Grazzi talli żort Nature.com.Il-verżjoni tal-brawżer li qed tuża għandha appoġġ limitat għas-CSS. Għall-aħjar esperjenza, nirrakkomandaw li tuża browser aġġornat (jew itfi l-mod ta' kompatibilità fl-Internet Explorer). Sadanittant, biex tiżgura appoġġ kontinwu, aħna se nuru s-sit mingħajr stili u JavaScript.
L-importanza tal-monitoraġġ tal-kampjuni ambjentali ġiet apprezzata ħafna mill-bidu tal-pandemija tal-COVID-19, u qed isiru xi sforzi ta’ monitoraġġ bl-użu tal-istandard tad-deheb, għalkemm it-tekniki bbażati fuq qPCR huma għaljin. soluzzjoni għall-monitoraġġ tal-kampjuni tal-ilma ambjentali f'pajjiżi bi dħul baxx u medju. F'dan ix-xogħol, nuru s-sejbien elettrokimiku ta 'amplicons miksuba minn Phi6 phage iżolat minn kampjuni tal-ilma tal-lagi bil-ponta (surrogat popolari għal SARS-CoV-2), bl-użu ta' ENIG biex tlesti l-elettrodi tal-PCB mingħajr modifika tal-wiċċ.sess.Ir-rispons tas-sensur elettrokimiku kien ikkaratterizzat sewwa għal żewġ frammenti tad-DNA ta’ tulijiet differenti (\({117}\,\hbox {bp}\) u \({503}\,\hbox {bp}\)]), u l- effett tal-melħ fit-taħlitiet prinċipali tal-PCR fuq l-interazzjonijiet tal-methylene blue (MB)-DNA. Ir-riżultati tagħna juru li t-tul tal-frammenti tad-DNA jiddetermina b'mod sinifikanti s-sensittività elettrokimika u juri f'dan ix-xogħol li l-abbiltà li tiskopri amplicons twal mingħajr purifikazzjoni tal-ġell tal-prodotti tal-PCR hija importanti għall-kejl in situ tal-kampjuni tal-ilma.Soluzzjoni kompletament awtomatizzata għal tagħbija virali jawgura tajjeb.
It-trażmissjoni tal-virus fl-ilma ilha magħrufa bħala periklu għas-saħħa pubblika mill-1940s, bl-ewwel evidenza ta’ trażmissjoni fl-ilma tal-poljo u l-epatite E1.L-Organizzazzjoni Dinjija tas-Saħħa (WHO) ikklassifikat diversi patoġeni virali li jinġarru fl-ilma ta’ sinifikat tas-saħħa minn moderat għal għoli2.Virus tradizzjonali metodi ta' skoperta jiddependu fuq tekniki bbażati fuq qPCR standard tad-deheb, li huma sensittivi ħafna u speċifiċi, iżda jeħtieġu persunal tas-sengħa biex jittestja fil-laboratorju bl-użu ta' strumenti għaljin. Madankollu, f'pajjiżi bi dħul baxx u medju (LMICs) b'riżorsi limitati, umani l-ittestjar tal-kampjuni x'aktarx li jieħu preċedenza fuq il-monitoraġġ ambjentali tal-kampjuni tal-ilma. Għalhekk, huma meħtieġa metodi alternattivi bi prezz baxx għal monitoraġġ sostenibbli u f'ħin reali tal-kampjuni tal-ilma u tad-drenaġġ f'pajjiżi bi dħul baxx u medju bħala twissijiet bikrija ta' tifqigħat ta' mard emerġenti, b'hekk tipproteġihom mill-impatti soċjoekonomiċi severi tal-pandemija tal-virus.Bijosensuri elettrokimiċi bi prezz baxx għal aċidi nuklejċi jistgħu jipprovdu soluzzjoni potenzjali promettenti għal din il-ħtieġa mhux sodisfatta. Ħafna minn dawn il-bijosensuri tad-DNA jaħdmu bil-fatt li linji tad-DNA komplementari huma immobilizzati fuq l-elettrodu wiċċ u hybridize meta sekwenza ta 'tqabbil tkun preżenti fil-kampjun.Dan jista' mbagħad jiġi kkonvertit f'sinjal permezz ta 'tekniki elettrokimiċi varji bl-użu ta' medjaturi redox bħal ħadid/ferrocyanide tal-potassju.Methylene blue (MB) hija waħda tali molekula redox-attiva, li għandha ġie rrappurtat li jinterkalizza f'DNA bi strand doppju (dsDNA) minbarra t-twaħħil aktar mhux speċifiku tiegħu ma 'DNA single-stranded5,6. In-natura ta' interkatazzjoni tal-MBs biex jiffurmaw kumplessi MB-DNA tagħmilhom għażla popolari bħala medjaturi redox f'diversi DNA elettrokimiku konfigurazzjonijiet tas-sensuri5,6,7,8,9.Għalkemm l-interkalazzjoni ta 'MB mad-DNA mhix speċifika, u l-ispeċifiċità ta' dan is-sensor elettrokimiku tiddependi ħafna fuq il-purità tal-primers użati għal PCR jew amplifikazzjoni iżotermika, hija adattata tajjeb għall-implimentazzjoni reali -time qPCR ibbażat fuq elettrokimiku jew amplifikazzjoni iżotermika fluworexxenti bħala alternattiva għall-kejl tal-konċentrazzjoni tad-DNA 9 .F'implimentazzjoni waħda bħal din, Won et al.Il-wiċċ ta 'elettrodi tad-deheb ġie modifikat b'6-mercapto-1-hexanol (MCH) għal ħin reali kejl ta 'amplicons PCR b'MB bl-użu ta' voltametrija tal-polz differenzjali (DPV) 9.F'każijiet oħra, Ramirez et al.Sejbien ta 'SARS-CoV-2 fl-ilma mormi permezz ta' reazzjoni RT-LAMP bl-użu ta 'MB b'elettrodi stampati fuq skrin. Elettrodi tal-platinum ġew ukoll użati bħala elettrodi in situ fi pjattaforma PCR mikrofluwidika ddisinjata biex tiskopri b'mod elettrokimiku amplicons waqt reazzjonijiet 8. Dawn l-istudji kollha jeħtieġu modifika tal-wiċċ tal-elettrodi, li jimplikaw żieda fl-ispejjeż tal-produzzjoni u tal-operat minħabba rekwiżiti speċjali ta 'ħażna għall-istabbiltà ta' dawn l-elettrodi funzjonalizzati.
