيو ويو. پي سي آر ايمپليڪن جي ماپ MB سان ڊفرنشل پلس وولٽميٽري (DPV) 9 استعمال ڪندي. ٻين حالتن ۾، Ramirez et al. RT-LAMP رد عمل ذريعي گندي پاڻي ۾ SARS-CoV-2 جو پتو لڳائڻ MB سان اسڪرين پرنٽ ٿيل اليڪٽروڊس سان. پلاٽينم اليڪٽروڊس پڻ ڪيا ويا آهن. مائڪرو فلائيڊڪ پي سي آر پليٽ فارم ۾ سيٽو اليڪٽروڊس جي طور تي استعمال ڪيو ويو آهي اليڪٽررو ڪيميڪل طريقي سان رد عمل دوران ايمپليڪن کي ڳولڻ لاءِ 8 . انهن سڀني مطالعي کي اليڪٽروڊس جي سطح جي ترميم جي ضرورت آهي، انهن فنڪشنل ٿيل اليڪٽروڊس جي استحڪام لاءِ خاص اسٽوريج گهرجن جي ڪري پيداوار ۽ آپريٽنگ خرچن ۾ اضافو.
ڍنڍ جي پاڻي جي نمونن ۾ مرڪوز وائرل ذرات مان حاصل ڪيل ايمپليڪن جي اليڪٽررو ڪيميڪل ڳولڻ لاءِ ڪم جي فلو جو اسڪيميٽ.
اسان تازو SARS-CoV-2 amplicons جي اليڪٽررو ڪيميڪل سينسنگ جو مظاهرو ڪيو گھٽ قيمت پرنٽ ٿيل سرڪٽ بورڊ (PCB) اليڪٽرروڊس جي بنياد تي DPV ۽ cyclic voltammetry (CV) تي مبني طور تي MB-DNA ڪمپليڪس جي جذب ذريعي غير تبديل ٿيل اليڪٽرروڊس جي مٿاڇري تي تبديليون. موجوده 11.اسان رپورٽ ڪريون ٿا ته ڊگھا ڊي اين اي ٽڪرا (N1-N2, \({943}\, \hbox) CDC-سفارش ٿيل N1 فارورڊ ۽ N2 ريورس پرائمر استعمال ڪندي ننڍا ننڍا ٽڪرا {bp}\)) سينسر جي جواب ۾ بهتر لڪير ڏيکاريا. (N1, \(72\,\hbox {bp}\)) N1 فارورڊ ۽ N1 ريورس پرائمر سيٽ استعمال ڪندي ٺاهيا ويا آهن. اهي اڀياس رپورٽ ڪيا ويا آهن ڊي اين اي ڊيليوشن استعمال ڪندي تيار ڪيل نيوڪليز فري پاڻي ۾. پليٽ فارم پڻ استعمال ڪيو ويو SARS-CoV کي ڳولڻ لاءِ -2 amplicons in simulated wastewater semple (سارس-CoV-2 RNA سان ڪل RNA نمونن کي اسپائڪ ڪرڻ سان حاصل ڪيو ويو آهي). ڇاڪاڻ ته RNA کي علحدگيءَ ۽ هيٺئين دڙي جي پروسيسنگ دوران ڪٽڻ لاءِ حساس هوندو آهي، 12,13 هن متفاوت نموني سان وڏن ٽڪرن کي وڌائڻ ڏکيو آهي. تنهن ڪري، گندي پاڻي ۾ SARS-CoV-2 amplicon جي اليڪٽررو ڪيميڪل سينسنگ جو مظاهرو ننڍو \(72\,\hbox {bp}\) N1 ٽڪرا تائين محدود آهي.
هن ڪم ۾، اسان ENIG PCB-based electrochemical sensing of phage Phi6 جي فزيبلٽي جي تحقيق ڪئي ۽ ڍنڍ جي پاڻيءَ جي نمونن کان الڳ ٿيل (Fig. 1) Phi6 phages سائيز ۾ (80-100 nm) SARS-CoV-2 ۽ هڪ لپڊ جھلي ۽ هڪ اسپائڪ پروٽين پڻ آهي. انهن سببن جي ڪري، بيڪٽيريوفاج Phi6 SARS-CoV-2 ۽ ٻين لفاف ٿيل پيٿوجينڪ آر اين اي وائرس 14,15 لاءِ هڪ مشهور سروگيٽ آهي. آر اين اي کي فيج جي ذرڙن کان ڌار ڪيو ويو آهي سي ڊي اين اي سنٿيسس لاءِ ٽيمپليٽ طور استعمال ڪيو ويو PCR ٻه ڊي اين اي ٽڪرا حاصل ڪرڻ لاءِ 117 ۽ 503 بنيادي جوڑوں جي ڊيگهه ۾. اسان جي پوئين ڪم ۾ \(943\,\hbox {bp}\) N1-N2 ٽڪرن کي وڌائڻ جي چيلنج کي ڏنو ويو، اسان وچولي ڊگھائي ٽڪرن کي نشانو بڻايون ٿا (\(117) \,\hbox {bp}\) ۽ \(503 \,\hbox {bp}\)), موجود پرائمر جي بنياد تي. اليڪٽررو ڪيميڪل سينسر جو جواب منظم طريقي سان وسيع ڪنسنٽريشن رينج تي اڀياس ڪيو ويو (\({10}\,{ \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) to \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) ٻنهي ٽڪرن لاءِ MB جي موجودگي، سينسر جي ردعمل تي لوڻ جو اثر خاص ڪيو ويو آھي ۽ spectrophotometric ماپن جي ذريعي تصديق ڪئي وئي آھي. ھن ڪم جا مکيه ڀاڱا ھيٺ ڏنل آھن:
ڊي اين اي جي ٽڪري جي ڊيگهه ۽ نموني ۾ لوڻ جي موجودگي حساسيت کي سخت متاثر ڪري ٿو.اسان جا نتيجا ظاهر ڪن ٿا ته الیکٹرو ڪيميڪل سرگرمي ايم بي، ڊي اين اي، ۽ وولٽميٽرڪ ردعمل ۾ سينسر جي رابطي جي مختلف ميکانيزم تي منحصر آهي، ڊي اين جي ڪنسنٽريشن ۽ ڊگھائي تي منحصر آهي، ڊگهو ٽڪرا وڌيڪ حساسيت ڏيکاري ٿو، جيتوڻيڪ لوڻ جي وچ ۾ برقياتياتي رابطي تي منفي اثر آهي. ايم بي ۽ ڊي اين اي.
