പിസിബി ഇലക്‌ട്രോഡുകൾ ഉപയോഗിച്ച് ജല സാമ്പിളുകളിലെ വൈറൽ ന്യൂക്ലിക് ആസിഡുകളുടെ ഇലക്‌ട്രോകെമിക്കൽ സെൻസിങ്ങിന് ദൈർഘ്യമേറിയ ആംപ്ലിക്കോണുകൾ മികച്ച സംവേദനക്ഷമത നൽകുന്നു.

Nature.com സന്ദർശിച്ചതിന് നന്ദി.നിങ്ങൾ ഉപയോഗിക്കുന്ന ബ്രൗസർ പതിപ്പിന് CSS-ന് പരിമിതമായ പിന്തുണയേ ഉള്ളൂ.മികച്ച അനുഭവത്തിനായി, അപ്ഡേറ്റ് ചെയ്ത ബ്രൗസർ (അല്ലെങ്കിൽ Internet Explorer-ൽ അനുയോജ്യത മോഡ് ഓഫാക്കുക) ഉപയോഗിക്കാൻ ഞങ്ങൾ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു. തുടർച്ചയായ പിന്തുണ, ഞങ്ങൾ ശൈലികളും JavaScript ഇല്ലാതെ സൈറ്റ് പ്രദർശിപ്പിക്കും.
COVID-19 പാൻഡെമിക്കിന്റെ തുടക്കം മുതൽ പാരിസ്ഥിതിക സാമ്പിളുകൾ നിരീക്ഷിക്കുന്നതിന്റെ പ്രാധാന്യം വളരെയധികം വിലമതിക്കപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്, കൂടാതെ qPCR അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള സാങ്കേതിക വിദ്യകൾ ചെലവേറിയതാണെങ്കിലും ചില നിരീക്ഷണ ശ്രമങ്ങൾ സ്വർണ്ണ നിലവാരം ഉപയോഗിച്ച് നടത്തുന്നുണ്ട്. താഴ്ന്ന, ഇടത്തരം വരുമാനമുള്ള രാജ്യങ്ങളിലെ പാരിസ്ഥിതിക ജല സാമ്പിളുകൾ നിരീക്ഷിക്കുന്നതിനുള്ള പരിഹാരം. ഈ സൃഷ്ടിയിൽ, ENIG ഉപയോഗിച്ച് സ്പൈക്ക്ഡ് തടാക ജല സാമ്പിളുകളിൽ നിന്ന് (SARS-CoV-2 ന്റെ ജനപ്രിയ സറോഗേറ്റ്) വേർതിരിച്ചെടുത്ത Phi6 phage-ൽ നിന്ന് ലഭിച്ച ആംപ്ലിക്കോണുകളുടെ ഇലക്ട്രോകെമിക്കൽ കണ്ടെത്തൽ ഞങ്ങൾ പ്രകടമാക്കുന്നു. ഉപരിതല മാറ്റം കൂടാതെ PCB ഇലക്ട്രോഡുകൾ പൂർത്തിയാക്കാൻ.ലൈംഗികത.ഇലക്ട്രോകെമിക്കൽ സെൻസർ പ്രതികരണം വ്യത്യസ്ത ദൈർഘ്യമുള്ള (\({117}\,\hbox {bp}\) കൂടാതെ \({503}\,\hbox {bp}\)) രണ്ട് ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങൾക്കായി നന്നായി വിശേഷിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നു. പിസിആർ മാസ്റ്റർ മിക്സുകളിലെ ലവണങ്ങളുടെ പ്രഭാവം മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ (എംബി)-ഡിഎൻഎ ഇടപെടലുകളിൽ ഉൾപ്പെടുന്നു. ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങളുടെ നീളം ഇലക്ട്രോകെമിക്കൽ സെൻസിറ്റിവിറ്റിയെ ഗണ്യമായി നിർണ്ണയിക്കുന്നുവെന്നും പിസിആർ ഉൽപ്പന്നങ്ങളുടെ ജെൽ ശുദ്ധീകരണമില്ലാതെ നീളമുള്ള ആംപ്ലിക്കോണുകൾ കണ്ടെത്താനുള്ള കഴിവ് ഈ കൃതിയിൽ തെളിയിക്കുന്നുവെന്നും ഞങ്ങളുടെ ഫലങ്ങൾ കാണിക്കുന്നു. ജല സാമ്പിളുകളുടെ സ്ഥലത്തെ അളക്കലിന് പ്രധാനമാണ്.വൈറൽ ലോഡിന് പൂർണ്ണമായും ഓട്ടോമേറ്റഡ് സൊല്യൂഷൻ ശുഭസൂചന നൽകുന്നു.
ജലത്തിലൂടെയുള്ള വൈറസ് പകരുന്നത് 1940-കൾ മുതൽ പൊതുജനാരോഗ്യ അപകടമായി അറിയപ്പെടുന്നു, പോളിയോ, ഹെപ്പറ്റൈറ്റിസ് E1 എന്നിവയുടെ ജലത്തിലൂടെ പകരുന്നതിന്റെ ആദ്യ തെളിവുകൾ. ലോകാരോഗ്യ സംഘടന (WHO) മിതമായതും ഉയർന്നതുമായ ആരോഗ്യ പ്രാധാന്യമുള്ള നിരവധി ജലവൈറൽ രോഗകാരികളെ തരംതിരിച്ചിട്ടുണ്ട്2. പരമ്പരാഗത വൈറസ് കണ്ടെത്തൽ രീതികൾ സ്വർണ്ണ-നിലവാരമുള്ള qPCR അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള സാങ്കേതികതകളെ ആശ്രയിക്കുന്നു, അവ വളരെ സെൻസിറ്റീവും നിർദ്ദിഷ്ടവുമാണ്, എന്നാൽ വിലകൂടിയ ഉപകരണങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ച് ലബോറട്ടറിയിൽ പരീക്ഷിക്കാൻ വൈദഗ്ധ്യമുള്ള ഉദ്യോഗസ്ഥർ ആവശ്യമാണ്. എന്നിരുന്നാലും, താഴ്ന്ന, ഇടത്തരം വരുമാനമുള്ള രാജ്യങ്ങളിൽ (LMICs) പരിമിതമായ വിഭവങ്ങൾ, മനുഷ്യർ. പാരിസ്ഥിതിക ജല സാമ്പിൾ നിരീക്ഷണത്തേക്കാൾ സാമ്പിൾ പരിശോധനയ്ക്ക് മുൻതൂക്കം ലഭിക്കാൻ സാധ്യതയുണ്ട്. അതിനാൽ, ഉയർന്നുവരുന്ന രോഗങ്ങൾ പൊട്ടിപ്പുറപ്പെടുന്നതിന്റെ മുൻകൂർ മുന്നറിയിപ്പ് എന്ന നിലയിൽ, താഴ്ന്ന, ഇടത്തരം വരുമാനമുള്ള രാജ്യങ്ങളിലെ ജലത്തിന്റെയും മലിനജല സാമ്പിളുകളുടെയും സുസ്ഥിരവും തത്സമയ നിരീക്ഷണത്തിനും ചെലവ് കുറഞ്ഞ ബദൽ രീതികൾ ആവശ്യമാണ്. അതുവഴി വൈറസ് പാൻഡെമിക്കിന്റെ ഗുരുതരമായ സാമൂഹിക സാമ്പത്തിക ആഘാതങ്ങളിൽ നിന്ന് അവരെ സംരക്ഷിക്കുന്നു. ന്യൂക്ലിക് ആസിഡുകൾക്കായുള്ള ചെലവ് കുറഞ്ഞ ഇലക്ട്രോകെമിക്കൽ ബയോസെൻസറുകൾക്ക് ഈ അപര്യാപ്തമായ ആവശ്യത്തിന് ഒരു വാഗ്ദാന സാധ്യതയുള്ള പരിഹാരം നൽകാൻ കഴിയും. ഈ ഡിഎൻഎ ബയോസെൻസറുകളിൽ പലതും പ്രവർത്തിക്കുന്നത് പൂരകമായ ഡിഎൻഎ സ്ട്രോണ്ടുകൾ ഇലക്ട്രോഡിൽ നിശ്ചലമാകുന്നതാണ്. സാമ്പിളിൽ പൊരുത്തപ്പെടുന്ന ക്രമം ഉണ്ടാകുമ്പോൾ ഉപരിതലവും ഹൈബ്രിഡൈസും. ഇത് പിന്നീട് പൊട്ടാസ്യം ഇരുമ്പ്/ഫെറോസയനൈഡ് പോലുള്ള റെഡോക്സ് മീഡിയേറ്ററുകൾ ഉപയോഗിച്ച് വിവിധ ഇലക്ട്രോകെമിക്കൽ ടെക്നിക്കുകൾ വഴി ഒരു സിഗ്നലായി പരിവർത്തനം ചെയ്യാൻ കഴിയും. സിംഗിൾ-സ്ട്രാൻഡഡ് ഡിഎൻഎ 5,6-ലേക്ക് കൂടുതൽ വ്യക്തമല്ലാത്ത ബന്ധനത്തിന് പുറമെ ഇരട്ട-സ്ട്രാൻഡഡ് ഡിഎൻഎ (ഡിഎസ്ഡിഎൻഎ) ആയി ഇടകലരുന്നതായി റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യപ്പെട്ടു. സെൻസർ കോൺഫിഗറേഷനുകൾ5,6,7,8,9. MB-യുമായുള്ള ഡിഎൻഎയുടെ ഇന്റർകലേഷൻ വ്യക്തമല്ലെങ്കിലും, ഈ ഇലക്ട്രോകെമിക്കൽ സെൻസറിന്റെ പ്രത്യേകത പ്രധാനമായും PCR അല്ലെങ്കിൽ ഐസോതെർമൽ ആംപ്ലിഫിക്കേഷനായി ഉപയോഗിക്കുന്ന പ്രൈമറുകളുടെ പരിശുദ്ധിയെ ആശ്രയിച്ചിരിക്കുന്നു, ഇത് യഥാർത്ഥത്തിൽ നടപ്പിലാക്കാൻ അനുയോജ്യമാണ്. -ടൈം ഇലക്ട്രോകെമിക്കൽ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള qPCR അല്ലെങ്കിൽ ഫ്ലൂറസെൻസ് ഐസോതെർമൽ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ഡിഎൻഎ കോൺസൺട്രേഷൻ അളക്കലിന് ബദലായി 9 .അത്തരത്തിലുള്ള ഒരു നടപ്പാക്കലിൽ, വോൺ മറ്റുള്ളവരും. സ്വർണ്ണ ഇലക്ട്രോഡുകളുടെ ഉപരിതലം 6-മെർകാപ്‌റ്റോ-1-ഹെക്സാനോൾ (MCH) ഉപയോഗിച്ച് തത്സമയം പരിഷ്ക്കരിച്ചു. ഡിഫറൻഷ്യൽ പൾസ് വോൾട്ടാമെട്രി (DPV) ഉപയോഗിച്ച് MB ഉപയോഗിച്ച് PCR ആംപ്ലിക്കോണുകളുടെ അളവ് അളക്കൽ 9. മറ്റു സന്ദർഭങ്ങളിൽ, Screen-printed ഇലക്ട്രോഡുകളുള്ള MB ഉപയോഗിച്ച് RT-LAMP റിയാക്ഷൻ വഴി മലിനജലത്തിൽ SARS-CoV-2 കണ്ടെത്തൽ. പ്ലാറ്റിനം ഇലക്ട്രോഡുകളും പ്രതിപ്രവർത്തന സമയത്ത് ആംപ്ലിക്കോണുകൾ ഇലക്ട്രോകെമിക്കലായി കണ്ടുപിടിക്കാൻ രൂപകൽപ്പന ചെയ്ത ഒരു മൈക്രോഫ്ലൂയിഡിക് PCR പ്ലാറ്റ്‌ഫോമിലെ സിറ്റു ഇലക്‌ട്രോഡുകളിലേത് പോലെ ഉപയോഗിക്കുന്നു.