Skematika tal-fluss tax-xogħol għall-iskoperta elettrokimika ta 'amplicons miksuba minn partiċelli virali konċentrati f'kampjuni ta' ilma tal-lagi.
Riċentement urejna sensing elettrokimiku ta 'amplicons SARS-CoV-2 b'elettrodi ta' bord ta 'ċirkwit stampat (PCB) bi prezz baxx ibbażati fuq DPV u voltametrija ċiklika (CV) indotta minn assorbiment ta' kumplessi MB-DNA fuq il-wiċċ ta 'elettrodi mhux modifikati) bidliet fil-quċċata kurrenti11.Nirrapportaw li frammenti itwal tad-DNA (N1-N2, \({943}\, \hbox) iffurmati bl-użu tal-primers N1 forward u N2 reverse rakkomandati mis-CDC meta mqabbla ma’ frammenti iqsar {bp}\)) urew linearità aħjar fir-rispons tas-sensorju. ( N1, \(72\,\hbox {bp}\)) iffurmat bl-użu ta' settijiet ta' primers N1 quddiem u N1 b'lura. Dawn l-istudji huma rrappurtati bl-użu ta' dilwizzjonijiet tad-DNA ppreparati f'ilma mingħajr nukleażi. Il-pjattaforma ntużat ukoll biex tiskopri SARS-CoV -2 amplicons f'kampjuni simulati tad-drenaġġ (miksbu billi tispikka kampjuni totali ta 'RNA b'SARS-CoV-2 RNA). Peress li l-RNA huwa suxxettibbli għal shearing waqt iżolament u proċessar downstream,12,13 huwa diffiċli li jiġu amplifikati frammenti itwal b'dan il-kampjun eteroġenju. Għalhekk, id-dimostrazzjoni ta 'sensing elettrokimiku ta' amplicon SARS-CoV-2 fl-ilma mormi hija limitata għall-framment iqsar \(72\,\hbox {bp}\) N1.
F'dan ix-xogħol, investigajna l-fattibilità ta 'sensing elettrokimiku bbażat fuq ENIG PCB ta' phage Phi6 ikkonċentrat u iżolat minn kampjuni tal-ilma tal-lagi (Fig. 1). Phi6 phages huma komparabbli fid-daqs (80-100 nm) għal SARS-CoV-2 u għandhom ukoll membrana tal-lipidi u proteina spike. Għal dawn ir-raġunijiet, il-batterjofagu Phi6 huwa surrogat popolari għal SARS-CoV-2 u viruses RNA patoġeniċi enveloped oħra14,15.RNA iżolat minn partiċelli phage intuża bħala mudell għas-sintesi ta 'cDNA segwit minn PCR biex tikseb żewġ frammenti tad-DNA ta' 117 u 503 pari bażi fit-tul. Minħabba l-isfida li jiġu amplifikati \(943\,\hbox {bp}\) frammenti N1-N2 fix-xogħol preċedenti tagħna, aħna nimmiraw frammenti ta' tul intermedju (\(117 \,\hbox {bp}\) u \(503 \,\hbox {bp}\)), ibbażati fuq primers disponibbli. \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) sa \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) Għaż-żewġ frammenti fi il-preżenza ta 'MB, l-effett tal-melħ fuq ir-rispons tas-sensor ġie kkaratterizzat u vvalidat minn kejl spettrofotometriku. Il-kontribuzzjonijiet ewlenin ta' dan ix-xogħol huma kif ġej:
It-tul tal-framment tad-DNA u l-preżenza tal-melħ fil-kampjun jaffettwaw b'mod qawwi s-sensittività.Ir-riżultati tagħna juru li l-attività elettrokimika tiddependi fuq mekkaniżmi differenti ta 'l-interazzjoni ta' MB, DNA, u s-sensor fir-rispons voltametriku, skond il-konċentrazzjoni tad-DNA u t-tul, b'Frammenti itwal juru sensittività ogħla, għalkemm il-melħ għandu effett negattiv fuq l-interazzjonijiet elettrostatiċi bejn MB u DNA.
Il-konċentrazzjoni tad-DNA tiddetermina l-mekkaniżmu tal-interazzjoni MB-DNA f'elettrodi mhux modifikati Aħna nuru li mekkaniżmi differenti tal-interazzjoni MB-DNA jiddependu fuq il-konċentrazzjoni tad-DNA. F'konċentrazzjonijiet tad-DNA taħt ammont żgħir ta' \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), aħna osservajna li r-rispons tal-kurrent elettrokimiku kien iddeterminat prinċipalment mill-assorbiment ta 'MB-DNA fuq l-elettrodu, filwaqt li f'konċentrazzjonijiet aktar baxxi F'konċentrazzjonijiet għoljin ta' DNA, ir-rispons tal-kurrent elettrokimiku kien determinat mill-inibizzjoni sterika ta 'redox attività minħabba inserzjoni MB bejn pari bażi tad-DNA.
Sensing Elettrokimiku Ibbażat fuq ENIG PCB ta 'Aċidi Nukleiċi Virali f'Kampjuni tal-Ilma tal-Lag L-osservazzjonijiet ġew ivvalidati permezz ta' skoperta elettrokimika ta' frammenti tad-DNA miżjuda b'Phi6 \(503\,\hbox {bp}\) miksuba minn kampjuni tal-ilma minn Powai Lake, IIT Mumbai Campus Riżultat phage.