DNA ڪنسنٽريشن غير تبديل ٿيل اليڪٽروڊس ۾ MB-DNA رابطي جي ميکانيزم جو تعين ڪري ٿو، اسان ظاھر ڪريون ٿا ته MB-DNA تعامل جا مختلف ميکانيزم DNA ڪنسنٽريشن تي ڀاڙين ٿا. DNA ڪنسنٽريشن تي ننڍي مقدار ۾ \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox) {l}}})، اسان ڏٺو ته اليڪٽررو ڪيميڪل موجوده ردعمل خاص طور تي اليڪٽرروڊ تي MB-DNA جي جذب سان طئي ڪيو ويو هو، جڏهن ته گهٽ ڪنسنٽريشن تي اعلي ڊي اين اي ڪنسنٽريشن تي، اليڪٽررو ڪيميڪل موجوده ردعمل ريڊڪس جي اسٽرڪ انيبيشن ذريعي طئي ڪيو ويو هو. ڊي اين اي بنيادي جوڑوں جي وچ ۾ ايم بي داخل ٿيڻ جي ڪري سرگرمي.
ENIG PCB-based Electrochemical Sensing of Viral Nucleic Acids in Lake Water Samples Phi6-added \(503\,\hbox{bp}\) DNA جي ٽڪڙن جي اليڪٽررو ڪيميڪل چڪاس ذريعي تصديق ڪئي وئي جيڪا پوائي ڍنڍ، IIT ممبئي ڪيمپس مان پاڻي جي نمونن مان حاصل ڪئي وئي. نتيجن جو مرحلو.
عملدرآمد جي گھٽ قيمت ۽ مڪمل طور تي خودڪار مانيٽرنگ سسٽم ۾ انضمام جي امڪاني، oligonucleotides يا اليڪٽروڊس تي aptamers ڊگهي شيلف زندگي سان.
Phage Phi6 Cytoviridae خاندان جو هڪ لفافو dsRNA وائرس آهي جيڪو Pseudomonas syringae کي متاثر ڪري ٿو. Phi6 phage جو جينوم 3 ٽڪرن جي صورت ۾ موجود آهي: S (\(2.95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4.07) \,\hbox {Kb}\)) ۽ L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\)) 16,17. ڇاڪاڻ ته Phi6 فيج هڪ غير pathogenic BSL-1 Pseudomonas strain کي متاثر ڪري ٿو، اهو استعمال ڪرڻ محفوظ آهي. ۽ آساني سان ليبارٽري ۾ پوکي سگھجي ٿو. Phage Phi6 ۽ ان جي ميزبان Pseudomonas syringae کي فيلڪس ڊي هيرل ريفرنس سينٽر فار بيڪٽيريل وائرسز، لاول يونيورسٽي، ڪئناڊا مان خريد ڪيو ويو (حوالو سينٽر ڪيٽلاگ نمبر ترتيبوار HER-102 ۽ HER-1102 آهن) Phi6 phage ۽ ان جي ميزبان کي ريفرنس سينٽر جي هدايتن تي بحال ڪيو ويو. Phage Phi6 کي پليٽ ليسس ۽ ايليوشن ذريعي صاف ڪيو ويو ته جيئن آخري ٽائيٽرز حاصل ڪرڻ لاءِ \(\اٽڪل 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox} ml}}\) (Plaque forming units/milliliters).RNA کي ٺاهيندڙ جي هدايتن مطابق GenElute™ Universal Total RNA Purification Kit (Sigma-Aldrich) استعمال ڪندي صاف ٿيل فيج ذرڙن کان الڳ ڪيو ويو. . 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) ڪٽ پاران مهيا ڪيل آهي. آر اين اي جي ڪنسنٽريشن جو اندازو لڳايو جذبي سان \(260\,\hbox {nm}\).RNA ۾ aliquots ۾ ذخيرو ٿيل هو. ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) جيستائين وڌيڪ استعمال.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) iScript cDNA سنٿيسس کٽ (بايو -Rad Laboratories) ٺاھيندڙ جي ھدايتن تي عمل ڪندي cDNA جي ٺاھ جوڙ لاءِ ٽيمپليٽ طور استعمال ڪيو ويو. مختصر طور تي، ھڪ cDNA سنٿيسس رد عمل 3 مرحلن تي مشتمل آھي: پرائمنگ at \({25}\,{^{\circ}\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min} }\) , \({20}\,{\hbox {min}}\) جو ريورس ٽرانسڪرپشن \({46}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)، ۽ ريورس رڪارڊر ۾ آهي \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) لاءِ \({1}\,{\hbox {min }}\).جڏهن 1٪ agarose gel تي هلايو ويو، ته cDNA ٽي بينڊ ڏيکاريا جيڪي متوقع ٽن آر اين اي ٽڪرن سان ملندڙ جلندڙ هئا (ڊيٽا نه ڏيکاريل آهي). هيٺيان پرائمر 117 ۽ 503 bp جي ڊيگهه جي ٻن ڊي اين اي ٽڪرن کي وڌائڻ لاءِ استعمال ڪيا ويا، miniPCR® mini8 تھرمل سائيڪلر ۾ پي سي آر لاءِ ٽيمپليٽ طور cDNA استعمال ڪندي:
\(117\,\hbox {bp}\) ۽ \(503\,\hbox {bp}\) لاءِ پرائمر M سيگمينٽ جي 1476-1575 نيوڪليوٽائيڊس ۽ ايل سيگمينٽ جي 458-943 نيوڪليوٽائيڊس سان ملندڙ جلندڙ آهن. .سڀني ايمپليفائيڊ پي سي آر پروڊڪٽس کي 1٪ ايگرز جيل تي اليڪٽرروفورس ڪيو ويو، ۽ ايمپليفائيڊ ٽارگيٽ ڊي اين اي کي جيني جيٽ جيل ايڪسٽريشن ڪٽ (Thermo Fisher Scientific) استعمال ڪندي صاف ڪيو ويو.