തടാകജല സാമ്പിളുകളിലെ സാന്ദ്രീകൃത വൈറൽ കണങ്ങളിൽ നിന്ന് ലഭിച്ച ആംപ്ലിക്കോണുകളുടെ ഇലക്ട്രോകെമിക്കൽ കണ്ടെത്തലിനുള്ള വർക്ക്ഫ്ലോയുടെ സ്കീമാറ്റിക്.
പരിഷ്‌ക്കരിക്കാത്ത ഇലക്‌ട്രോഡുകളുടെ ഉപരിതലത്തിൽ MB-DNA കോംപ്ലക്‌സുകളുടെ ആഡ്‌സോർപ്‌ഷൻ വഴി പ്രേരിതമായ DPV, സൈക്ലിക് വോൾട്ടാമെട്രി (CV) എന്നിവയെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള കുറഞ്ഞ വിലയുള്ള പ്രിന്റഡ് സർക്യൂട്ട് ബോർഡ് (PCB) ഇലക്‌ട്രോഡുകൾ ഉള്ള SARS-CoV-2 ആംപ്ലിക്കോണുകളുടെ ഇലക്‌ട്രോകെമിക്കൽ സെൻസിംഗ് ഞങ്ങൾ അടുത്തിടെ പ്രദർശിപ്പിച്ചു. നിലവിലെ11.ദൈർഘ്യമേറിയ DNA ശകലങ്ങൾ (N1-N2, \({943}\, \hbox) CDC-ശുപാർശ ചെയ്ത N1 ഫോർവേഡ്, N2 റിവേഴ്സ് പ്രൈമറുകൾ ഉപയോഗിച്ച് രൂപപ്പെട്ടതായി ഞങ്ങൾ റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യുന്നു. (N1, \(72\,\hbox {bp}\)) N1 ഫോർവേഡ്, N1 റിവേഴ്സ് പ്രൈമർ സെറ്റുകൾ ഉപയോഗിച്ച് രൂപീകരിച്ചു. ന്യൂക്ലീസ് രഹിത വെള്ളത്തിൽ തയ്യാറാക്കിയ ഡിഎൻഎ ഡൈല്യൂഷനുകൾ ഉപയോഗിച്ചാണ് ഈ പഠനങ്ങൾ റിപ്പോർട്ട് ചെയ്തിരിക്കുന്നത്. SARS-CoV കണ്ടെത്താനും പ്ലാറ്റ്ഫോം ഉപയോഗിച്ചു. സിമുലേറ്റ് ചെയ്ത മലിനജല സാമ്പിളുകളിൽ -2 ആംപ്ലിക്കോണുകൾ (SARS-CoV-2 RNA ഉപയോഗിച്ച് മൊത്തം RNA സാമ്പിളുകൾ സ്പൈക്കുചെയ്യുന്നതിലൂടെ ലഭിക്കുന്നു). ഒറ്റപ്പെടലിലും ഡൗൺസ്ട്രീം പ്രോസസ്സിംഗിലും RNA കത്രികയ്ക്ക് വിധേയമായതിനാൽ, 12,13 ഈ വൈവിധ്യമാർന്ന സാമ്പിൾ ഉപയോഗിച്ച് ദൈർഘ്യമേറിയ ശകലങ്ങൾ വർദ്ധിപ്പിക്കാൻ പ്രയാസമാണ്. അതിനാൽ, മലിനജലത്തിലെ SARS-CoV-2 ആംപ്ലിക്കോണിന്റെ ഇലക്ട്രോകെമിക്കൽ സെൻസിംഗിന്റെ പ്രദർശനം ചെറിയ \(72\,\hbox {bp}\) N1 ശകലത്തിലേക്ക് പരിമിതപ്പെടുത്തിയിരിക്കുന്നു.
ഈ സൃഷ്ടിയിൽ, തടാകജല സാമ്പിളുകളിൽ നിന്ന് (ചിത്രം 1) കേന്ദ്രീകരിച്ച് വേർതിരിച്ചെടുത്ത phage Phi6-ന്റെ ENIG PCB അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള ഇലക്ട്രോകെമിക്കൽ സെൻസിംഗിന്റെ സാധ്യതയെക്കുറിച്ച് ഞങ്ങൾ അന്വേഷിച്ചു (ചിത്രം. ഒരു ലിപിഡ് മെംബ്രണും സ്പൈക്ക് പ്രോട്ടീനും ഉണ്ട്. ഇക്കാരണങ്ങളാൽ, SARS-CoV-2 നും മറ്റ് പൊതിഞ്ഞ രോഗകാരിയായ RNA വൈറസുകൾക്കും 14,15. RNA വൈറസുകൾക്കുമായി ബാക്ടീരിയോഫേജ് Phi6 ഒരു ജനപ്രിയ സറോഗേറ്റാണ്. 117, 503 ബേസ് ജോഡികളുടെ നീളമുള്ള രണ്ട് ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങൾ ലഭിക്കാൻ PCR. ഞങ്ങളുടെ മുൻ വർക്കിൽ \(943\,\hbox {bp}\) N1-N2 ശകലങ്ങൾ വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിനുള്ള വെല്ലുവിളി കണക്കിലെടുത്ത്, ഞങ്ങൾ ഇന്റർമീഡിയറ്റ് ലെങ്ത് ശകലങ്ങൾ (\(117) ലക്ഷ്യമിടുന്നു. \,\hbox {bp}\) കൂടാതെ \(503 \,\hbox {bp}\)), ലഭ്യമായ പ്രൈമറുകളെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ളതാണ്. ഇലക്ട്രോകെമിക്കൽ സെൻസർ പ്രതികരണം വിപുലമായ കോൺസൺട്രേഷൻ ശ്രേണിയിൽ (\({10}\,{) വ്യവസ്ഥാപിതമായി പഠിച്ചു. \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) മുതൽ \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) വരെയുള്ള രണ്ട് ശകലങ്ങൾക്കും MB യുടെ സാന്നിധ്യം, സെൻസർ പ്രതികരണത്തിൽ ഉപ്പിന്റെ സ്വാധീനം സ്പെക്ട്രോഫോട്ടോമെട്രിക് അളവുകൾ മുഖേന സവിശേഷമാക്കപ്പെടുകയും ക്രോസ്-സാധുതപ്പെടുത്തുകയും ചെയ്തു. ഈ സൃഷ്ടിയുടെ പ്രധാന സംഭാവനകൾ ഇനിപ്പറയുന്നവയാണ്:
ഡിഎൻഎ ശകലത്തിന്റെ നീളവും സാമ്പിളിലെ ഉപ്പിന്റെ സാന്നിധ്യവും സംവേദനക്ഷമതയെ ശക്തമായി ബാധിക്കുന്നു.ഞങ്ങളുടെ ഫലങ്ങൾ കാണിക്കുന്നത് ഇലക്ട്രോകെമിക്കൽ പ്രവർത്തനം MB, DNA, സെൻസർ എന്നിവയുടെ പ്രതിപ്രവർത്തനത്തിന്റെ വിവിധ സംവിധാനങ്ങളെ ആശ്രയിച്ചിരിക്കുന്നു, ഡിഎൻഎ സാന്ദ്രതയെയും നീളത്തെയും ആശ്രയിച്ച്, നീളമുള്ള ശകലങ്ങൾ ഉയർന്ന സംവേദനക്ഷമത കാണിക്കുന്നു, എന്നിരുന്നാലും ഉപ്പ് തമ്മിലുള്ള ഇലക്ട്രോസ്റ്റാറ്റിക് ഇടപെടലുകളെ പ്രതികൂലമായി ബാധിക്കുന്നു. എംബിയും ഡിഎൻഎയും.
പരിഷ്‌ക്കരിക്കാത്ത ഇലക്‌ട്രോഡുകളിലെ എംബി-ഡിഎൻഎ ഇടപെടലിന്റെ മെക്കാനിസം ഡിഎൻഎ കോൺസൺട്രേഷൻ നിർണ്ണയിക്കുന്നു, എംബി-ഡിഎൻഎ ഇടപെടലിന്റെ വിവിധ സംവിധാനങ്ങൾ ഡിഎൻഎ കോൺസൺട്രേഷനെ ആശ്രയിച്ചിരിക്കുന്നുവെന്ന് ഞങ്ങൾ തെളിയിക്കുന്നു. {l}}}\), ഇലക്‌ട്രോഡിലെ എംബി-ഡിഎൻഎയുടെ അഡ്‌സോർപ്‌ഷനാണ് ഇലക്‌ട്രോകെമിക്കൽ കറന്റ് പ്രതികരണം പ്രധാനമായും നിർണ്ണയിക്കുന്നത്, അതേസമയം കുറഞ്ഞ സാന്ദ്രതയിൽ ഉയർന്ന ഡിഎൻഎ സാന്ദ്രതയിൽ, ഇലക്ട്രോകെമിക്കൽ കറന്റ് പ്രതികരണം നിർണ്ണയിക്കുന്നത് റെഡോക്‌സിന്റെ സ്റ്റെറിക് ഇൻഹിബിഷനാണ്. ഡിഎൻഎ അടിസ്ഥാന ജോഡികൾക്കിടയിൽ MB ഉൾപ്പെടുത്തൽ മൂലമുള്ള പ്രവർത്തനം.