Spiża baxxa ta 'implimentazzjoni u potenzjal għall-integrazzjoni f'sistemi ta' monitoraġġ kompletament awtomatizzati, oligonukleotidi jew aptameri fuq elettrodi b'ħajja itwal fuq l-ixkaffa.
Phage Phi6 huwa virus dsRNA enveloped tal-familja Cytoviridae li jinfetta Pseudomonas syringae. Il-ġenoma tal-phage Phi6 jeżisti fil-forma ta' 3 frammenti: S (\(2.95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4.07) \,\hbox {Kb}\)) u L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\))16,17.Peress li l-phage Phi6 jinfetta razza BSL-1 Pseudomonas mhux patoġenika, huwa sigur li jintuża u jistgħu jitkabbru faċilment fil-laboratorju.Phage Phi6 u Pseudomonas syringae ospitanti tiegħu nxtraw miċ-Ċentru ta’ Referenza ta’ Felix d’Herelle għall-Viruses Batterjali, Università ta’ Laval, Kanada (in-numri tal-katalgu taċ-ċentru ta’ referenza huma HER-102 u HER-1102, rispettivament) .Phi6 phage u l-ospitanti tiegħu ġew reġgħu kif ordnat miċ-ċentru ta 'referenza.Phage Phi6 ġie ppurifikat permezz ta' liżi tal-pjanċa u elużjoni biex jinkisbu titri finali b'\(\madwar 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { ml}}\) (unitajiet li jiffurmaw plakka/millilitri).RNA ġie iżolat minn partiċelli phage purifikati bl-użu tal-Kit ta 'Purifikazzjoni ta' RNA Totali GenElute™ (Sigma-Aldrich) skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Fil-qosor, sospensjoni Phi6 phage purifikata\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) kien lysed u l-lysate kien mgħobbi fuq spin kolonna biex tippermetti li l-RNA jorbot mal-kolonna tar-reżina. 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) ipprovdut mill-kit.Stima l-konċentrazzjoni ta' RNA bl-assorbiment f'\(260\,\hbox {nm}\).RNA kien maħżun f'alikwoti fi \ ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) sakemm aktar użu.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) Il-Kit tas-Sinteżi tal-cDNA iScript (Bijo -Rad Laboratories) intuża bħala mudell għas-sinteżi ta' cDNA wara l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Fil-qosor, reazzjoni ta' sinteżi ta' cDNA tikkonsisti fi 3 passi: priming fi \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min} }\) , traskrizzjoni inversa ta' \({20}\,{\hbox {min}}\) fi \({46}\,{^{\circ }\hbox {C}}\), u reverse Ir-reġistratur jinsab fi \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) għal \({1}\,{\hbox {min }}\).Meta jitmexxa fuq ġel tal-agarose 1%, is-cDNA wera tliet meded li jikkorrispondu mat-tliet frammenti RNA mistennija (dejta mhux murija).Il-primers li ġejjin intużaw biex jamplifikaw żewġ frammenti tad-DNA ta '117 u 503 bp fit-tul, bl-użu ta' cDNA bħala mudell għal PCR f'ċiklatur termali miniPCR® mini8:
Il-primers għal \(117\,\hbox {bp}\) u \(503\,\hbox {bp}\) jikkorrispondu għal 1476-1575 nukleotidi tas-segment M u 458-943 nukleotidi tas-segment L, rispettivament aċidu .Il-prodotti kollha tal-PCR amplifikati ġew elettroforesizzati fuq ġels tal-agarose 1%, u d-DNA fil-mira amplifikat ġie ppurifikat bl-użu tal-Kit tal-Estrazzjoni tal-Ġel GeneJET (Thermo Fisher Scientific).
Lag fil-kampus tal-IIT Mumbai (Powai Lake, Powai, Mumbai) intuża biex iżżid partiċelli tal-fagi. L-ilma tal-lag ġie ffiltrat minn membrana \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) biex jitneħħa partiċelli sospiżi, u mbagħad ġie miżjud Phi6 phage.Żid \({1}\,{\hbox {ml}}\) ta' \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} \) għal \( {100}\ ,{\hbox {ml}}\) ilma tal-għadira ffiltrat, fi \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\).Alikwot żgħir kien riżervat għall-kejl tat-tagħbija virali permezz ta 'assaġġ tal-plakka. Ittestjajna żewġ metodi differenti biex nikkonċentraw partiċelli tal-virus Phi6 spiked: (1) il-metodu ta' adsorbiment-preċipitazzjoni tal-idrossidu tal-aluminju,19 li ġie vvalidat għall-konċentrazzjoni ta 'diversi viruses RNA enveloped minn kampjuni ambjentali, u (2) ) Il-metodu tal-konċentrazzjoni tal-virus ibbażat fuq polyethylene glycol (PEG) ġie adattat minn Flood et al.20 .Peress li l-effiċjenza tal-irkupru tal-metodu bbażat fuq PEG instabet li kienet aħjar minn dik tal-metodu tal-idrossidu tal-aluminju, il-metodu bbażat fuq PEG intuża biex jikkonċentra partiċelli Phi6 minn kampjuni tal-ilma tal-lag.