IIT ممبئي ڪيمپس ۾ هڪ ڍنڍ (Powai Lake, Powai, Mumbai) استعمال ڪئي وئي فيج ذرڙن کي شامل ڪرڻ لاءِ. ڍنڍ جي پاڻي کي هٽائڻ لاءِ \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) جھلي ذريعي فلٽر ڪيو ويو. معطل ٿيل ذرات، ۽ پوءِ Phi6 فيج شامل ڪيو ويو. شامل ڪيو \({1}\,{\hbox {ml}}\) of \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} \) کان \({100}\ ,{\hbox {ml}}\) فلٽر ٿيل ڍنڍ جو پاڻي، ان ۾ \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\). هڪ ننڍڙو aliquot هو. Plaque assay ذريعي وائرل لوڊ جي ماپ لاءِ محفوظ آهي. اسان اسپيڪ ٿيل Phi6 وائرس ذرڙن کي مرڪوز ڪرڻ لاءِ ٻه مختلف طريقا آزمايا: (1) ايلومينيم هائيڊرو آڪسائيڊ جذب ڪرڻ-ورڻ جو طريقو، 19 جنهن کي ماحولياتي نمونن مان ڪيترن ئي لفافي ٿيل آر اين اي وائرسز جي ڪنسنٽريشن جي تصديق ڪئي وئي آهي، ۽ (2) ) polyethylene glycol (PEG) تي ٻڌل وائرس ڪنسنٽريشن جو طريقو فلڊ ايٽ ال کان ترتيب ڏنو ويو.20 .جيئن ته PEG-بنياد واري طريقي جي بحاليءَ جي ڪارڪردگيءَ کي ايلومينيم هائيڊرو آڪسائيڊ طريقي جي ڀيٽ ۾ بهتر ثابت ڪيو ويو، PEG-بنياد طريقو استعمال ڪيو ويو ته جيئن ڍنڍ جي پاڻي جي نمونن مان Phi6 ذرات کي مرڪوز ڪيو وڃي.
PEG جو طريقو هن ريت استعمال ڪيو ويو: PEG 8000 ۽ \(\hbox {NaCl}\) Phi6-اسپيڪ ڍنڍ جي پاڻي جي نمونن ۾ شامل ڪيو ويو 8% PEG 8000 ۽ \(0.2\,\hbox {M} \) \( \ hbox {NaCl}\). نمونا هڪ ​​شيڪر تي لڳل هئا\({4}\,{^{\circ}\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ )، پوءِ سينٽرفيوز ڪيو ويو at \(4700 \,\hbox {g}\) is \({45}\,{\hbox {min}}\). سپرنٽنٽ کي رد ڪريو ۽ pellet کي \({1}\, {\hbox {ml}}\) هڪ ئي سپرنيٽنٽ ۾. سڀ اسپائڪنگ ۽ وائرس ڪنسنٽريشن تجربا ٽي ڀيرا ڪيا ويا. ڪنسنٽريشن کان پوءِ، هڪ ننڍڙو aliquot رکيل هو ريٽائرمينٽ جي ڪارڪردگيءَ جي ماپ لاءِ پلاڪ assay ذريعي. RNA کي الڳ ڪيو ويو جيئن اڳ بيان ڪيو ويو آهي ڪٽ جي فراهم ڪيل ايليوشن بفر ۾\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\) .جيئن ته آر اين اي ڪنسنٽريشن مختلف نمونن کان نمونن تائين مختلف هوندو، ان ڪري \({2}\,{\upmu \ آر اين اي جو hbox {l}}\) ٽنهي ٽنن لاءِ استعمال ڪيو ويندو آهي قطع نظر ان جي ڪنسنٽريشن cDNA synthesis of samples.cDNA synthesis ڪيو ويو جيئن اڳ بيان ڪيو ويو آهي.\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNA. ٽيمپليٽ طور استعمال ڪيو ويو \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR لاءِ 35 سائيڪلن لاءِ وسيع ڪرڻ \(117\,\hbox {bp}\) ۽ \(503\,\hbox { bp}\) ٽڪرا. اهي نمونا "1: 1" جي طور تي ظاهر ڪيا ويا آهن، يعني بغير بغير بغير. A no-template control (NTC) هڪ منفي ڪنٽرول جي طور تي قائم ڪيو ويو، جڏهن ته هڪ سي ڊي اين اي استعمال ڪندي ٺهرايو ويو صاف ٿيل فيج کان الڳ ٿيل آر اين اي استعمال ڪندي. هڪ مثبت ڪنٽرول (PC) لاءِ ٽيمپليٽ جي طور تي. مقداري پي سي آر (qPCR) هڪ Stratagene Mx3000P RT-PCR اوزار ۾ ڪيو ويو شاندار III الٽرا فاسٽ SYBR گرين QPCR ماسٽر ميڪس (Agilent ٽيڪنالاجي) استعمال ڪندي. بيان ڪيو ويو آهي. سائيڪل جي حد (Ct) سڀني نموني لاء رڪارڊ ڪئي وئي هئي. ان کان علاوه، ٺهڪندڙ نمونا هئا \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNA استعمال ڪندي 1:100 فلٽر ٿيل ڍنڍ جي پاڻي ۾ \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR 35 سائيڪلن لاءِ. اهي نمونا "1:100" طور پيش ڪيا ويا آهن.