തടാകജല സാമ്പിളുകളിലെ വൈറൽ ന്യൂക്ലിക് ആസിഡുകളുടെ ENIG PCB-അധിഷ്ഠിത ഇലക്ട്രോകെമിക്കൽ സെൻസിംഗ്, പവായ് തടാകത്തിലെ ഐഐടി മുംബൈ കാമ്പസിലെ ജലസാമ്പിളുകളിൽ നിന്ന് ലഭിച്ച Phi6 ചേർത്ത \(503\,\hbox {bp}\) ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങളുടെ ഇലക്ട്രോകെമിക്കൽ ഡിറ്റക്ഷൻ വഴി നിരീക്ഷണങ്ങൾ സാധൂകരിക്കപ്പെട്ടു. ഫല ഫേജ്.
ദൈർഘ്യമേറിയ ഷെൽഫ് ലൈഫുള്ള ഇലക്‌ട്രോഡുകളിലെ പൂർണ്ണ ഓട്ടോമേറ്റഡ് മോണിറ്ററിംഗ് സിസ്റ്റങ്ങൾ, ഒലിഗോ ന്യൂക്ലിയോടൈഡുകൾ അല്ലെങ്കിൽ ആപ്‌റ്റാമറുകൾ എന്നിവയുമായി സംയോജിപ്പിക്കുന്നതിനുള്ള കുറഞ്ഞ ചെലവും സാദ്ധ്യതയും.
Pseudomonas syringae-നെ ബാധിക്കുന്ന സൈറ്റോവിരിഡേ കുടുംബത്തിൽപ്പെട്ട ഒരു ആവരണം ചെയ്യപ്പെട്ട dsRNA വൈറസാണ് Phage Phi6. Phi6 phage ന്റെ ജീനോം 3 ശകലങ്ങളുടെ രൂപത്തിൽ നിലവിലുണ്ട്: S (\(2.95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4.07) \,\hbox {Kb}\)) കൂടാതെ L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\)) 16,17. Phi6 phage രോഗകാരിയല്ലാത്ത BSL-1 സ്യൂഡോമോണസ് സ്‌ട്രെയിനിനെ ബാധിക്കുന്നതിനാൽ, ഇത് ഉപയോഗിക്കുന്നത് സുരക്ഷിതമാണ്. ലബോറട്ടറിയിൽ എളുപ്പത്തിൽ വളർത്താം. Phage Phi6 ഉം അതിന്റെ ഹോസ്റ്റ് സ്യൂഡോമോണസ് സിറിംഗയും കാനഡയിലെ ലാവൽ യൂണിവേഴ്സിറ്റിയിലെ ബാക്ടീരിയ വൈറസുകൾക്കായുള്ള Felix d'Herelle റഫറൻസ് സെന്ററിൽ നിന്ന് വാങ്ങിയതാണ് (റഫറൻസ് സെന്റർ കാറ്റലോഗ് നമ്പറുകൾ യഥാക്രമം HER-102 ഉം HER-1102 ഉം ആണ്) .റഫറൻസ് സെന്റർ നിർദ്ദേശിച്ച പ്രകാരം Phi6 phage ഉം അതിന്റെ ഹോസ്റ്റും പുനരുജ്ജീവിപ്പിച്ചു. \(\ഏകദേശം 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { ഉപയോഗിച്ച് അന്തിമ ശീർഷകങ്ങൾ ലഭിക്കുന്നതിന് പ്ലേറ്റ് ലിസിസും എല്യൂഷനും വഴി Phage Phi6 ശുദ്ധീകരിച്ചു. ml}}\) (പ്ലാക്ക് ഫോർമിംഗ് യൂണിറ്റുകൾ/ മില്ലി ലിറ്ററുകൾ).നിർമ്മാതാവിന്റെ നിർദ്ദേശപ്രകാരം GenElute™ യൂണിവേഴ്സൽ ടോട്ടൽ RNA പ്യൂരിഫിക്കേഷൻ കിറ്റ് (സിഗ്മ-ആൽഡ്രിച്ച്) ഉപയോഗിച്ച് ശുദ്ധീകരിച്ച ഫേജ് കണങ്ങളിൽ നിന്ന് RNA വേർതിരിച്ചെടുത്തു. ചുരുക്കത്തിൽ, ഒരു ശുദ്ധീകരിച്ച phage Phi6 സസ്പെൻഷൻ\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) ലൈസ് ചെയ്തു, കൂടാതെ RNA-യെ റെസിൻ കോളവുമായി ബന്ധിപ്പിക്കാൻ അനുവദിക്കുന്നതിനായി ഒരു സ്പിൻ കോളത്തിൽ ലൈസേറ്റ് ലോഡ് ചെയ്തു. 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) കിറ്റ് നൽകിയിരിക്കുന്നു. \(260\,\hbox {nm}\) ൽ ആഗിരണം ചെയ്ത് RNA യുടെ സാന്ദ്രത കണക്കാക്കുക. ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) തുടർന്നുള്ള ഉപയോഗം വരെ.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) iScript cDNA സിന്തസിസ് കിറ്റ് (ബയോ -റാഡ് ലബോറട്ടറീസ്) നിർമ്മാതാവിന്റെ നിർദ്ദേശങ്ങൾ പാലിച്ച് cDNA സിന്തസിസിനുള്ള ഒരു ടെംപ്ലേറ്റായി ഉപയോഗിച്ചു. ചുരുക്കത്തിൽ, cDNA സിന്തസിസ് പ്രതികരണത്തിൽ 3 ഘട്ടങ്ങൾ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു: \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min} }\) , \({20}\,{\hbox {min}}\) എന്നതിന്റെ റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ \({46}\,{^{\circ }\hbox {C}}\), കൂടാതെ റിവേഴ്സ് റെക്കോർഡർ \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) ൽ \({1}\,{\hbox {min }}\).1% അഗറോസ് ജെല്ലിൽ പ്രവർത്തിപ്പിക്കുമ്പോൾ, പ്രതീക്ഷിച്ച മൂന്ന് ആർഎൻഎ ശകലങ്ങളുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്ന മൂന്ന് ബാൻഡുകൾ cDNA കാണിച്ചു (ഡാറ്റ കാണിച്ചിട്ടില്ല). 117, 503 bp നീളമുള്ള രണ്ട് DNA ശകലങ്ങൾ വർദ്ധിപ്പിക്കാൻ ഇനിപ്പറയുന്ന പ്രൈമറുകൾ ഉപയോഗിച്ചു. ഒരു മിനിPCR® മിനി8 തെർമൽ സൈക്ലറിൽ PCR-നുള്ള ടെംപ്ലേറ്റായി cDNA ഉപയോഗിക്കുന്നു:
\(117\,\hbox {bp}\), \(503\,\hbox {bp}\) എന്നിവയ്ക്കുള്ള പ്രൈമറുകൾ യഥാക്രമം എം സെഗ്‌മെന്റിന്റെ 1476-1575 ന്യൂക്ലിയോടൈഡുകളുമായും എൽ വിഭാഗത്തിലെ 458-943 ന്യൂക്ലിയോടൈഡുകളുമായും യോജിക്കുന്നു. .എല്ലാ ആംപ്ലിഫൈഡ് PCR ഉൽപ്പന്നങ്ങളും 1% അഗറോസ് ജെല്ലുകളിൽ ഇലക്ട്രോഫോറെസ് ചെയ്തു, കൂടാതെ GeneJET ജെൽ എക്സ്ട്രാക്ഷൻ കിറ്റ് (തെർമോ ഫിഷർ സയന്റിഫിക്) ഉപയോഗിച്ച് ആംപ്ലിഫൈഡ് ടാർഗെറ്റ് ഡിഎൻഎ ശുദ്ധീകരിച്ചു.
ഐഐടി മുംബൈ കാമ്പസിലെ ഒരു തടാകം (പൊവായ് തടാകം, പൊവായ്, മുംബൈ) ഫാജ് കണങ്ങൾ ചേർക്കാൻ ഉപയോഗിച്ചു. തടാകത്തിലെ വെള്ളം നീക്കം ചെയ്യുന്നതിനായി \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) മെംബ്രണിലൂടെ ഫിൽട്ടർ ചെയ്തു. സസ്പെൻഡ് ചെയ്ത കണികകൾ, തുടർന്ന് Phi6 phage ചേർത്തു. \({1}\,{\hbox {ml}}\) \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} ചേർക്കുക \) to \( {100}\ ,{\hbox {ml}}\) ഫിൽട്ടർ ചെയ്ത തടാകജലം, \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\).ഒരു ചെറിയ അലിഖോട്ട് ആയിരുന്നു ഫലക പരിശോധനയിലൂടെ വൈറൽ ലോഡ് അളക്കലിനായി നീക്കിവച്ചിരിക്കുന്നു. സ്പൈക്ക്ഡ് ഫൈ6 വൈറസ് കണങ്ങളെ കേന്ദ്രീകരിക്കാൻ ഞങ്ങൾ രണ്ട് വ്യത്യസ്ത രീതികൾ പരീക്ഷിച്ചു: (1) അലുമിനിയം ഹൈഡ്രോക്സൈഡ് അസോർപ്ഷൻ-പ്രിസിപിറ്റേഷൻ രീതി, 19 പരിസ്ഥിതി സാമ്പിളുകളിൽ നിന്ന് പൊതിഞ്ഞ നിരവധി ആർഎൻഎ വൈറസുകളുടെ സാന്ദ്രതയ്ക്ക് സാധൂകരിക്കപ്പെട്ടതാണ്, കൂടാതെ (2) ) പോളിയെത്തിലീൻ ഗ്ലൈക്കോൾ (PEG) അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള വൈറസ് കോൺസൺട്രേഷൻ രീതി ഫ്ലഡ് et al.20 .പിഇജി-അധിഷ്ഠിത രീതിയുടെ വീണ്ടെടുക്കൽ കാര്യക്ഷമത അലുമിനിയം ഹൈഡ്രോക്സൈഡ് രീതിയേക്കാൾ മികച്ചതാണെന്ന് കണ്ടെത്തിയതിനാൽ, തടാകജല സാമ്പിളുകളിൽ നിന്ന് Phi6 കണങ്ങളെ കേന്ദ്രീകരിക്കാൻ PEG അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള രീതി ഉപയോഗിച്ചു.