Il-metodu PEG użat kien kif ġej: PEG 8000 u \(\hbox {NaCl}\) ġew miżjuda ma' kampjuni tal-ilma tal-għadira bi spiked Phi6 biex jinkisbu 8 % PEG 8000 u \(0.2\,\hbox {M} \) \( \ hbox {NaCl}\).Il-kampjuni ġew inkubati fuq shaker\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), imbagħad ċentrifugat f'\(4700 \,\hbox {g}\) huwa \({45}\,{\hbox {min}}\). Armi s-supernatant u erġa' ssospendi l-pellet fi \({1}\, {\hbox {ml}}\) fl-istess supernatant.L-esperimenti kollha ta' spiking u konċentrazzjoni tal-virus saru fi tliet kopji.Wara l-konċentrazzjoni, alikwot żgħir kien irriżervat għall-kejl tal-effiċjenza tal-irkupru permezz ta' analiżi tal-plakka. RNA ġie iżolat kif deskritt qabel u eluwit fil-buffer tal-eluzzjoni fornut mill-kit\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\).Ladarba l-konċentrazzjoni tal-RNA se tvarja minn kampjun għal kampjun fi tliet kopji, il-\({2}\,{\upmu \ hbox {l}}\) ta' RNA jintuża għat-tlieta irrispettivament mill-konċentrazzjoni tiegħu sinteżi ta' cDNA ta' kampjuni. Is-sinteżi ta' cDNA saret kif deskritt qabel.\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNA intuża bħala mudell għal \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR għal 35 ċiklu biex jamplifika \ (117\,\hbox {bp}\) u \(503\,\hbox { bp}\) frammenti. Dawn il-kampjuni huma rappreżentati bħala “1:1″, jiġifieri mingħajr dilwizzjoni. Ġie stabbilit kontroll bla mudell (NTC) bħala kontroll negattiv, filwaqt li twaqqaf cDNA sintetizzat bl-użu ta’ RNA iżolat minn fagi purifikat. bħala mudell għal kontroll pożittiv (PC).PCR kwantitattiv (qPCR) sar fi strument Stratagene Mx3000P RT-PCR bl-użu ta' Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (Teknoloġiji Agilent). Ir-reazzjonijiet ġew stabbiliti fi tliet kopji bħal qabel deskritt.Il-limitu taċ-ċiklu (Ct) ġie rreġistrat għall-kampjuni kollha. Barra minn hekk, il-kampjuni dilwiti kienu \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) bl-użu ta' cDNA dilwit 1:100 f'ilma tal-lag iffiltrat bħala \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR għal 35 ċiklu. Dawn il-kampjuni huma rappreżentati bħala “1:100″.
L-elettrodi tal-PCB huma fabbrikati bl-użu ta 'proċess tad-Deheb tal-Immersjoni tan-Nikel Elettroless (ENIG) bi prezz baxx disponibbli kummerċjalment mingħajr il-ħtieġa ta' kisi tad-deheb addizzjonali. L-ispeċifikazzjonijiet tal-elettrodi tal-PCB tal-ENIG huma dettaljati fix-xogħol preċedenti tagħna11. Għall-elettrodi tal-PCB tal-ENIG, metodi tradizzjonali ta 'tindif tal-elettrodi bħalma huma soluzzjoni ta’ piranha jew voltametrija ċiklika ta’ aċidu sulfuriku mhumiex rakkomandati peress li jistgħu jikkawżaw tqaxxir tas-saff irqiq tad-deheb (ħxuna \(\approx\) \(100\,\hbox {nm }\)) u jesponu s-saffi tar-ram sottostanti li huma suxxettibbli għall-korrużjoni 21, 22, 23, 24, 25.Għalhekk, naddaf l-elettrodi b'ċarruta mingħajr ħelu mxarrba bl-IPA. Il-kampjun li jrid jiġi ttestjat ġie inkubat bi \({50}\,{\upmu \hbox {M} }\) MB fi \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) għal inserzjoni faċli.Fil-ħidma preċedenti tagħna , osservajna li s-sensittività u l-linearità tas-sensor tjiebu billi żiedet il-konċentrazzjoni MB 11 .Ibbażat fuq ottimizzazzjonijiet irrappurtati fix-xogħol preċedenti tagħna, użajna \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB konċentrazzjonijiet biex jinkorporaw DNA f'dan l-istudju.Sejbien elettrokimiku ta 'DNA bi strands doppji (ds-DNA) jista' jinkiseb bl-użu ta 'interkalaturi anjoniċi jew katjoniċi. min-naħa l-oħra, intercalators katjoniċi bħall-MB jeħtieġu ħinijiet iqsar ta' inkubazzjoni, bejn wieħed u ieħor \({1}\,{\hbox {h}}\) għall-iskoperta elettrokimika ta' ds-DNA6.Kull kejl jinvolvi l-għoti tal-kampjun li għandu jiġi ttestjat fuq il- elettrodu\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), imbagħad tindif b'ċraret imxarrba bl-IPA, qabel ma tipproċedi b'kampjun ieħor.kejl wieħed.Kull kampjun ġie ttestjat fuq 5 elettrodi differenti sakemm ma jkunx iddikjarat mod ieħor.Il-kejl DPV u CV saru bl-użu ta’ potentiostat PalmSens Sensit Smart, u s-softwer PSTrace intuża għall-konfigurazzjoni tal-potenzjostat u l-akkwist tad-dejta, inklużi l-kalkoli tal-ogħla kurrent. Jintużaw is-settings li ġejjin għal kejl DPV u CV:
DPV: Ħin ta' Ekwilibriju = \(8\,\hbox {s}\), Pass tal-Vultaġġ = \(3\,\hbox {mV}\), Vultaġġ tal-Impuls = \(25\,\hbox {mV}\) , tul ta' żmien tal-polz = \(50\,\hbox {ms}\), rata tal-iskannjar = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: Ħin ta' Ekwilibriju = \(8\,\hbox {s}\), Pass tal-Vultaġġ = \(3\,\hbox {mV}\), Rata tal-Knis = \({300}\,\hbox {mV/ s }\)