PCB اليڪٽرروڊز کي ڪمرشل طور تي دستياب گھٽ قيمت Electroless Nickel Immersion Gold (ENIG) پروسيس استعمال ڪندي ٺاهيو ويو آهي بغير اضافي گولڊ پليٽ جي ضرورت جي. ENIG PCB اليڪٽرروڊ جون وضاحتون اسان جي پوئين ڪم ۾ تفصيلي آهن 11. ENIG PCB اليڪٽرروڊس لاءِ، روايتي اليڪٽرروڊ صفائي جا طريقا جهڙوڪ. پرانها محلول يا سلفيورڪ ايسڊ سائڪلڪ وولٽميٽري جي سفارش نه ڪئي وئي آهي ڇاڪاڻ ته اهي سون جي پتلي پرت (ٿلهي \(\تقريبا\) \(100\,\hbox {nm }\)) جي ڇنڊڇاڻ جو سبب بڻجي سگهن ٿا ۽ هيٺان ٽامي جي پرت کي بي نقاب ڪن ٿيون جيڪي ٿلهي آهن. corrosion 21, 22, 23, 24, 25. ان ڪري، اليڪٽروڊس کي IPA سان نم ٿيل lint-free ڪپڙي سان صاف ڪريو. جانچ ڪرڻ لاءِ نمونو \({50}\,{\upmu \hbox {M}) سان ڀريل هو. }\) MB ۾ \({4}\,{^{\circ}\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) آسان داخل ڪرڻ لاءِ. اسان جي پوئين ڪم ۾ ، اسان ڏٺو ته سينسر جي حساسيت ۽ لڪيريت کي ايم بي ڪنسنٽريشن 11 وڌائڻ سان بهتر ڪيو ويو. اسان جي اڳوڻي ڪم ۾ رپورٽ ڪيل اصلاحن جي بنياد تي، اسان استعمال ڪيو \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB هن مطالعي ۾ ڊي اين اي کي شامل ڪرڻ لاءِ ڪنسنٽريشن. ڊبل اسٽرينڊ ڊي اين اي (ds-DNA) جي اليڪٽررو ڪيميڪل سڃاڻپ anionic يا cationic intercalators استعمال ڪري حاصل ڪري سگهجي ٿي. جيتوڻيڪ anionic intercalators DNA کي بهتر سليڪٽيٽي سان ڳولي ٿو، انهن کي رات جو انڪيوبيشن جي ضرورت آهي، نتيجي ۾ وڌيڪ وقت معلوم ٿئي ٿو. ٻئي طرف، ڪيشنڪ انٽرڪيليٽرز جهڙوڪ MB کي DS-DNA6 جي اليڪٽررو ڪيميڪل چڪاس ڪرڻ لاءِ لڳ ڀڳ \({1}\,{\hbox {h}}\) ننڍو انڪيوبيشن وقت جي ضرورت هوندي آهي. هر ماپ ۾ ٽيسٽ ڪرڻ لاءِ نموني کي ورهائڻ شامل آهي. اليڪٽرروڊ\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), پوءِ ٻئي نموني سان اڳتي وڌڻ کان اڳ IPA-نم ٿيل ريگ سان صاف ڪريو.هڪ ماپ. هر نموني کي 5 مختلف اليڪٽروڊس تي آزمايو ويو جيستائين ٻي صورت ۾ بيان نه ڪيو ويو. DPV ۽ CV ماپون استعمال ڪيون ويون آهن هڪ PalmSens Sensit Smart potentiostat، ۽ PSTrace سافٽ ويئر استعمال ڪيو ويو potentiostat ترتيب ۽ ڊيٽا جي حصول لاءِ، بشمول چوٽي جي موجوده حسابن. هيٺيون سيٽنگون استعمال ڪيون ويون آهن. DPV ۽ CV ماپن لاءِ:
DPV: برابري وارو وقت = \(8\,\hbox {s}\), وولٽيج اسٽيپ = \(3\,\hbox {mV}\), پلس وولٹیج = \(25\,\hbox {mV}\), نبض جو عرصو = \(50\,\hbox {ms}\), اسڪين جي شرح = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: برابري وارو وقت = \(8\,\hbox {s}\), وولٽيج اسٽيپ = \(3\,\hbox {mV}\), سوائپ جي شرح = \({300}\,\hbox {mV/s }\)
ڊي اين اي ڪمپليڪس جي وولٽاموگرامس مان حاصل ڪيل چوٽي کرنٽ \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV، (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
DPV ۽ CV voltammograms حاصل ڪيا ويا ENIG PCB اليڪٽروڊس \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB DNA سان پيچيده (10–\({20}\,{\ hbox {ng) }/{\upmu \hbox {l}}}\) يعني 0.13–\({0.26}\,{\upmu \hbox {M}}\) \(117\,\hbox {bp}\) ۽ 0.03 لاءِ -\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) \(503\,\hbox {bp}\) لاءِ). نمائندي وولٽاموگرامس ڏيکاريا ويا آهن شڪل S1 ۾ ضمني معلومات ۾. شڪل 2 ڏيکاري ٿو نتيجا. DPV ۽ CV جي ماپن (چوٽي ڪرنٽ) جيل صاف ٿيل پي سي آر پروڊڪٽس استعمال ڪندي. CV ماپن جي مقابلي ۾، DPV ماپون وڌيڪ حساسيت ڏيکارين ٿيون (موجوده ڊي اين اي ڪنسنٽريشن جي ڪم جي طور تي) ڇاڪاڻ ته سي وي جي ماپن ۾ پس منظر ڪيپيسيٽو وھارن کي لڪائي ٿو فراڊائيڪ ڪرنٽ 26. ڊيٽا باڪس پلاٽ ۾ هر دٻي لاءِ 5 اليڪٽروڊس مان ماپون شامل آهن. سڀ ماپون اليڪٽروڊ کان اليڪٽروڊ ويريشن جي ڪري ماپن جي غلطين کان بچڻ لاءِ اليڪٽروڊس جو ساڳيو سيٽ استعمال ڪن ٿيون. اسان ڊي اين اي جي گهٽ ڪنسنٽريشن لاءِ ڊي پي وي ۽ سي وي ماپ ٿيل چوٽي کرنٽ ۾ وڌندڙ رجحان ڏٺو. , long (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ جي مقابلي ۾ \(117) ) ٽڪرا. هي اسان جي پوئين ڪم ۾ ڄاڻايل اليڪٽرروڊ جذب جي متوقع رجحان سان مطابقت رکي ٿو. MB-DNA ڪمپليڪس جو جذب اليڪٽرروڊ تي چارج جي منتقلي کي آسان بڻائي ٿو، جيڪو ڪرنٽ جي چوٽي کي وڌائڻ ۾ مدد ڪري ٿو. ٻين اڀياس ڏيکاريا آهن oligonucleotide سائيز ۽ تسلسل جو اثر MB-DNA intercalation 27,28,29,30. Guanine -cytosine (GC) مواد ٻن amplicons (\(117\,\hbox {bp}\) ۽ \(503\,\hbox {bp}\)) لڳ ڀڳ 50٪ هو، اهو ظاهر ڪري ٿو ته مشاهدي جي فرق جو سبب آهي. جڏهن ته، وڌيڪ ڊي اين اي ڪنسنٽريشن لاءِ (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), \(503\,\hbox {bp}) لاءِ \) ۽ \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) \(117\,\hbox {bp}\) لاءِ)، اسان مشاهدو ڪريون ٿا ٻه واڌارا DPV ۽ CV ٻنهي ماپن ۾ سبس جي چوٽيءَ جا وهڪرا گهٽجي ويندا آهن. اهو ئي سبب آهي جو MB ڊي اين اي جي بنيادي جوڙن جي وچ ۾ سير ٿئي ٿو ۽ وچڙجي ٿو، جنهن جي نتيجي ۾ MB31,32 ۾ ريڊيڪسبل گروپ جي ريڊڪس سرگرمي جي اسٽريڪ روڪي ٿي.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