PEG രീതി ഉപയോഗിച്ചത് ഇപ്രകാരമാണ്: 8 % PEG 8000, \(0.2\,\hbox {M} \) \(Phi6-spiked തടാക ജല സാമ്പിളുകളിൽ PEG 8000, \(\hbox {NaCl}\) എന്നിവ ചേർത്തു. \ hbox {NaCl}\).സാമ്പിളുകൾ ഒരു ഷേക്കറിൽ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), തുടർന്ന് \(4700 \,\hbox {g}\) എന്നത് \({45}\,{\hbox {min}}\) ആണ് സെൻട്രിഫ്യൂജ് ചെയ്യുന്നത്. സൂപ്പർനാറ്റന്റ് ഉപേക്ഷിച്ച് പെല്ലറ്റ് \({1}\, എന്നതിൽ വീണ്ടും സസ്പെൻഡ് ചെയ്യുക. {\hbox {ml}}\) അതേ സൂപ്പർനാറ്റന്റിലാണ്. എല്ലാ സ്പൈക്കിംഗ്, വൈറസ് കോൺസൺട്രേഷൻ പരീക്ഷണങ്ങളും മൂന്ന് തവണയായി നടത്തി. ഏകാഗ്രതയ്ക്ക് ശേഷം, പ്ലാക്ക് അസ്സെ വഴി വീണ്ടെടുക്കൽ കാര്യക്ഷമത അളക്കുന്നതിനായി ഒരു ചെറിയ അലിക്വോട്ട് മാറ്റിവച്ചു. മുമ്പ് വിവരിച്ചതും ഒഴിവാക്കിയതും പോലെ ആർഎൻഎ വേർതിരിച്ചു. കിറ്റ്-സപ്ലൈഡ് എല്യൂഷൻ ബഫറിൽ\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\).ആർഎൻഎ കോൺസൺട്രേഷൻ സാമ്പിൾ മുതൽ സാമ്പിൾ വരെ മൂന്ന് തവണയായി വ്യത്യാസപ്പെടുന്നതിനാൽ, \({2}\,{\upmu \ ആർഎൻഎയുടെ hbox {l}}\) സാമ്പിളുകളുടെ cDNA സിന്തസിസ് കോൺസൺട്രേഷൻ പരിഗണിക്കാതെ തന്നെ മൂന്നിനും ഉപയോഗിക്കുന്നു. cDNA സിന്തസിസ് മുമ്പ് വിവരിച്ചത് പോലെയാണ് നടത്തിയത്.\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNA \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) 35 സൈക്കിളുകൾക്ക് \ (117\,\hbox {bp}\) കൂടാതെ \(503\,\hbox {) PCR എന്നതിന്റെ ടെംപ്ലേറ്റായി ഉപയോഗിച്ചു bp}\) ശകലങ്ങൾ. ഈ സാമ്പിളുകളെ “1:1″, അതായത് നേർപ്പിക്കാതെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു. ഒരു നോ-ടെംപ്ലേറ്റ് കൺട്രോൾ (NTC) ഒരു നെഗറ്റീവ് കൺട്രോളായി സജ്ജീകരിച്ചു, അതേസമയം ശുദ്ധീകരിച്ച ഫേജിൽ നിന്ന് വേർതിരിച്ചെടുത്ത RNA ഉപയോഗിച്ച് ഒരു cDNA സിന്തസൈസ് ചെയ്തു. ഒരു പോസിറ്റീവ് കൺട്രോളിനുള്ള (PC) ഒരു ടെംപ്ലേറ്റായി. ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് PCR (qPCR) ഒരു സ്ട്രാറ്റജീൻ Mx3000P RT-PCR ഉപകരണത്തിൽ ബ്രില്യന്റ് III അൾട്രാ-ഫാസ്റ്റ് SYBR ഗ്രീൻ ക്യുപിസിആർ മാസ്റ്റർ മിക്സ് (എജിലന്റ് ടെക്നോളജീസ്) ഉപയോഗിച്ചാണ് നടത്തിയത്. പ്രതികരണങ്ങൾ മുമ്പത്തേത് പോലെ മൂന്ന് തവണയായി സജ്ജീകരിച്ചു. വിവരിച്ചിരിക്കുന്നു.എല്ലാ സാമ്പിളുകൾക്കും സൈക്കിൾ ത്രെഷോൾഡ് (Ct) രേഖപ്പെടുത്തിയിട്ടുണ്ട്. കൂടാതെ, ഫിൽട്ടർ ചെയ്ത തടാകജലത്തിൽ 1:100 ലയിപ്പിച്ച cDNA ഉപയോഗിച്ച്, നേർപ്പിച്ച സാമ്പിളുകൾ \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) ആയിരുന്നു \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) 35 സൈക്കിളുകൾക്കുള്ള PCR. ഈ സാമ്പിളുകളെ “1:100″ ആയി പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു.
വാണിജ്യപരമായി ലഭ്യമായ കുറഞ്ഞ വിലയുള്ള ഇലക്‌ട്രോലെസ് നിക്കൽ ഇമ്മേഴ്‌ഷൻ ഗോൾഡ് (ENIG) പ്രോസസ്സ് ഉപയോഗിച്ചാണ് PCB ഇലക്‌ട്രോഡുകൾ നിർമ്മിച്ചിരിക്കുന്നത്. പിരാന ലായനിയോ സൾഫ്യൂറിക് ആസിഡ് സൈക്ലിക് വോൾട്ടാമെട്രിയോ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നില്ല, കാരണം അവ നേർത്ത സ്വർണ്ണ പാളി (കനം \(\ഏകദേശം\) \(100\,\hbox {nm }\)) പുറംതൊലിക്ക് കാരണമായേക്കാം, കൂടാതെ അടിവശം ചെമ്പ് പാളികൾ തുറന്നുകാട്ടുന്നു നാശം 21, 22, 23, 24, 25. അതിനാൽ, ഇലക്ട്രോഡുകൾ IPA ഉപയോഗിച്ച് നനച്ച ലിന്റ് രഹിത തുണി ഉപയോഗിച്ച് വൃത്തിയാക്കുക. പരിശോധിക്കേണ്ട സാമ്പിൾ \({50}\,{\upmu \hbox {M} ഉപയോഗിച്ച് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തിട്ടുണ്ട്. }\) MB \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) എളുപ്പത്തിൽ ചേർക്കുന്നതിന്. ഞങ്ങളുടെ മുൻ ജോലിയിൽ , MB കോൺസൺട്രേഷൻ 11 വർദ്ധിപ്പിച്ച് സെൻസറിന്റെ സംവേദനക്ഷമതയും രേഖീയതയും മെച്ചപ്പെടുത്തിയതായി ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു .ഞങ്ങളുടെ മുമ്പത്തെ ജോലിയിൽ റിപ്പോർട്ട് ചെയ്ത ഒപ്റ്റിമൈസേഷനുകളുടെ അടിസ്ഥാനത്തിൽ, ഞങ്ങൾ \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB ഉപയോഗിച്ചു. ഈ പഠനത്തിൽ ഡിഎൻഎ ഉൾച്ചേർക്കുന്നതിനുള്ള ഏകാഗ്രത. ഡബിൾ സ്ട്രാൻഡഡ് ഡിഎൻഎ (ഡിഎസ്-ഡിഎൻഎ) യുടെ ഇലക്ട്രോകെമിക്കൽ കണ്ടെത്തൽ അയോണിക് അല്ലെങ്കിൽ കാറ്റാനിക് ഇന്റർകലേറ്ററുകൾ ഉപയോഗിച്ച് നേടാം. അയോണിക് ഇന്റർകലേറ്ററുകൾ ഡിഎൻഎയെ മികച്ച സെലക്ടിവിറ്റിയോടെ കണ്ടെത്തുന്നുണ്ടെങ്കിലും, അവയ്ക്ക് ഒറ്റരാത്രികൊണ്ട് ഇൻകുബേഷൻ ആവശ്യമാണ്, ഇത് കൂടുതൽ സമയം കണ്ടെത്തുന്നതിന് കാരണമാകുന്നു. മറുവശത്ത്, MB പോലെയുള്ള കാറ്റാനിക് ഇന്റർകലേറ്ററുകൾക്ക് ds-DNA6-ന്റെ ഇലക്ട്രോകെമിക്കൽ കണ്ടുപിടിത്തത്തിന് ഏകദേശം \({1}\,{\hbox {h}}\) കുറഞ്ഞ ഇൻകുബേഷൻ സമയം ആവശ്യമാണ്. ഓരോ അളവിലും പരിശോധിക്കേണ്ട സാമ്പിൾ വിതരണം ചെയ്യുന്നത് ഉൾപ്പെടുന്നു. ഇലക്ട്രോഡ്\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), തുടർന്ന് മറ്റൊരു സാമ്പിളുമായി മുന്നോട്ട് പോകുന്നതിന് മുമ്പ് IPA നനഞ്ഞ തുണി ഉപയോഗിച്ച് വൃത്തിയാക്കുക.ഒരു മെഷർമെന്റ്.പ്രസ്താവിച്ചിട്ടില്ലെങ്കിൽ ഓരോ സാമ്പിളും 5 വ്യത്യസ്ത ഇലക്ട്രോഡുകളിൽ പരീക്ഷിച്ചു.DPV, CV അളവുകൾ ഒരു PalmSens Sensit Smart potentiostat ഉപയോഗിച്ച് നടത്തി, കൂടാതെ PSTrace സോഫ്‌റ്റ്‌വെയർ, potentiostat കോൺഫിഗറേഷനും ഡാറ്റ ഏറ്റെടുക്കലിനും, പീക്ക് കറന്റ് കണക്കുകൂട്ടലുകൾ ഉൾപ്പെടെ. ഇനിപ്പറയുന്ന ക്രമീകരണങ്ങൾ ഉപയോഗിക്കുന്നു. DPV, CV അളവുകൾക്കായി:
DPV: Equilibrium Time = \(8\,\hbox {s}\), Voltage Step = \(3\,\hbox {mV}\), Pulse Voltage = \(25\,\hbox {mV}\) , പൾസ് ദൈർഘ്യം = \(50\,\hbox {ms}\), സ്കാൻ നിരക്ക് = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: സന്തുലിത സമയം = \(8\,\hbox {s}\), വോൾട്ടേജ് ഘട്ടം = \(3\,\hbox {mV}\), സ്വീപ്പ് നിരക്ക് = \({300}\,\hbox {mV/ s }\)