L-ogħla kurrenti miksuba minn voltammograms ta' DNA kumplessi ma' \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (ċ) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
Voltammogrammi DPV u CV nkisbu fuq elettrodi ENIG PCB \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB kumplessi mad-DNA (f'konċentrazzjonijiet ta' 10–\({20}\,{\ hbox {ng }/{\upmu \hbox {l}}}\) jiġifieri 0.13–\({0.26}\,{\upmu \hbox {M}}\) għal \(117\,\hbox {bp}\ ) u 0.03 –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) għal \(503\,\hbox {bp}\)).Voltammogrammi rappreżentattivi huma murija fil-Figura S1 f'Informazzjoni Supplimentari.Figura 2 turi r-riżultati ta 'DPV u kejl CV (kurrent massimu) bl-użu ta' prodotti PCR purifikati bil-ġel. Meta mqabbel mal-kejl CV, kejl DPV juri sensittività ogħla (kurrent bħala funzjoni tal-konċentrazzjoni tad-DNA) minħabba li l-kurrenti abilità fl-isfond fil-kejl CV jaħbu kurrenti Faradaic 26 .Id-data għal kull kaxxa fil-boxplot fiha kejl minn 5 elettrodi. Il-kejl kollu juża l-istess sett ta 'elettrodi biex jevita żbalji ta' kejl minħabba varjazzjoni minn elettrodu għal elettrodu.Nosservajna xejra dejjem tiżdied fid-DPV u CV mkejla tal-ogħla kurrent għal konċentrazzjonijiet aktar baxxi ta 'DNA , itwal (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ meta mqabbel ma \(117) ) framment.Dan huwa konsistenti max-xejra mistennija ta 'adsorbiment ta' elettrodi rrappurtati fix-xogħol preċedenti tagħna. l-assorbiment tal-kumpless MB-DNA jiffaċilita t-trasferiment ta 'ċarġ fuq l-elettrodu, li jikkontribwixxi għaż-żieda tal-ogħla kurrent. -cytosine (GC) kontenut taż-żewġ amplicons (\(117\,\hbox {bp}\) u \(503\,\hbox {bp}\)) kien madwar 50%, li jindika li l-osservazzjoni Id-differenza hija dovuta għat-tul tal-amplikon.Madankollu, għal konċentrazzjonijiet ogħla tad-DNA (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), għal \(503\,\hbox {bp} \) u \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) għal \(117\,\hbox {bp}\)), aħna nosservaw żewġ amplifikazzjonijiet Il- l-ogħla kurrenti tas-subs huma mnaqqsa kemm f'kejl DPV kif ukoll CV. Dan huwa minħabba li l-MB saturat u jinterkata bejn pari bażi ta 'DNA, li jirriżulta f'inibizzjoni sterika tal-attività redox tal-grupp riduċibbli f'MB31,32.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (ċ) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
Imluħa preżenti fit-taħlitiet prinċipali tal-PCR jinterferixxu ma' interazzjonijiet elettrostatiċi bejn MB u DNA, għalhekk billi żżid \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) ma \({50} \,{\ upmu \hbox {M}}\) Prodott purifikat bil-ġel MB biex jistudja l-effett tal-melħ fuq l-interazzjoni MB-DNA. Kif muri fil-Figura 3, osservajna li għal konċentrazzjonijiet ogħla tad-DNA (\(>{2}\,{\ hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) u \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) għal \(117\,\hbox {bp} \)), f'DPV u CV Iż-żieda tal-melħ ma affettwatx b'mod sinifikanti l-kejl (ara Figura S2 f'Informazzjoni Supplimentari għal voltammogrammi rappreżentattivi).Madankollu, fi konċentrazzjonijiet aktar baxxi tad-DNA, iż-żieda ta 'melħ tnaqqas ħafna s-sensittività, li tirriżulta fl-ebda bidla sinifikanti fil-kurrent mal-konċentrazzjoni tad-DNA. Il-cations Mg}^{2+}\) jingħaqdu mas-sinsla negattiva tal-fosfat tad-DNA, u b'hekk ixekklu l-interazzjoni elettrostatika bejn l-MB u d-DNA.F'konċentrazzjonijiet ogħla tad-DNA, l-inibizzjoni sterika ta' MBs redox-attivi tirriżulta f'kurrenti ogħla aktar baxxi, għalhekk interazzjonijiet elettrostatiċi ma jaffettwawx b'mod sinifikanti r-rispons tas-sensor. Il-punt ewlieni huwa li dan il-bijosensur huwa aktar adattat biex jiskopri konċentrazzjonijiet ogħla tad-DNA (rari \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) jew ogħla), għal kompletament- Ipproċessar awtomatizzat ta 'kampjuni ta' ilma ambjentali, fejn il-purifikazzjoni tal-ġel tal-prodotti PCR tista 'ma tkunx fattibbli.
Żona taħt il-kurva ta' assorbiment għall-medda ta' wavelength 600–700 \(\hbox {nm}\) għal diversi konċentrazzjonijiet ta' DNA kumplessi ma' \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) bil-melħ u mingħajr (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) bil-melħ u mingħajru (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) Konċentrazzjonijiet tad-DNA li jikkorrispondu għal \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB kampjuni L-ebda DNA.