پي سي آر ماسٽر ميڪس ۾ موجود سالٽ ايم بي ۽ ڊي اين اي جي وچ ۾ اليڪٽرروسٽٽڪ رابطي ۾ مداخلت ڪن ٿا، تنهنڪري شامل ڪرڻ سان \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) \({50} \,{\) سان upmu \hbox {M}}\) MB gel-purified پيداوار MB-DNA رابطي تي لوڻ جي اثر جو مطالعو ڪرڻ لاءِ. جيئن تصوير 3 ۾ ڏيکاريل آهي، اسان ڏٺو ته اعليٰ ڊي اين اي ڪنسنٽريشن (\(>{2}\,{\) hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) ۽ \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) لاءِ \(117\,\hbox {bp} \))، DPV ۽ CV ۾ لوڻ جي اضافي سان ماپن تي خاص اثر نه ڪيو (ڏسو تصوير S2 ۾ ضمني معلومات ۾ نمائندي وولٽمگرامس لاءِ). گھٽ ڊي اين اي ڪنسنٽريشن، لوڻ جو اضافو حساسيت کي تمام گھڻو گھٽائي ٿو، جنھن جي نتيجي ۾ ڊي اين اي ڪنسنٽريشن سان موجوده وقت ۾ ڪا خاص تبديلي نٿي اچي. MB-DNA رابطي ۽ وچڙ تي لوڻ جا اهڙا ناڪاري اثر اڳي ٻين محققن 33,34 پاران رپورٽ ڪيا ويا آهن.\(\hbox { Mg}^{2+}\) ڪيشنون ڊي اين اي جي ناڪاري فاسفيٽ جي پٺي جي بون سان جڙيل آهن، ان ڪري ايم بي ۽ ڊي اين اي جي وچ ۾ اليڪٽررو اسٽاٽڪ رابطي ۾ رڪاوٽ پيدا ٿئي ٿي. اعليٰ ڊي اين اي ڪنسنٽريشن تي، ريڊڪس-ايڪٽو ايم بي جي اسٽريڪ روڪٿام جي نتيجي ۾ هيٺين چوٽيءَ واري وهڪري جي نتيجي ۾ اليڪٽررو اسٽڪٽڪ تعامل ٿين ٿا. سينسر جي ردعمل تي خاص طور تي اثر انداز نه ٿيو. اهم نقطو اهو آهي ته هي بايو سينسر وڌيڪ ڊي اين اي ڪنسنٽريشن کي ڳولڻ لاءِ بهتر آهي (شايد \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) يا وڌيڪ)، ماحولياتي پاڻي جي نموني جي مڪمل طور تي خودڪار پروسيسنگ لاء، جتي PCR مصنوعات جي جيل صاف ڪرڻ ممڪن نه ٿي سگھي.
DNA جي مختلف ڪنسنٽريشن لاءِ موج جي ڊيگهه جي حد 600–700 \(\hbox {nm}\) لاءِ جذب وکر جي هيٺان ايراضي \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) لوڻ سان ۽ بغير (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) لوڻ سان ۽ بغير (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) سان لاڳاپيل ڊي اين اي ڪنسنٽريشن MB جو نمونو ناهي ڊي اين اي.
مٿين نتيجن جي وڌيڪ تصديق ڪرڻ لاءِ، اسان هڪ UV/Vis spectrophotometer (Thermo Scientific Multiskan GO) استعمال ڪندي آپٽيڪل ماپون ڪيون، نمونا \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) استعمال ڪيا ويا. Measurement.DNA ڪنسنٽريشن وڌڻ سان جذب جي نشاني گھٽجي ٿي، جيئن جذبي وکر جي هيٺان علائقي جي رجحان مان ڏسي سگهجي ٿو ته موج جي ڊيگهه جي حد \(600\,\hbox {nm}\) کان \(700\,\hbox { nm}\)، جيئن تصوير 4 ۾ ڏيکاريل آهي (جذب جو اسپيڪٽرم تصوير S3 ۾ ڏيکاريل آهي ضمني معلومات ۾). ڊي اين اي ڪنسنٽريشن سان نمونن لاءِ \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox) {l}}})، DNA تي مشتمل ۽ MB-صرف نموني جي وچ ۾ ڪو خاص فرق نه هو (\(503\,\hbox {bp}\) ۽ \(117\,\hbox {bp}\ لاءِ) ) ڊگھي ٽڪرا)، ريڊڪس-ايڪٽو ايم بي جي اسٽرڪ انبيشن جي غير موجودگي کي ظاهر ڪري ٿو. اعلي ڊي اين اي ڪنسنٽريشن تي، اسان جذب سگنل ۾ بتدريج گھٽتائي جو مشاهدو ڪيو ۽ لوڻ جي موجودگي ۾ جذب ​​۾ گھٽ گھٽتائي جو ذڪر ڪيو. اھي نتيجا ماليڪيولر سان منسوب ڪيا ويا. ڊي اين اي هائبرڊز ۾ بنيادي اسٽيڪنگ سان تعامل ۽ اسٽريڪ روڪٿام. اسان جا نتيجا MB-DNA انٽرڪاليشن جي اسپيڪٽروسکوپي مطالعي تي ادب ۾ رپورٽن سان مطابقت رکن ٿا جيڪي \(\pi\)-\(\pi ^*\) ۾ گھٽ توانائي جي سطح سان hypochromaticity سان لاڳاپيل آهن. ) اليڪٽرانڪ ٽرانزيڪشن جي ڪري انٽرڪاليشن ليئرز 36، 37، 38.
Agarose gel electrophoresis of phage Phi6: PCR پروڊڪٽس جي ڊگھائي \(117\,\hbox {bp}\) ۽ \(503\,\hbox {bp}\) ڍنڍ جي پاڻيءَ جي نموني مان.M-DNA مارڪر؛NTC-no-template ڪنٽرول، پرائمر جنهن ۾ لاڳاپيل amplicons؛پي سي مثبت ڪنٽرول؛1, 2, 3-اڻايل (1:1) اسپيڪ ٿيل ڍنڍ جي پاڻيءَ جا نمونا ٽنهي صورتن ۾. هڪ بينڊ \(\اٽڪل 50\,\hbox {bp}\) تي نظر اچي ٿو \(503\,\) ۾ غير استعمال ٿيل اوليگونوڪليوٽائڊس جي ڪري hbox {bp}\) لين.