\({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: (എ) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
DPV, CV വോൾട്ടമോഗ്രാമുകൾ ENIG PCB ഇലക്‌ട്രോഡുകളിൽ \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB കോംപ്ലക്സ് ഡിഎൻഎയിൽ (10–\({20}\,{\ hbox {ng എന്ന സാന്ദ്രതയിൽ }/{\upmu \hbox {l}}}\) അതായത് 0.13–\({0.26}\,{\upmu \hbox {M}}\) \(117\,\hbox {bp}\ ) കൂടാതെ 0.03 –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) \(503\,\hbox {bp}\)).പ്രതിനിധി വോൾട്ടമോഗ്രാമുകൾ അനുബന്ധ വിവരങ്ങളിൽ ചിത്രം S1 ൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നു. ചിത്രം 2 ഫലങ്ങൾ കാണിക്കുന്നു. ജെൽ-ശുദ്ധീകരിച്ച PCR ഉൽപ്പന്നങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ചുള്ള DPV, CV അളവുകൾ (പീക്ക് കറന്റ്). CV അളവുകളുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ, DPV അളവുകൾ ഉയർന്ന സെൻസിറ്റിവിറ്റി കാണിക്കുന്നു (ഡിഎൻഎ കോൺസൺട്രേഷന്റെ ഒരു ഫംഗ്ഷൻ എന്ന നിലയിൽ നിലവിലുള്ളത്) കാരണം CV അളവുകളിലെ പശ്ചാത്തല കപ്പാസിറ്റീവ് വൈദ്യുതധാരകൾ ഫാരഡായിക് വൈദ്യുതധാരകളെ മറയ്ക്കുന്നു 26 .ഡാറ്റ ബോക്‌സ്‌പ്ലോട്ടിലെ ഓരോ ബോക്‌സിനും 5 ഇലക്‌ട്രോഡുകളിൽ നിന്നുള്ള അളവുകൾ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു. ഇലക്‌ട്രോഡ്-ടു-ഇലക്‌ട്രോഡ് വ്യത്യാസം മൂലം അളക്കൽ പിശകുകൾ ഒഴിവാക്കാൻ എല്ലാ അളവുകളും ഒരേ ഇലക്‌ട്രോഡുകൾ ഉപയോഗിക്കുന്നു. ഡി.പി.വി.യിലും സി.വിയിലും ഡി.എൻ.എ.യുടെ സാന്ദ്രത കുറഞ്ഞ പീക്ക് കറന്റുകളിൽ വർധിച്ചുവരുന്ന പ്രവണത ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു. , ദൈർഘ്യമേറിയ (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ താരതമ്യം ചെയ്യുമ്പോൾ \(117) ) ശകലം. ഇത് ഞങ്ങളുടെ മുൻ കൃതിയിൽ റിപ്പോർട്ട് ചെയ്ത ഇലക്‌ട്രോഡ് അഡോർപ്‌ഷന്റെ പ്രതീക്ഷിത പ്രവണതയുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു. MB-DNA കോംപ്ലക്‌സിന്റെ ആഗിരണം ഇലക്‌ട്രോഡിലെ ചാർജ് ട്രാൻസ്ഫർ സുഗമമാക്കുന്നു, ഇത് പീക്ക് കറന്റിന്റെ വർദ്ധനവിന് കാരണമാകുന്നു. മറ്റ് പഠനങ്ങൾ MB-DNA ഇന്റർകലേഷനിൽ ഒളിഗോ ന്യൂക്ലിയോടൈഡിന്റെ വലുപ്പവും ക്രമവും കാണിക്കുന്നു. ഗ്വാനിൻ രണ്ട് ആംപ്ലിക്കോണുകളുടെ (\(117\,\hbox {bp}\), \(503\,\hbox {bp}\)) -സൈറ്റോസിൻ (GC) ഉള്ളടക്കം ഏകദേശം 50% ആയിരുന്നു, നിരീക്ഷണം കാരണം വ്യത്യാസമാണെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു. ആംപ്ലിക്കൺ നീളത്തിലേക്ക്. എന്നിരുന്നാലും, ഉയർന്ന ഡിഎൻഎ സാന്ദ്രതയ്ക്ക് (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), \(503\,\hbox {bp} \) കൂടാതെ \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) \(117\,\hbox {bp}\)), ഞങ്ങൾ രണ്ട് ആംപ്ലിഫിക്കേഷനുകൾ നിരീക്ഷിക്കുന്നു DPV, CV അളവുകൾ എന്നിവയിൽ സബ്‌സുകളുടെ പീക്ക് വൈദ്യുതധാരകൾ കുറയുന്നു. ഇതിന് കാരണം MB പൂരിതപ്പെടുത്തുകയും ഡിഎൻഎയുടെ അടിസ്ഥാന ജോഡികൾക്കിടയിൽ ഇടകലരുകയും ചെയ്യുന്നു, ഇത് MB31,32 ലെ കുറയ്ക്കാവുന്ന ഗ്രൂപ്പിന്റെ റെഡോക്സ് പ്രവർത്തനത്തെ സ്റ്റെറിക് ഇൻഹിബിഷനിലേക്ക് നയിക്കുന്നു.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV。
PCR മാസ്റ്റർ മിക്സുകളിൽ അടങ്ങിയിരിക്കുന്ന ലവണങ്ങൾ MB-യും DNA-യും തമ്മിലുള്ള ഇലക്ട്രോസ്റ്റാറ്റിക് ഇടപെടലുകളെ തടസ്സപ്പെടുത്തുന്നു, അതിനാൽ \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) കൂടെ \({50} \,{\) ചേർത്ത് upmu \hbox {M}}\) MB-DNA പ്രതിപ്രവർത്തനത്തിൽ ഉപ്പിന്റെ സ്വാധീനം പഠിക്കാൻ MB ജെൽ-ശുദ്ധീകരിച്ച ഉൽപ്പന്നം. ചിത്രം 3-ൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ, ഉയർന്ന ഡിഎൻഎ സാന്ദ്രത (\(>{2}\,{\) ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) കൂടാതെ \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) \(117\,\hbox {bp} \)), DPV, CV എന്നിവയിൽ ഉപ്പ് ചേർത്തത് അളവുകളെ കാര്യമായി ബാധിച്ചില്ല (പ്രതിനിധി വോൾട്ടമോഗ്രാമുകൾക്കുള്ള അനുബന്ധ വിവരങ്ങളിലെ ചിത്രം S2 കാണുക). എന്നിരുന്നാലും, ഡിഎൻഎ സാന്ദ്രത കുറയുന്നു, ഉപ്പ് ചേർക്കുന്നത് സെൻസിറ്റിവിറ്റി കുറയ്ക്കുന്നു, ഡിഎൻഎ കോൺസൺട്രേഷനുള്ള വൈദ്യുതധാരയിൽ കാര്യമായ മാറ്റമൊന്നും ഉണ്ടാകില്ല. എംബി-ഡിഎൻഎ ഇടപെടലുകളിലും ഇന്റർകലേഷനിലും ഉപ്പിന്റെ സമാനമായ പ്രതികൂല ഫലങ്ങൾ മറ്റ് ഗവേഷകർ മുമ്പ് റിപ്പോർട്ട് ചെയ്തിട്ടുണ്ട്.\(\hbox { Mg}^{2+}\) കാറ്റേഷനുകൾ ഡിഎൻഎയുടെ നെഗറ്റീവ് ഫോസ്ഫേറ്റ് നട്ടെല്ലുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുന്നു, അതുവഴി MB-യും DNA-യും തമ്മിലുള്ള ഇലക്ട്രോസ്റ്റാറ്റിക് പ്രതിപ്രവർത്തനത്തെ തടസ്സപ്പെടുത്തുന്നു. ഉയർന്ന ഡിഎൻഎ സാന്ദ്രതയിൽ, റെഡോക്സ്-ആക്റ്റീവ് MB-കളുടെ സ്റ്റെറിക് ഇൻഹിബിഷൻ കുറഞ്ഞ പീക്ക് വൈദ്യുതധാരകൾക്ക് കാരണമാകുന്നു, അതിനാൽ ഇലക്ട്രോസ്റ്റാറ്റിക് ഇടപെടലുകൾ സെൻസർ പ്രതികരണത്തെ കാര്യമായി ബാധിക്കരുത്. ഉയർന്ന ഡിഎൻഎ സാന്ദ്രത (അപൂർവ്വമായി \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) അല്ലെങ്കിൽ ഉയർന്നത്) കണ്ടെത്താൻ ഈ ബയോസെൻസർ കൂടുതൽ അനുയോജ്യമാണ് എന്നതാണ് പ്രധാന കാര്യം. പൂർണ്ണമായി- പാരിസ്ഥിതിക ജല സാമ്പിളുകളുടെ ഓട്ടോമേറ്റഡ് പ്രോസസ്സിംഗ്, PCR ഉൽപ്പന്നങ്ങളുടെ ജെൽ ശുദ്ധീകരണം സാധ്യമാകില്ല.
\({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB ഉപയോഗിച്ച് സങ്കീർണ്ണമായ ഡിഎൻഎയുടെ വിവിധ സാന്ദ്രതകൾക്കായി 600–700 \(\hbox {nm}\) തരംഗദൈർഘ്യ പരിധിക്കുള്ള ആഗിരണം വക്രത്തിന് കീഴിലുള്ള ഏരിയ: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) ഉപ്പും അല്ലാതെയും (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) ഉപ്പും അല്ലാതെയും (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB സാമ്പിളുകൾക്ക് അനുയോജ്യമായ DNA കോൺസൺട്രേഷനുകൾ DNA ഇല്ല.