Biex nivverifikaw aktar ir-riżultati ta’ hawn fuq, wettaqna kejl ottiku bl-użu ta’ spettrofotometru UV/Vis (Thermo Scientific Multiskan GO), il-kampjuni \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) intużaw għal kull wieħed. Kejl.Il-firma ta' assorbiment tonqos maż-żieda fil-konċentrazzjoni tad-DNA, kif jidher mit-tendenza taż-żona taħt il-kurva ta' assorbiment għall-medda ta' wavelength \(600\,\hbox {nm}\) sa \(700\,\hbox { nm}\), kif muri f'Fig. 4 (spettru ta' assorbiment muri f'Fig. S3 f'Informazzjoni Supplimentari). Għal kampjuni b'konċentrazzjonijiet tad-DNA inqas minn \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), ma kien hemm l-ebda differenza sinifikanti fl-assorbiment bejn kampjuni li fihom DNA u MB biss (għal \(503\,\hbox {bp}\) u \(117\,\hbox {bp}\) ) frammenti ta 'tul), li jindikaw in-nuqqas ta' inibizzjoni sterika ta 'MB redox-attiv.F'konċentrazzjonijiet ogħla tad-DNA, osservajna tnaqqis gradwali fis-sinjal ta' assorbiment u nnota tnaqqis inqas fl-assorbiment fil-preżenza ta 'melħ.Dawn ir-riżultati ġew attribwiti għal molekulari interazzjonijiet u inibizzjoni sterika b'stivar ta' bażi f'ibridi tad-DNA. Ir-riżultati tagħna huma konsistenti mar-rapporti fil-letteratura dwar studji spettroskopiċi ta' interkalazzjoni MB-DNA li jassoċjaw l-ipokromatiċità ma' livelli ta' enerġija mnaqqsa fi \(\pi\)–\(\pi ^*\ ) transizzjonijiet elettroniċi minħabba interkalazzjoni Saffi 36, 37, 38.
Elettroforeżi tal-ġel tal-agarose tal-phage Phi6: prodotti tal-PCR ta 'tul \(117\,\hbox {bp}\) u \(503\,\hbox {bp}\) minn kampjuni tal-ilma tal-għadira. Marker M-DNA;Kontroll NTC-no-template, primers li fihom amplicons korrispondenti;Kontroll pożittiv tal-PC;1, 2, 3-mhux dilwit (1:1) kampjuni tal-ilma tal-lag bi tliet kopji. Faxxa hija viżibbli f'\(\madwar 50\,\hbox {bp}\) minħabba oligonukleotidi mhux użati fil-\(503\,\). hbox {bp}\) korsija.
Aħna evalwajna l-utilità tas-sensor bl-użu ta' kampjuni ta' l-ilma tal-Lag Powai miżjuda b'Phi6 phage. ml}}\), filwaqt li dawk iżolati minn sospensjonijiet tal-fagi purifikati L-RNA kien stmat li jkun \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) b'effiċjenza ta' rkupru ta' madwar 1. %.RNA ġie traskritt b'lura f'cDNA u użat bħala mudell għal PCR u qPCR. Id-daqs tal-prodott kien ikkonfermat b'elettroforeżi tal-ġel tal-agarose (Figura 5) qabel l-ittestjar bis-sensor. Dawn il-kampjuni mhumiex ippurifikati bil-ġel u għalhekk fihom il-komponenti kollha tal-PCR bħala kif ukoll l-amplicons ta 'interess. Il-valuri Ct irreġistrati waqt qPCR (Tabella 1) intwerew li jikkorrelataw mal-konċentrazzjoni ta' RNA iżolati mill-kampjuni tal-ilma bil-ponta korrispondenti. Il-valur Ct juri n-numru ta 'ċikli meħtieġa għas-sinjal fluworexxenti biex jaqbeż il-limitu jew is-sinjal fl-isfond.Valuri Ct ogħla jindikaw konċentrazzjonijiet ta' template aktar baxxi u viċi versa.Il-valuri Ct tal-kampjuni NTC kienu għoljin daqs kemm kien mistenni.Id-differenza f'\(\madwar 3\) valuri Ct bejn il-kontroll pożittiv u l-kampjun tat-test jindikaw aktar li kull kampjun tat-test għandu madwar 1% template meta mqabbel mal-kontroll pożittiv.Preċedentement iddiskutejna li amplicons itwal iwasslu għal sensittività aħjar.Amplifikazzjoni ta 'frammenti itwal iżolati minn kampjuni ambjentali eteroġeni hija ta' sfida minħabba l-iżvantaġġi ta 'konċentrazzjoni virali baxxa u degradazzjoni tal-RNA.Madankollu, bl-arrikkiment tal-virus tagħna u l-protokoll ta' amplifikazzjoni tal-PCR, stajna namplifikaw b'suċċess il-framment \(503\,\hbox {bp}\) għal sensing elettrokimiku.
Il-Figura 6 turi r-riżultati tas-sensorju elettrokimiku tal-amplicon tal-framment \(503\,\hbox {bp}\), it-tnejn bl-użu ta' cDNA mhux dilwit bħala mudell (1:1) kif ukoll cDNA dilwit 100 darba bħala mudell (1:100) magħmul PCR , meta mqabbel ma 'NTC u PC (ara Figura S4 f'Informazzjoni Supplimentari għal voltammograms rappreżentattivi).Kull kaxxa fil-boxplot fil-Figura 6 fiha kejl minn tliet kampjuni f'elettrodi 5. L-istess elettrodi ntużaw biex ikejlu l-kampjuni kollha biex jiġu evitati żbalji minħabba l-elettrodu -to-electrode variation.Compared mal-kejl tas-CV, il-kejl DPV juri riżoluzzjoni aħjar biex jiddistingwi kampjuni tat-test u tal-PC minn NTCs minħabba li, kif issemma qabel, il-kurrenti Faradaic huma moħbija minħabba l-kurrenti abilità fl-isfond f'dawn tal-aħħar. Għal amplicons itwal, osservajna li il-kontroll negattiv (NTC) irriżulta f'kurrenti ogħla CV u DPV relattivi għall-kontroll pożittiv, filwaqt li kampjuni tat-test pożittivi u mhux dilwiti wrew għoli simili tal-ogħla kurrenti DPV. Il-valuri medji u medjani mkejla għal kull mhux dilwit (1:1). ) Il-kampjun tat-test u l-PC jistgħu jiġu solvuti b'mod ċar mill-output tas-sensor għall-kampjun NTC, filwaqt li r-riżoluzzjoni għall-kampjun dilwit 1:100 hija inqas pronunzjata. Għal dilwizzjoni ta '100 darba ta' cDNA, ma osservajna l-ebda strixxa waqt l-elettroforeżi tal-ġell (korsiji mhux murija fil-Figura 5), u l-ogħla kurrenti DPV u CV korrispondenti kienu simili għal dawk mistennija għal NTC. Ir-riżultati għall-framment \(117\,\hbox {bp}\) huma murija f'Informazzjoni Supplimentari. In-negattiv kontroll indotta rispons elettrokimiku mis-sensor tal-PCB minħabba l-assorbiment ta 'MB ħieles fuq l-elettrodu u l-interazzjoni ta' l-MB ma 'l-oligonucleotide primer-stranded.Therefore, kull darba li kampjun jiġi ttestjat, kontroll negattiv għandu jitmexxa u l- l-ogħla kurrent tal-kampjun tat-test meta mqabbel mal-ogħla kurrent miksub mill-kontroll negattiv biex jinkiseb kejl differenzjali (relattiv)39,40 biex tikklassifika l-kampjun tat-test bħala pożittiv jew negattiv.