اسان سينسر جي افاديت جو جائزو ورتو Powai Lake جي پاڻيءَ جا نمونا استعمال ڪندي Phi6 phage سان اسپيڪ ٿيل. The RNA concentrations issolated from phage-spiced water samples from 15.8–\({19.4}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox { ml}}\)، جڏهن ته انهن کي صاف ٿيل فيج معطلي کان الڳ ڪيو ويو آهي آر اين اي جو اندازو لڳايو ويو آهي \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) تقريبن 1 جي بحالي ڪارڪردگي سان %.RNA reverse transscribed cDNA ۾ ڪيو ويو ۽ PCR ۽ qPCR لاءِ ٽيمپليٽ طور استعمال ڪيو ويو. پراڊڪٽ جي سائيز جي تصديق ڪئي وئي ايگرز جيل اليڪٽرروفورسس (شڪل 5) سينسر سان ٽيسٽ ڪرڻ کان اڳ. اهي نمونا جيل صاف نه ڪيا ويا آهن ۽ ان ڪري پي سي آر جا سڀئي جزا شامل آهن. انهي سان گڏ دلچسپي جا امڪان پڻ. qPCR (ٽيبل 1) دوران رڪارڊ ڪيل Ct قدر ڏيکاريا ويا ته آر اين اي جي ڪنسنٽريشن سان لاڳاپو رکيل پاڻي جي نمونن کان الڳ ٿيل آهي. Ct قدر ظاهر ڪري ٿو سائيڪلن جو تعداد فلورسنٽ سگنل لاءِ گهربل آهي. حد کان وڌي وڃو يا پس منظر سگنل. اعليٰ Ct قدرن کي اشارو ڪن ٿا هيٺين ٽيمپليٽ ڪنسنٽريشن ۽ ان جي برعڪس. NTC نمونن جي Ct قدرن جي توقع جيتري وڌيڪ ھئي. فرق \(\تقريبن 3\) Ct قدرن جي وچ ۾ مثبت ڪنٽرول ۽ ٽيسٽ جو نمونو وڌيڪ اشارو ڪري ٿو ته هر ٽيسٽ نموني ۾ مثبت ڪنٽرول جي مقابلي ۾ لڳ ڀڳ 1٪ ٽيمپليٽ آهي. اسان اڳ ۾ بحث ڪيو آهي ته ڊگها ايمپليڪن بهتر حساسيت جو سبب بڻجن ٿا. مختلف ماحولياتي نمونن کان الڳ ٿيل ڊگھي ٽڪرن کي وڌائڻ جي ڪري مشڪلاتن جي ڪري مشڪل آهي. گھٽ وائرل ڪنسنٽريشن ۽ آر اين اي ڊيگريڊيشن جي. جڏهن ته، اسان جي وائرس جي افزودگي ۽ پي سي آر ايمپليفڪيشن پروٽوڪول سان، اسان ڪاميابيءَ سان \(503\,\hbox {bp}\) ٽڪرا کي اليڪٽرڪ ڪيميڪل سينسنگ لاءِ وڌايو.
شڪل 6 ڏيکاري ٿو اليڪٽررو ڪيميڪل سينسر جا نتيجا \(503\,\hbox {bp}\) فريگمينٽ amplicon، ٻئي استعمال ڪري رهيا آهن Undiluted cDNA as template (1:1) ۽ 100-fold diluted cDNA as template (1:100) پرفارم ڪيو PCR , NTC ۽ PC جي مقابلي ۾ (ڏسو تصوير S4 ضمني معلومات ۾ نمائندن جي وولٽمگرامس لاءِ) تصوير 6 ۾ باڪس پلاٽ ۾ هر باڪس ۾ ٽن نمونن مان ماپون 5 اليڪٽروڊس تي مشتمل آهن. ساڳيا اليڪٽروڊ استعمال ڪيا ويا سڀني نمونن کي ماپڻ لاءِ اليڪٽرروڊ جي ڪري غلطين کان بچڻ لاءِ. CV ماپن جي مقابلي ۾، DPV ماپون اين ٽي سيز کان ٽيسٽ ۽ پي سي جي نمونن ۾ فرق ڪرڻ لاءِ بهتر ريزوليوشن ڏيکارين ٿيون، ڇاڪاڻ ته جيئن اڳ ۾ ذڪر ڪيو ويو آهي، فريادڪ وٿيون پس منظر ۾ ڪيپيسيٽو وٿين جي ڪري لڪيل هونديون آهن. منفي ڪنٽرول (NTC) جي نتيجي ۾ مثبت ڪنٽرول جي نسبت اعليٰ CV ۽ DPV چوٽيءَ جا وهڪرا هئا، جڏهن ته مثبت ۽ اڻ ڳڻي ٽيسٽ جا نمونا DPV جي چوٽيءَ واري وهڪري جي ساڳي چوٽي جي اونچائي ڏيکاريا ويا آهن. هر اڻ کٽيل (1:1) لاءِ ماپيل مطلب ۽ وچين قدر ) ٽيسٽ نموني ۽ پي سي واضح طور تي اين ٽي سي نموني لاء سينسر جي پيداوار مان حل ڪري سگهجي ٿو، جڏهن ته 1:100 حل ٿيل نموني لاء گهٽ واضح آهي. سي ڊي اين اي جي 100-گنا جي گھٽتائي لاء، اسان جيل الیکٹروفورسس جي دوران ڪنهن به بينڊ جو مشاهدو نه ڪيو. (شڪل 5 ۾ نه ڏيکاريل لين)، ۽ لاڳاپيل DPV ۽ CV چوٽيءَ جا وهڪرا ساڳيا هئا جيڪي NTC لاءِ متوقع هئا. \(117\,\hbox {bp}\) ٽڪرا جا نتيجا ضمني معلومات ۾ ڏيکاريا ويا آهن. منفي ڪنٽرول پي سي بي سينسر مان هڪ اليڪٽررو ڪيميڪل ردعمل پيدا ڪيو اليڪٽرروڊ تي مفت MB جي جذب ۽ MB جي سنگل اسٽرينڊ پرائمر oligonucleotide سان رابطي جي ڪري. ان ڪري، هر دفعي نموني کي جانچيو وڃي ٿو، هڪ منفي ڪنٽرول هلائڻ گهرجي ۽ ٽيسٽ نموني جي چوٽي ڪرنٽ جي مقابلي ۾ ناڪاري ڪنٽرول پاران حاصل ڪيل چوٽي موجوده (نسباتي) ماپ حاصل ڪرڻ لاءِ 39,40 ٽيسٽ نموني کي مثبت يا منفي طور تي درجه بندي ڪرڻ لاءِ.
(a) DPV، ۽ (b) CV چوٽي ڪرنٽ لاءِ اليڪٽرڪ ڪيميڪل ڳولڻ لاءِ \(503\,\hbox {bp}\) ٽڪرن جي ڍنڍ جي پاڻيءَ جي نمونن ۾. ٽيسٽ جا نمونا ٽن حصن ۾ ماپيا ويا ۽ ان جي مقابلي ۾ ڪا ٽيمپليٽ ڪنٽرول (NTC) ۽ مثبت ڪنٽرول (PC).