മേൽപ്പറഞ്ഞ ഫലങ്ങൾ കൂടുതൽ പരിശോധിക്കുന്നതിന്, UV/Vis സ്പെക്ട്രോഫോട്ടോമീറ്റർ (തെർമോ സയന്റിഫിക് മൾട്ടിസ്കാൻ GO) ഉപയോഗിച്ച് ഞങ്ങൾ ഒപ്റ്റിക്കൽ അളവുകൾ നടത്തി, ഓരോന്നിനും \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) സാമ്പിളുകൾ ഉപയോഗിച്ചു അളക്കൽ.ഡിഎൻഎ സാന്ദ്രത കൂടുന്നതിനനുസരിച്ച് ആഗിരണം സിഗ്നേച്ചർ കുറയുന്നു, തരംഗദൈർഘ്യ പരിധി \(600\,\hbox {nm}\) മുതൽ \(700\,\hbox { വരെ ആഗിരണ വക്രത്തിന് കീഴിലുള്ള പ്രദേശത്തിന്റെ പ്രവണതയിൽ നിന്ന് കാണാൻ കഴിയും. nm}\), ചിത്രം 4-ൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നത് പോലെ (അനുബന്ധ വിവരങ്ങളിൽ ചിത്രം S3-ൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്ന ആഗിരണം സ്പെക്ട്രം). \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox-ൽ താഴെയുള്ള DNA കോൺസൺട്രേഷനുള്ള സാമ്പിളുകൾക്ക് {l}}}\), ഡിഎൻഎ അടങ്ങിയതും എംബി മാത്രമുള്ളതുമായ സാമ്പിളുകൾ (\(503\,\hbox {bp}\) കൂടാതെ \(117\,\hbox {bp}\) തമ്മിൽ എടുക്കുന്നതിൽ കാര്യമായ വ്യത്യാസമില്ല ) നീളമുള്ള ശകലങ്ങൾ), റെഡോക്സ്-ആക്റ്റീവ് MB യുടെ സ്റ്റെറിക് ഇൻഹിബിഷന്റെ അഭാവത്തെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു. ഉയർന്ന ഡിഎൻഎ സാന്ദ്രതയിൽ, ആഗിരണം സിഗ്നലിൽ ക്രമാനുഗതമായ കുറവ് ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിക്കുകയും ഉപ്പിന്റെ സാന്നിധ്യത്തിൽ ആഗിരണം കുറയുന്നത് ശ്രദ്ധിക്കുകയും ചെയ്തു. ഈ ഫലങ്ങൾ തന്മാത്രയ്ക്ക് കാരണമായി. ഡിഎൻഎ ഹൈബ്രിഡുകളിലെ ബേസ് സ്റ്റാക്കിംഗുമായുള്ള ഇടപെടലുകളും സ്റ്റെറിക് ഇൻഹിബിഷനും. \(\pi\)–\(\pi ^*\ എന്നതിലെ കുറഞ്ഞ ഊർജ്ജ നിലകളുമായി ഹൈപ്പോക്രോമാറ്റിസിറ്റിയെ ബന്ധപ്പെടുത്തുന്ന MB-DNA ഇന്റർകലേഷന്റെ സ്പെക്ട്രോസ്കോപ്പിക് പഠനങ്ങളെക്കുറിച്ചുള്ള സാഹിത്യത്തിലെ റിപ്പോർട്ടുകളുമായി ഞങ്ങളുടെ ഫലങ്ങൾ പൊരുത്തപ്പെടുന്നു. 36, 37, 38 ലെയറുകൾ ഇന്റർകലേഷൻ മൂലമുണ്ടാകുന്ന ഇലക്ട്രോണിക് സംക്രമണങ്ങൾ.
അഗറോസ് ജെൽ ഇലക്‌ട്രോഫോറെസിസ് ഓഫ് ഫേജ് ഫൈ6: തടാകജല സാമ്പിളുകളിൽ നിന്നുള്ള പിസിആർ ഉൽപ്പന്നങ്ങൾ \(117\,\hbox {bp}\) കൂടാതെ \(503\,\hbox {bp}\) എം-ഡിഎൻഎ മാർക്കർ;NTC-നോ-ടെംപ്ലേറ്റ് നിയന്ത്രണം, അനുബന്ധ ആംപ്ലിക്കോണുകൾ അടങ്ങിയ പ്രൈമറുകൾ;പിസി പോസിറ്റീവ് നിയന്ത്രണം;1. hbox {bp}\) പാത.
Phi6 phage ഉപയോഗിച്ച് സ്പൈക്ക് ചെയ്ത Powai തടാക ജല സാമ്പിളുകൾ ഉപയോഗിച്ച് സെൻസറിന്റെ പ്രയോജനം ഞങ്ങൾ വിലയിരുത്തി. 15.8–\({19.4}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {) ഫേജ് സ്പൈക്ക് ചെയ്ത ജല സാമ്പിളുകളിൽ നിന്ന് വേർതിരിച്ചെടുത്ത RNA സാന്ദ്രത ml}}\), ശുദ്ധീകരിച്ച ഫേജ് സസ്പെൻഷനുകളിൽ നിന്ന് വേർതിരിച്ചെടുത്തവയിൽ, ഏകദേശം 1 വീണ്ടെടുക്കൽ കാര്യക്ഷമതയോടെ ആർഎൻഎ \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) ആയി കണക്കാക്കപ്പെടുന്നു. %.RNA, cDNA-യിലേക്ക് റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രൈബ് ചെയ്യുകയും PCR, qPCR എന്നിവയ്ക്കുള്ള ടെംപ്ലേറ്റായി ഉപയോഗിക്കുകയും ചെയ്തു. സെൻസർ ഉപയോഗിച്ച് പരിശോധിക്കുന്നതിന് മുമ്പ് ഉൽപ്പന്ന വലുപ്പം അഗറോസ് ജെൽ ഇലക്ട്രോഫോറെസിസ് (ചിത്രം 5) സ്ഥിരീകരിച്ചു. താൽപ്പര്യത്തിന്റെ ആംപ്ലിക്കോണുകൾ പോലെ. qPCR (പട്ടിക 1) സമയത്ത് രേഖപ്പെടുത്തിയ Ct മൂല്യങ്ങൾ, അനുബന്ധ സ്പൈക്ക്ഡ് വാട്ടർ സാമ്പിളുകളിൽ നിന്ന് വേർതിരിച്ചെടുത്ത RNA യുടെ സാന്ദ്രതയുമായി പരസ്പര ബന്ധമുള്ളതായി കാണിക്കുന്നു. Ct മൂല്യം ഫ്ലൂറസെന്റ് സിഗ്നലിന് ആവശ്യമായ സൈക്കിളുകളുടെ എണ്ണം വെളിപ്പെടുത്തുന്നു. പരിധി അല്ലെങ്കിൽ പശ്ചാത്തല സിഗ്നൽ കവിയുന്നു. ഉയർന്ന Ct മൂല്യങ്ങൾ താഴ്ന്ന ടെംപ്ലേറ്റ് സാന്ദ്രതയെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു, തിരിച്ചും. NTC സാമ്പിളുകളുടെ Ct മൂല്യങ്ങൾ പ്രതീക്ഷിച്ചത്ര ഉയർന്നതാണ്. \(\ഏകദേശം 3\) Ct മൂല്യങ്ങൾ തമ്മിലുള്ള വ്യത്യാസം പോസിറ്റീവ് നിയന്ത്രണവും ടെസ്റ്റ് സാമ്പിളും പോസിറ്റീവ് കൺട്രോളുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ ഓരോ ടെസ്റ്റ് സാമ്പിളിനും ഏകദേശം 1% ടെംപ്ലേറ്റ് ഉണ്ടെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു. ദൈർഘ്യമേറിയ ആംപ്ലിക്കോണുകൾ മികച്ച സംവേദനക്ഷമതയിലേക്ക് നയിക്കുമെന്ന് ഞങ്ങൾ മുമ്പ് ചർച്ച ചെയ്തിട്ടുണ്ട്. വൈവിധ്യമാർന്ന പാരിസ്ഥിതിക സാമ്പിളുകളിൽ നിന്ന് വേർതിരിച്ചെടുത്ത നീളമുള്ള ശകലങ്ങൾ വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നത് ദോഷങ്ങൾ കണക്കിലെടുത്ത് വെല്ലുവിളിയാണ്. കുറഞ്ഞ വൈറൽ കോൺസൺട്രേഷനും RNA ഡീഗ്രഡേഷനും. എന്നിരുന്നാലും, ഞങ്ങളുടെ വൈറസ് സമ്പുഷ്ടീകരണവും PCR ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ പ്രോട്ടോക്കോളും ഉപയോഗിച്ച്, ഇലക്ട്രോകെമിക്കൽ സെൻസിംഗിനായി \(503\,\hbox {bp}\) ശകലം വിജയകരമായി വർദ്ധിപ്പിക്കാൻ ഞങ്ങൾക്ക് കഴിഞ്ഞു.