(a) DPV, u (b) CV peak current għal sejbien elettrokimiku ta' frammenti ta' \(503\,\hbox {bp}\) f'kampjuni tal-ilma tal-għadira. Kampjuni tat-test tkejlu fi tliet kopji u mqabbla ma' l-ebda mudell ta' kontrolli (NTC) u kontrolli pożittivi (PC).
Is-sejbiet tagħna juru mekkaniżmi differenti li jaffettwaw il-prestazzjoni ta 'sensors elettrokimiċi għal amplicons ta' tulijiet differenti għal DNAs differenti, b'konċentrazzjonijiet verifikati minn kejl ottiku bl-użu ta 'spettrofotometru UV/Vis. L-osservazzjonijiet tagħna jenfasizzaw l-għarfien li frammenti itwal tad-DNA sa \(\approx\) \(500\,\hbox {bp}\) jistgħu jiġu skoperti b'sensittività ogħla u li l-preżenza ta 'melħ fil-kampjun ma sensittività konċentrazzjoni tad-DNA li taffettwa sensittività ogħla (rari \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) u aktar). Barra minn hekk, investigajna l-effett ta 'tipi differenti ta' kampjuni, inklużi amplicons purifikati bil-ġel bi u mingħajr melħ miżjud, u żieda ta 'kampjuni tal-ilma tal-lag fil-kejl DPV u CV.Aħna osservajna li DPV ipprovda riżoluzzjoni aħjar, peress li l-kurrent abilità fl-isfond jaffettwa wkoll il-kejl tas-CV, u jagħmilha inqas sensittiva.
L-amplifikazzjoni ta 'frammenti itwal tiddependi fuq l-integrità tal-RNA ġenomika virali. Diversi studji wrew li l-amplifikazzjoni ta' frammenti itwal mhux dejjem hija effiċjenti minħabba d-degradazzjoni tal-RNA fl-ambjent u l-potenzjal għal splicing waqt l-iżolament11,41,42,43,44 .Nosservajna li l-metodu ta 'konċentrazzjoni tal-virus ibbażat fuq PEG kien aktar effettiv fil-konċentrazzjoni tal-phage Phi-6 spiked f'kampjuni tal-ilma tal-lag mill-metodu ta' konċentrazzjoni tal-virus ibbażat fuq l-idrossidu tal-aluminju. biex tkabbar mudelli multipli ta' tul iqsar u titnaqqas il-possibbiltà ta 'speċiċità trasversali.
Kampjuni bijoloġiċi huma skarsi, għalhekk hemm bżonn li jiġi ddisinjat bijosensur li jeħtieġ kampjuni minimi għall-ittestjar. L-elettrodi tal-PCB ENIG użati f'dan l-istudju kienu jeħtieġu biss \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ ) kampjuni għall-ittestjar biex ikopru l-erja effettiva ta 'l-elettrodi. Barra minn hekk, l-istess elettrodu jista' jerġa 'jintuża wara t-tindif qabel ma jingħata l-kampjun li jmiss. u kimika użata komunement. Peress li kull elettrodu jiswa madwar $ 0.55 (jew INR 40) għall-manifattura, dan il-bijosensur jista 'jkun alternattiva kost-effettiva għal teknoloġiji ta' skoperta eżistenti. It-Tabella 2 turi paragun ta 'dan ix-xogħol ma' sensuri oħra rrappurtati fil-letteratura għal żmien twil Frammenti tad-DNA f'kampjuni eteroġenji.
Minħabba li l-protokolli ta' sejbien elettrokimiku bbażati fuq MB jiddependu fuq l-ispeċifiċità tal-PCR, limitazzjoni ewlenija ta 'dan il-metodu hija l-potenzjal għal amplifikazzjoni mhux speċifika f'kampjuni eteroġenji bħal ilma mormi u ilma tal-lagi jew bl-użu ta' primers ta 'purità baxxa. Biex tittejjeb is-sensittività ta' metodi ta 'skoperta elettrokimiku għall-iskoperta tad-DNA ta' prodotti PCR mhux purifikati bl-użu ta 'elettrodi ENIG PCB mhux modifikati, huwa meħtieġ li jifhmu aħjar l-iżbalji introdotti minn dNTPs u primers mhux użati, u biex jiġu ottimizzati l-kundizzjonijiet ta' reazzjoni u protokolli ta 'assaġġ. Parametri fiżikokimiċi addizzjonali bħal pH, temperatura u bijoloġiċi Id-domanda għall-ossiġnu (BOD) tal-kampjun ta 'l-ilma jista' wkoll jeħtieġ li titkejjel sabiex tittejjeb l-eżattezza tal-kejl.