اسان جا نتيجا مختلف ڊي اين ايز لاءِ مختلف ڊگھائي جي ايمپليڪن لاءِ اليڪٽرو ڪيميڪل سينسرز جي ڪارڪردگي تي اثرانداز ٿيندڙ مختلف ميکانيزم کي واضح ڪن ٿا، جن ۾ ڪنسنٽريشن جي تصديق ٿيل نظرياتي ماپن ذريعي يو وي/ويز اسپيڪٽرفوٽوميٽر ذريعي ڪئي وئي آهي. اسان جا مشاهدا ان بصيرت کي واضح ڪن ٿا ته ڊي اين اي جا وڌيڪ ٽڪرا \(\تقريبن\) تائين. \(500\,\hbox {bp}\) وڌيڪ حساسيت سان معلوم ڪري سگھجي ٿو ۽ نموني ۾ لوڻ جي موجودگي ڊي اين اي ڪنسنٽريشن کي حساسيت نه ڏئي ٿي جيڪا وڌيڪ حساسيت کي متاثر ڪري ٿي (شايد \({\hbox {ng}/{\upmu) \hbox {l}}}\) ۽ مٿي). ان کان علاوه، اسان نموني جي مختلف قسمن جي اثر جي تحقيق ڪئي، جنهن ۾ شامل ٿيل لوڻ سان ۽ بغير جيل-پاڪ ٿيل ايمپليڪن، ۽ DPV ۽ CV ماپن ۾ ڍنڍ جي پاڻي جي نموني شامل آهن.اسان ڏٺو ته DPV بهتر ريزوليوشن فراهم ڪيو، ڇاڪاڻ ته پس منظر جي گنجائش وارو موجوده پڻ CV جي ماپ کي متاثر ڪري ٿو، ان کي گهٽ حساس بڻائي ٿو.
ڊگھي ٽڪڙن کي وڌائڻ جو دارومدار وائرل جينومڪ RNA جي سالميت تي هوندو آهي.ڪيترن ئي مطالعي مان معلوم ٿيو آهي ته ڊگھي ٽڪرن کي وڌائڻ هميشه ڪارائتو نه هوندو آهي ڇاڪاڻ ته ماحول ۾ آر اين اي جي خراب ٿيڻ ۽ علحدگيءَ دوران ورهائڻ جي صلاحيت 11,41,42,43,44 .اسان ڏٺو ته PEG تي ٻڌل وائرس ڪنسنٽريشن جو طريقو ايلومينيم هائيڊروڪسائيڊ تي ٻڌل وائرس ڪنسنٽريشن طريقي جي ڀيٽ ۾ ڍنڍ جي پاڻيءَ جي نمونن ۾ فيج Phi-6 اسپيڪ کي مرڪوز ڪرڻ ۾ وڌيڪ اثرائتو هو. ڊگھي ڊي اين اي ٽڪڙن کي ڳولڻ جي صلاحيت ملٽي پلڪس پي سي آر جي ضرورت کي پورو ڪرڻ ۾ ثابت ٿيو. گھڻن ننڍن ڊگھائي ٽيمپليٽس کي وڌائڻ ۽ ڪراس-خاصيت جي امڪان کي گھٽائڻ لاء.
حياتياتي نمونا گهٽ آهن، تنهنڪري اتي هڪ بايو سينسر ڊزائين ڪرڻ جي ضرورت آهي جنهن جي جانچ لاء گهٽ ۾ گهٽ نمونن جي ضرورت آهي. هن مطالعي ۾ استعمال ٿيل ENIG PCB اليڪٽرروڊ صرف گهربل \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ ) اليڪٽروڊز جي اثرائتي علائقي کي ڍڪڻ لاءِ جانچ لاءِ نمونا. اضافي طور تي، ساڳئي اليڪٽرروڊ کي صاف ڪرڻ کان پوءِ ٻيهر استعمال ڪري سگھجي ٿو ايندڙ نموني کي ڊسپين ڪرڻ کان اڳ. وڌايل نمونن کي ميٿيلين نيري کان سواءِ ڪنهن به ڪيميائي مادن جي اضافي جي ضرورت ناهي، جيڪا هڪ سستي آهي. ۽ عام طور تي استعمال ٿيندڙ ڪيميائي. جيئن ته هر اليڪٽرروڊ جي قيمت اٽڪل $0.55 (يا 40 روپيا) آهي، ان ڪري هي بايو سينسر موجوده سڃاڻپ ٽيڪنالاجيز لاءِ هڪ لاڳت وارو متبادل ٿي سگهي ٿو. ٽيبل 2 هن ڪم جي مقابلي کي ڏيکاري ٿو ٻين سينسر سان جيڪي ڊگهي عرصي تائين ادب ۾ ٻڌايو ويو آهي. مختلف نمونن ۾ ڊي اين اي جا ٽڪرا.
ڏنو ويو آهي ته MB-based electrochemical detection protocols PCR جي مخصوصيت تي ڀروسو ڪن ٿا، هن طريقي جي هڪ وڏي حد هيٽروجنيئس نمونن جهڙوڪ گندي پاڻي ۽ ڍنڍ جي پاڻي ۾ غير مخصوص واڌارو جي صلاحيت آهي يا گهٽ صفائي واري پرائمر استعمال ڪندي. غير تبديل ٿيل ENIG PCB اليڪٽروڊ استعمال ڪندي غير صاف ٿيل پي سي آر شين جي ڊي اين اي جي سڃاڻپ لاءِ اليڪٽرڪ ڪيميڪل ڳولڻ جا طريقا، غير استعمال ٿيل dNTPs ۽ پرائمر پاران متعارف ٿيل غلطين کي بهتر سمجهڻ ۽ رد عمل جي حالتن ۽ پروٽوڪول کي بهتر ڪرڻ لاءِ ضروري آهي. اضافي فزيڪو ڪيميڪل پيٽرولر جهڙوڪ پي ايڇ، درجه حرارت، ۽ بائيولوجيڪل. پاڻي جي نموني جي آڪسيجن جي طلب (BOD) کي پڻ ماپڻ جي ضرورت پوندي ماپ جي درستگي کي بهتر ڪرڻ لاء.