ചിത്രം 6, \(503\,\hbox {bp}\) ഫ്രാഗ്മെന്റ് ആംപ്ലിക്കോണിന്റെ ഇലക്ട്രോകെമിക്കൽ സെൻസർ ഫലങ്ങൾ കാണിക്കുന്നു, ഇവ രണ്ടും ലയിപ്പിക്കാത്ത cDNA ടെംപ്ലേറ്റായും (1:1) ടെംപ്ലേറ്റായും (1:100 ) നടപ്പിലാക്കിയ PCR ആയും ഉപയോഗിക്കുന്നു. , NTC, PC എന്നിവയുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ (പ്രാതിനിധ്യ വോൾട്ടമോഗ്രാമുകൾക്കായുള്ള അനുബന്ധ വിവരങ്ങളിലെ ചിത്രം S4 കാണുക).ചിത്രം 6 ലെ ബോക്‌സ്‌പ്ലോട്ടിലെ ഓരോ ബോക്സിലും 5 ഇലക്‌ട്രോഡുകളിലെ മൂന്ന് സാമ്പിളുകളിൽ നിന്നുള്ള അളവുകൾ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു. ഇലക്‌ട്രോഡ് മൂലമുള്ള പിശകുകൾ ഒഴിവാക്കാൻ എല്ലാ സാമ്പിളുകളും അളക്കാൻ ഇതേ ഇലക്‌ട്രോഡുകൾ ഉപയോഗിച്ചു. - to-electrode variation. CV അളവുകളുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ, DPV അളവുകൾ NTC-കളിൽ നിന്ന് ടെസ്റ്റ്, PC സാമ്പിളുകൾ വേർതിരിച്ചറിയാൻ മികച്ച റെസല്യൂഷൻ കാണിക്കുന്നു, കാരണം മുമ്പ് സൂചിപ്പിച്ചതുപോലെ, Faradaic വൈദ്യുതധാരകൾ രണ്ടാമത്തേതിലെ പശ്ചാത്തല കപ്പാസിറ്റീവ് വൈദ്യുതധാരകൾ കാരണം മറഞ്ഞിരിക്കുന്നു. നെഗറ്റീവ് കൺട്രോൾ (എൻ‌ടി‌സി) പോസിറ്റീവ് കൺട്രോളുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ ഉയർന്ന സിവി, ഡിപിവി പീക്ക് പ്രവാഹങ്ങൾക്ക് കാരണമായി, അതേസമയം പോസിറ്റീവ്, അൺ‌ഡൈലറ്റ് ചെയ്യാത്ത ടെസ്റ്റ് സാമ്പിളുകൾ ഡിപിവി പീക്ക് കറന്റുകളുടെ സമാനമായ പീക്ക് ഉയരങ്ങൾ കാണിച്ചു. ) എൻ‌ടി‌സി സാമ്പിളിനുള്ള സെൻസർ ഔട്ട്‌പുട്ടിൽ നിന്ന് ടെസ്റ്റ് സാമ്പിളും പിസിയും വ്യക്തമായി പരിഹരിക്കാനാകും, അതേസമയം 1:100 നേർപ്പിച്ച സാമ്പിളിന്റെ റെസല്യൂഷൻ വളരെ കുറവാണ്. സിഡിഎൻഎയുടെ 100 മടങ്ങ് നേർപ്പിക്കുന്നതിന്, ജെൽ ഇലക്ട്രോഫോറെസിസ് സമയത്ത് ഞങ്ങൾ ബാൻഡുകളൊന്നും നിരീക്ഷിച്ചില്ല. (ചിത്രം 5-ൽ കാണിച്ചിട്ടില്ലാത്ത പാതകൾ), അനുബന്ധ DPV, CV പീക്ക് വൈദ്യുതധാരകൾ NTC-യിൽ പ്രതീക്ഷിച്ചതിന് സമാനമാണ്. \(117\,\hbox {bp}\) ശകലത്തിന്റെ ഫലങ്ങൾ അനുബന്ധ വിവരങ്ങളിൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നു. നെഗറ്റീവ് ഇലക്‌ട്രോഡിലെ സ്വതന്ത്ര എംബിയുടെ അഡ്‌സോർപ്‌ഷനും സിംഗിൾ സ്‌ട്രാൻഡഡ് പ്രൈമർ ഒലിഗോ ന്യൂക്ലിയോടൈഡുമായുള്ള എംബിയുടെ പ്രതിപ്രവർത്തനവും കാരണം നിയന്ത്രണം പിസിബി സെൻസറിൽ നിന്ന് ഇലക്‌ട്രോകെമിക്കൽ പ്രതികരണത്തിന് കാരണമായി. ടെസ്റ്റ് സാമ്പിളിനെ പോസിറ്റീവ് അല്ലെങ്കിൽ നെഗറ്റീവ് ആയി തരംതിരിക്കുന്നതിന് ഒരു ഡിഫറൻഷ്യൽ (ആപേക്ഷിക) അളവ് നേടുന്നതിന് നെഗറ്റീവ് കൺട്രോൾ വഴി ലഭിച്ച പീക്ക് കറന്റുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ ടെസ്റ്റ് സാമ്പിളിന്റെ പീക്ക് കറന്റ്39,40.
(a) DPV, കൂടാതെ (b) തടാകജല സാമ്പിളുകളിലെ \(503\,\hbox {bp}\) ശകലങ്ങളുടെ ഇലക്ട്രോകെമിക്കൽ കണ്ടുപിടിത്തത്തിനുള്ള CV പീക്ക് കറന്റ്. ടെസ്റ്റ് സാമ്പിളുകൾ മൂന്നിരട്ടിയായി അളന്നു, കൂടാതെ ടെംപ്ലേറ്റ് നിയന്ത്രണങ്ങളില്ലാതെ (NTC) കൂടാതെ പോസിറ്റീവ് നിയന്ത്രണങ്ങൾ (പിസി).
UV/Vis സ്പെക്‌ട്രോഫോട്ടോമീറ്റർ ഉപയോഗിച്ച് ഒപ്റ്റിക്കൽ അളവുകൾ പരിശോധിച്ച് കോൺസൺട്രേഷനുകൾ ഉപയോഗിച്ച് വ്യത്യസ്ത ഡിഎൻഎകൾക്കുള്ള വ്യത്യസ്ത നീളമുള്ള ആംപ്ലിക്കോണുകൾക്കായുള്ള ഇലക്ട്രോകെമിക്കൽ സെൻസറുകളുടെ പ്രകടനത്തെ ബാധിക്കുന്ന വ്യത്യസ്ത സംവിധാനങ്ങളെ ഞങ്ങളുടെ കണ്ടെത്തലുകൾ വ്യക്തമാക്കുന്നു. \(500\,\hbox {bp}\) ഉയർന്ന സെൻസിറ്റിവിറ്റി ഉപയോഗിച്ച് കണ്ടെത്താനാകും, കൂടാതെ സാമ്പിളിലെ ഉപ്പിന്റെ സാന്നിധ്യം ഉയർന്ന സെൻസിറ്റിവിറ്റിയെ ബാധിക്കുന്ന സെൻസിറ്റിവിറ്റി ഡിഎൻഎ കോൺസൺട്രേഷനല്ല (അപൂർവ്വമായി \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) ഉം അതിനുമുകളിലും).കൂടാതെ, ഉപ്പ് ചേർത്തും അല്ലാതെയും ജെൽ-ശുദ്ധീകരിച്ച ആംപ്ലിക്കോണുകൾ, DPV, CV അളവുകളിൽ തടാകജല സാമ്പിളുകൾ ചേർക്കൽ എന്നിവ ഉൾപ്പെടെ വിവിധ തരത്തിലുള്ള സാമ്പിളുകളുടെ ഫലത്തെക്കുറിച്ച് ഞങ്ങൾ അന്വേഷിച്ചു.പശ്ചാത്തല കപ്പാസിറ്റീവ് കറന്റ് സിവി അളവിനെ ബാധിക്കുന്നതിനാൽ ഡിപിവി മികച്ച റെസല്യൂഷൻ നൽകുന്നതായി ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു, ഇത് സെൻസിറ്റീവ് കുറയ്ക്കുന്നു.
ദൈർഘ്യമേറിയ ശകലങ്ങളുടെ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ വൈറൽ ജീനോമിക് ആർഎൻഎയുടെ സമഗ്രതയെ ആശ്രയിച്ചിരിക്കുന്നു. പരിസ്ഥിതിയിലെ ആർഎൻഎയുടെ അപചയവും ഒറ്റപ്പെടൽ സമയത്ത് പിളരാനുള്ള സാധ്യതയും കാരണം നീളമുള്ള ശകലങ്ങളുടെ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ എല്ലായ്പ്പോഴും കാര്യക്ഷമമല്ലെന്ന് നിരവധി പഠനങ്ങൾ തെളിയിച്ചിട്ടുണ്ട്. .അലൂമിനിയം ഹൈഡ്രോക്സൈഡ് അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള വൈറസ് കോൺസൺട്രേഷൻ രീതിയേക്കാൾ, തടാകജല സാമ്പിളുകളിൽ ഫേജ് ഫൈ-6 കേന്ദ്രീകരിക്കുന്നതിൽ PEG അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള വൈറസ് കോൺസൺട്രേഷൻ രീതി കൂടുതൽ ഫലപ്രദമാണെന്ന് ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു. നീളമുള്ള DNA ശകലങ്ങൾ കണ്ടെത്താനുള്ള കഴിവ് മൾട്ടിപ്ലക്‌സ് PCR-ന്റെ ആവശ്യകതയെ മറികടക്കാൻ തെളിയിച്ചു. ഒന്നിലധികം നീളം കുറഞ്ഞ ടെംപ്ലേറ്റുകൾ വർദ്ധിപ്പിക്കാനും ക്രോസ്-സ്പെസിഫിസിറ്റിയുടെ സാധ്യത കുറയ്ക്കാനും.
ബയോളജിക്കൽ സാമ്പിളുകൾ വിരളമാണ്, അതിനാൽ പരിശോധനയ്ക്കായി ചുരുങ്ങിയ സാമ്പിളുകൾ ആവശ്യമുള്ള ഒരു ബയോസെൻസർ രൂപകൽപ്പന ചെയ്യേണ്ടത് ആവശ്യമാണ്. ഈ പഠനത്തിൽ ഉപയോഗിച്ചിരിക്കുന്ന ENIG PCB ഇലക്ട്രോഡുകൾക്ക് \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ മാത്രമേ ആവശ്യമുള്ളൂ. ) ഇലക്ട്രോഡുകളുടെ ഫലപ്രദമായ വിസ്തീർണ്ണം കവർ ചെയ്യുന്നതിനുള്ള സാമ്പിളുകൾ. കൂടാതെ, അടുത്ത സാമ്പിൾ വിതരണം ചെയ്യുന്നതിനുമുമ്പ് അതേ ഇലക്ട്രോഡ് വൃത്തിയാക്കിയ ശേഷം വീണ്ടും ഉപയോഗിക്കാം. ആംപ്ലിഫൈഡ് സാമ്പിളുകൾക്ക് മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ ഒഴികെയുള്ള രാസവസ്തുക്കൾ ചേർക്കേണ്ടതില്ല, ഇത് വിലകുറഞ്ഞതാണ്. സാധാരണയായി ഉപയോഗിക്കുന്ന രാസവസ്തുവാണ്. ഓരോ ഇലക്‌ട്രോഡിനും നിർമ്മാണത്തിന് ഏകദേശം $0.55 (അല്ലെങ്കിൽ INR 40) ചിലവ് വരുന്നതിനാൽ, ഈ ബയോസെൻസർ നിലവിലുള്ള കണ്ടെത്തൽ സാങ്കേതികവിദ്യകൾക്ക് ഒരു ചെലവ് കുറഞ്ഞ ബദലായിരിക്കും വൈവിധ്യമാർന്ന സാമ്പിളുകളിലെ ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങൾ.