Bħala konklużjoni, nipproponu sensor ENIG PCB elettrokimiku bi prezz baxx għall-iskoperta tal-virus f'kampjuni ambjentali (ilma tal-lag). B'differenza mill-elettrodi oligonukleotidi immobilizzati jew sottostrati personalizzati għal sensing tad-DNA li jeħtieġu ħażna krijoġenika biex iżżomm is-sensittività,53,54 it-teknika tagħna tuża PCB mhux modifikat elettrodi b'ħajja itwal fuq l-ixkaffa u l-ebda rekwiżiti speċifiċi ta 'ħażna u għalhekk adattati għall-iżvilupp ta' soluzzjonijiet ta 'kejl bi proċessar ta' kampjuni awtomatizzat skjerat f'LMICs.Il-bijosensur juża żebgħa redox (MB) rħas li intercalating DNA għal skoperta rapida ta 'amplicons fil-mira. L-amplifikazzjoni mhux speċifika komuni f'kampjuni ambjentali jnaqqas l-ispeċifiċità ta 'dan il-metodu ta' sensing minħabba t-twaħħil mhux speċifiku ta 'MBs għal oligonukleotidi b'linja waħda u doppja. Għalhekk, l-ispeċifiċità ta' dan it-test tiddependi fuq l-ottimizzazzjoni ta 'primers u kundizzjonijiet ta' reazzjoni PCR. Barra minn hekk, is-CV u l-ogħla kurrenti tad-DPV miksuba mill-kampjuni ttestjati għandhom jiġu interpretati relattivi għar-risponsi miksuba mill-kontroll negattiv (NTC) għal kull test.Id-disinji u l-metodi tas-sensuri elettrokimiċi ppreżentati f'dan ix-xogħol jistgħu jiġu integrati ma 'awtosamplers biex jiżviluppaw awtomatizzat u baxx għal kollox. -soluzzjoni ta 'spejjeż li tista' tiġbor u tanalizza kampjuni u tittrasmetti mingħajr fili r-riżultati lura lill-laboratorju.
Cashdollar, J. & Wymer, L. Metodi għall-konċentrazzjoni inizjali ta 'viruses minn kampjuni ta' ilma: reviżjoni u meta-analiżi ta 'studji reċenti.J.Applikazzjoni.mikroorganiżmu.115, pp 1-11 (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL Viruses mill-ilma: Ostakoli għall-ilma tajjeb għax-xorb.PLoS Pathogens.11, E1004867 (2015).
Shrestha, S. et al.Epidemjoloġija tal-ilma mormi għal sorveljanza kost-effettiva fuq skala kbira ta 'COVID-19 f'pajjiżi bi dħul baxx u medju: sfidi u opportunitajiet.Water 13, 2897 (2021).
Palecek, E. & Bartosik, M. Nucleic acid electrochemistry.Chemical.Rev.112, 3427–3481 (2012).
Tani, A., Thomson, AJ & Butt, JN Metilene blu bħala diskriminatur elettrokimiku ta 'oligonukleotidi b'linja waħda u doppja immobilizzati fuq substrati tad-deheb.Analyst 126, 1756-1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ Tqabbil ta 'Intercalators tal-Kation u tal-Anjoni għat-Trasduction Elettrokimika tal-Ibridizzazzjoni tad-DNA permezz ta' Transfer.Electrochemistry.comminicate.6, 648-654 (2004) ta 'Lul-Range Electron Transfer.
Wong, EL & Gooding, JJ Trasferiment ta 'ċarġ permezz tad-DNA: biosensor.anus.Chemical.78 tad-DNA elettrokimiku selettiv, 2138–2144 (2006).
Fang, TH et al.Apparat mikrofluwidi PCR f'ħin reali b'detection elettrokimiku konkorrenti.sensor bijoloġiku.Bioelectronics.24, 2131–2136 (2009).
Win, BY et al.Studju tal-mekkaniżmu tas-sinjalar u verifika tal-prestazzjoni ta 'sistema ta' PCR elettrokimika f'ħin reali bbażata fuq l-interazzjoni ta 'methylene blue mad-DNA.Analyst 136, 1573–1579 (2011).
Ramirez-Chavarria, RG et al.Sensur elettrokimiku bbażat fuq amplifikazzjoni iżotermika medjat minn loop għall-iskoperta ta’ sars-cov-2 f’kampjuni ta’ ilma mormi.J.Environment.Chemical.Britain.10, 107488 (2022).
Kumar, M. et al.Sensing elettrokimiku ta 'amplicons SARS-CoV-2 b'elettrodi PCB.Is-senser huwa attivat.B Chemistry.343, 130169 (2021).
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. & Yoshida, H. Sejbien effiċjenti ta 'SARS-CoV-2 RNA fil-frazzjoni solida ta' wastewater.science.general environment.763, 144587 (2021).
Alygizakis, N. et al.Analytical Methods for SARS-CoV-2 Detection in Wastewater: Protocol and Future Perspectives.TraC trending anal.Chemical.134, 116125 (2020).
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. & Kashtan, N. Sopravivenza tal-batterjofagu enveloped Phi6 (surrogat għal SARS-CoV-2) fi qtar tal-bżieq evaporat depożitat fuq uċuħ tal-ħġieġ.science.Rep.10, 1–10 (2020).
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ Persistenza ambjentali ta 'sostitut ta' SARS-CoV-2 (Phi6) f'amoeba ta 'ħajja libera.J.Saħħa tal-Ilma 20, 83 (2021).
Mindich, L. Imballaġġ preċiż ta 'tliet frammenti ġenomiċi ta' double-stranded RNA bacteriophage\(\varphi\)6.microorganism.Moore.biology.Rev.63, 149–160 (1999).
Pirttimaa, MJ & Bamford, Struttura sekondarja tar-reġjun tal-ippakkjar DH RNA phage\(\varphi\)6.RNA 6, 880–889 (2000).
Bonilla, N. et al.Phages on the Tap - Protokoll veloċi u effiċjenti għall-preparazzjoni ta 'ħażniet tal-laboratorju ta' batterjofaġi.PeerJ 4, e2261 (2016).
Ħin tal-post: Mejju-27-2022