نتيجي ۾، اسان ماحولياتي (ڍنڍ جي پاڻيءَ) جي نمونن ۾ وائرس جي سڃاڻپ لاءِ گهٽ قيمت واري اليڪٽرڪ ڪيميڪل ENIG PCB سينسر جي تجويز پيش ڪريون ٿا. ڊي اين اي سينسنگ لاءِ غير متحرڪ اوليگونوڪليوٽائيڊ اليڪٽروڊس يا ڪسٽم سبسٽراٽس جي برعڪس جن کي حساسيت برقرار رکڻ لاءِ cryogenic اسٽوريج جي ضرورت آهي، 53,54 اسان جي ٽيڪنڪ اڻ سڌريل PCB استعمال ڪري ٿي. اليڪٽروڊ ڊگھي شيلف لائف سان ۽ ڪو خاص اسٽوريج جي گهرج نه آهي ۽ ان ڪري ماپ جي حل جي ترقي لاءِ موزون آهي خودڪار نموني پروسيسنگ سان LMICs ۾ لڳايو ويو آهي. بائيو سينسر سستا ڊي اين اي-انٽرڪليٽنگ ريڊڪس رنگ (ايم بي) استعمال ڪري ٿو ٽارگيٽ ايمپليڪن جي تيزيءَ سان پتو لڳائڻ لاءِ. عام طور تي ماحولياتي نموني ۾ MBs جي سنگل ۽ ڊبل اسٽرينڊ oligonucleotides جي غير مخصوص پابند ٿيڻ جي ڪري هن سينسنگ طريقي جي خاصيت کي گھٽائي ٿو. ان ڪري، هن ٽيسٽ جي خاصيت پرائمر جي اصلاح ۽ PCR رد عمل جي حالتن تي منحصر آهي. ان کان علاوه، CV ۽ DPV چوٽي جي وٿن کي آزمائشي نموني مان حاصل ڪيو ويو آهي، هر ٽيسٽ لاء منفي ڪنٽرول (NTC) مان حاصل ڪيل جوابن جي نسبت سان تعبير ڪيو وڃي. هن ڪم ۾ پيش ڪيل اليڪٽرڪ ڪيميڪل سينسر ڊيزائن ۽ طريقن کي خودڪار نموني سان ضم ڪري سگهجي ٿو مڪمل طور تي خودڪار ۽ گهٽ ترقي ڪرڻ لاء. - قيمت جو حل جيڪو نمونن کي گڏ ڪري ۽ تجزيو ڪري سگهي ٿو ۽ وائرليس طور تي نتيجن کي واپس ليبارٽري ڏانهن منتقل ڪري ٿو.
Cashdollar, J. & Wymer, L. پاڻي جي نموني مان وائرس جي ابتدائي ڪنسنٽريشن لاءِ طريقا: تازو مطالعو جو جائزو ۽ ميٽا-تجزيو.Application.microorganism.115، ص 1-11 (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL واٽر بورن وائرس: بيئرئرز ٽو پيئندڙ پاڻي. PLoS Pathogens.11, E1004867 (2015).
گھٽ ۽ وچين آمدني وارن ملڪن ۾ COVID-19 جي قيمتي اثرائتي وڏي پيماني تي نگراني لاءِ شريٿا، S. et al. Wastewater epidemiology: چئلينجز ۽ موقعا.Water 13, 2897 (2021).
Palecek, E. ۽ Bartosik, M. Nucleic acid electrochemistry.Chemical.Rev.112، 3427–3481 (2012).
Tani, A., Thomson, AJ & Butt, JN Methylene blue as an electrochemical discriminator of single- and double-stranded oligonucleotides immobilized on gold substrates.Analyst 126, 1756–1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ Comparison of Cation and Anion Intercalators for Electrochemical Transduction of DNA Hybridization by Long-range Electron Transfer.Electrochemistry.comminicate.6, 648-654 (2004).
وانگ، اي ايل ۽ گڊنگ، جي جي چارج جي منتقلي ذريعي ڊي اين اي: هڪ چونڊيل اليڪٽرڪ ڪيميڪل ڊي اين اي biosensor.anus.Chemical.78، 2138-2144 (2006).
Fang, TH et al.Real-time PCR microfluidic device with concurrent electrochemical detection.biological sensor.Bioelectronics.24, 2131–2136 (2009).
Win, BY et al. سگنلنگ ميڪانيزم جو مطالعو ۽ ڪارڪردگي جي تصديق هڪ اليڪٽرڪ ڪيميڪل ريئل ٽائيم پي سي آر سسٽم جي بنياد تي ميٿيلين نيري جي ڊي اين اي سان رابطي جي بنياد تي. تجزيه نگار 136، 1573-1579 (2011).
Ramirez-Chavaria, RG et al.Loop-mediated isothermal amplification-based electrochemical sensor for detection of sars-cov-2 in wastewater samples.J.Environment.Chemical.Britain.10, 107488 (2022).
ڪمار، M. et al.Electrochemical sensing of SARS-CoV-2 amplicons with PCB electrodes.The sensor is active.B Chemistry.343, 130169 (2021).
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. & Yoshida, H. SARS-CoV-2 RNA جي موثر سڃاڻپ گندي پاڻي جي مضبوط حصي ۾. سائنس. جنرل ماحول. 763, 144587 (2021).
Alygizakis, N. et al. تجزياتي طريقا SARS-CoV-2 جي چڪاس لاءِ گندي پاڻي ۾: پروٽوڪول ۽ مستقبل جا تناظر.TraC رجحان واري anal.Chemical.134, 116125 (2020).
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. & Kashtan, N. Survival of the enveloped bacteriophage Phi6 (SARS-CoV-2 لاءِ هڪ سروگيٽ) شيشي جي سطحن تي جمع ٿيل لعاب جي بوندن ۾.science.Rep.10، 1-10 (2020).
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ ماحولياتي تسلسل هڪ SARS-CoV-2 سروگيٽ (Phi6) آزاد رهندڙ amoeba.J ۾.پاڻي صحت 20، 83 (2021).
Mindich, L. ڊبل اسٽرينڊڊ RNA بيڪٽيريوفاج جي ٽن جينومڪ ٽڪرن جي درست پيڪنگنگ\(\varphi\)6.microorganism.Moore.biology.Rev.63، 149-160 (1999).
Pirttimaa, MJ & Bamford, DH RNA phage\(\varphi\)6 پيڪيجنگ واري علائقي جو ثانوي ڍانچو.RNA 6, 880–889 (2000).
Bonilla, N. et al.Phages on the Tap - بيڪٽيريا جي ليبارٽري اسٽاڪ تيار ڪرڻ لاءِ هڪ تيز ۽ ڪارائتو پروٽوڪول.PeerJ 4, e2261 (2016).