MB-അടിസ്ഥാനത്തിലുള്ള ഇലക്ട്രോകെമിക്കൽ ഡിറ്റക്ഷൻ പ്രോട്ടോക്കോളുകൾ PCR-ന്റെ പ്രത്യേകതയെ ആശ്രയിക്കുന്നതിനാൽ, ഈ രീതിയുടെ ഒരു പ്രധാന പരിമിതി മലിനജലം, തടാകജലം എന്നിങ്ങനെയുള്ള വൈവിധ്യമാർന്ന സാമ്പിളുകളിൽ നിർദിഷ്ടമല്ലാത്ത ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ അല്ലെങ്കിൽ കുറഞ്ഞ ശുദ്ധിയുള്ള പ്രൈമറുകൾ ഉപയോഗിക്കുന്നതിനുള്ള സാധ്യതയാണ്. പരിഷ്‌ക്കരിക്കാത്ത ENIG PCB ഇലക്‌ട്രോഡുകൾ ഉപയോഗിച്ച് ശുദ്ധീകരിക്കാത്ത PCR ഉൽപ്പന്നങ്ങൾ ഡിഎൻഎ കണ്ടുപിടിക്കുന്നതിനുള്ള ഇലക്‌ട്രോകെമിക്കൽ ഡിറ്റക്ഷൻ രീതികൾ, ഉപയോഗിക്കാത്ത dNTP-കളും പ്രൈമറുകളും അവതരിപ്പിക്കുന്ന പിശകുകൾ നന്നായി മനസ്സിലാക്കുകയും പ്രതികരണ സാഹചര്യങ്ങളും വിശകലന പ്രോട്ടോക്കോളുകളും ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്യുകയും വേണം. pH, താപനില, ബയോളജിക്കൽ പാരാമീറ്ററുകൾ അളവിന്റെ കൃത്യത മെച്ചപ്പെടുത്തുന്നതിന് ജല സാമ്പിളിന്റെ ഓക്സിജൻ ഡിമാൻഡ് (BOD) അളക്കേണ്ടതും ആവശ്യമായി വന്നേക്കാം.
ഉപസംഹാരമായി, പാരിസ്ഥിതിക (തടാക ജലം) സാമ്പിളുകളിൽ വൈറസ് കണ്ടെത്തുന്നതിന് വില കുറഞ്ഞ ഇലക്ട്രോകെമിക്കൽ ENIG PCB സെൻസർ ഞങ്ങൾ നിർദ്ദേശിക്കുന്നു. സംവേദനക്ഷമത നിലനിർത്താൻ ക്രയോജനിക് സംഭരണം ആവശ്യമായ ഡിഎൻഎ സെൻസിംഗിനുള്ള ഇമോബിലൈസ്ഡ് ഒലിഗോ ന്യൂക്ലിയോടൈഡ് ഇലക്ട്രോഡുകളോ കസ്റ്റം സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റുകളോ പോലെയല്ല, 53,54 പരിഷ്‌ക്കരിക്കാത്ത പിസിബിയാണ് ഞങ്ങളുടെ സാങ്കേതികത ഉപയോഗിക്കുന്നത്. ദീർഘായുസ്സുള്ള ഇലക്‌ട്രോഡുകൾ, പ്രത്യേക സ്റ്റോറേജ് ആവശ്യകതകളൊന്നുമില്ല, അതിനാൽ എൽഎംഐസികളിൽ വിന്യസിച്ചിരിക്കുന്ന ഓട്ടോമേറ്റഡ് സാമ്പിൾ പ്രോസസ്സിംഗ് ഉള്ള മെഷർമെന്റ് സൊല്യൂഷനുകൾ വികസിപ്പിക്കുന്നതിന് അനുയോജ്യമാണ്. ടാർഗെറ്റ് ആംപ്ലിക്കോണുകൾ ദ്രുതഗതിയിൽ കണ്ടെത്തുന്നതിന് ബയോസെൻസർ വിലകുറഞ്ഞ ഡിഎൻഎ-ഇന്റർകലേറ്റിംഗ് റെഡോക്സ് ഡൈകൾ (എംബി) ഉപയോഗിക്കുന്നു. പാരിസ്ഥിതിക സാമ്പിളുകളിൽ സാധാരണമായത്, സിംഗിൾ, ഡബിൾ സ്ട്രാൻഡഡ് ഒലിഗോ ന്യൂക്ലിയോടൈഡുകളുമായി MB-കളുടെ നിർദിഷ്ട ബന്ധനം കാരണം ഈ സെൻസിംഗ് രീതിയുടെ പ്രത്യേകത കുറയ്ക്കുന്നു. അതിനാൽ, ഈ പരിശോധനയുടെ പ്രത്യേകത പ്രൈമറുകളുടെയും PCR പ്രതികരണ സാഹചര്യങ്ങളുടെയും ഒപ്റ്റിമൈസേഷനെ ആശ്രയിച്ചിരിക്കുന്നു. കൂടാതെ, CV കൂടാതെ പരീക്ഷിച്ച സാമ്പിളുകളിൽ നിന്ന് ലഭിച്ച DPV പീക്ക് വൈദ്യുതധാരകൾ ഓരോ ടെസ്റ്റിനും നെഗറ്റീവ് കൺട്രോൾ (NTC) ൽ നിന്ന് ലഭിച്ച പ്രതികരണങ്ങളുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തണം. സാമ്പിളുകൾ ശേഖരിക്കാനും വിശകലനം ചെയ്യാനും വയർലെസ് ആയി ലബോറട്ടറിയിലേക്ക് ഫലങ്ങൾ കൈമാറാനും കഴിയുന്ന ചെലവ് പരിഹാരം.
Cashdollar, J. & Wymer, L. ജല സാമ്പിളുകളിൽ നിന്നുള്ള വൈറസുകളുടെ പ്രാരംഭ കേന്ദ്രീകരണത്തിനുള്ള രീതികൾ: സമീപകാല പഠനങ്ങളുടെ അവലോകനവും മെറ്റാ-വിശകലനവും.Application.microorganism.115, pp. 1-11 (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL വാട്ടർബോൺ വൈറസുകൾ: സുരക്ഷിതമായ കുടിവെള്ളത്തിനുള്ള തടസ്സങ്ങൾ. PLoS രോഗാണുക്കൾ.11, E1004867 (2015).
ശ്രേഷ്ഠ, എസ്. et al. താഴ്ന്ന, ഇടത്തരം വരുമാനമുള്ള രാജ്യങ്ങളിൽ COVID-19-ന്റെ ചെലവ് കുറഞ്ഞ വലിയ തോതിലുള്ള നിരീക്ഷണത്തിനുള്ള മലിനജല പകർച്ചവ്യാധി: വെല്ലുവിളികളും അവസരങ്ങളും. വാട്ടർ 13, 2897 (2021).
പലെസെക്, ഇ. & ബാർട്ടോസിക്, എം. ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് ഇലക്ട്രോകെമിസ്ട്രി.കെമിക്കൽ. റവ.112, 3427–3481 (2012).
ടാനി, എ., തോംസൺ, എജെ & ബട്ട്, ജെഎൻ മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ, സ്വർണ്ണ സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റുകളിൽ ഇമോബിലൈസ് ചെയ്‌ത സിംഗിൾ, ഡബിൾ സ്‌ട്രാൻഡഡ് ഒലിഗോ ന്യൂക്ലിയോടൈഡുകളുടെ ഇലക്‌ട്രോകെമിക്കൽ ഡിസ്‌ക്രിമിനേറ്ററായി. അനലിസ്റ്റ് 126, 1756–1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ താരതമ്യപ്പെടുത്തൽ കാറ്റേഷന്റെയും അയോൺ ഇന്റർകലേറ്ററുകളുടെയും ഡിഎൻഎ ഹൈബ്രിഡൈസേഷന്റെ ഇലക്ട്രോകെമിക്കൽ ട്രാൻസ്‌ഡക്ഷൻ ലോംഗ് റേഞ്ച് ഇലക്ട്രോൺ ട്രാൻസ്ഫർ വഴി.Electrochemistry.comminicate.6, 648–654 (2004).
Wong, EL & Gooding, JJ ചാർജ് ട്രാൻസ്ഫർ ഡിഎൻഎ: ഒരു സെലക്ടീവ് ഇലക്ട്രോകെമിക്കൽ DNA biosensor.anus.Chemical.78, 2138–2144 (2006).
ഫാങ്, TH et al.കൺകറന്റ് ഇലക്ട്രോകെമിക്കൽ ഡിറ്റക്ഷൻ ഉള്ള തത്സമയ PCR മൈക്രോഫ്ലൂയിഡിക് ഉപകരണം.ബയോളജിക്കൽ സെൻസർ.Bioelectronics.24, 2131-2136 (2009).
Win, BY et al. ഡിഎൻഎയുമായുള്ള മെത്തിലീൻ നീലയുടെ പ്രതിപ്രവർത്തനത്തെ അടിസ്ഥാനമാക്കി ഇലക്ട്രോകെമിക്കൽ തൽസമയ PCR സിസ്റ്റത്തിന്റെ സിഗ്നലിംഗ് മെക്കാനിസം പഠനവും പ്രകടന പരിശോധനയും. അനലിസ്റ്റ് 136, 1573–1579 (2011).
Ramirez-Chavarria, RG et al. മലിനജല സാമ്പിളുകളിൽ സാർസ്-കോവ്-2 കണ്ടെത്തുന്നതിനുള്ള ലൂപ്പ്-മെഡിയേറ്റഡ് ഐസോതെർമൽ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള ഇലക്ട്രോകെമിക്കൽ സെൻസർ. ജെ.പരിസ്ഥിതി.കെമിക്കൽ.ബ്രിട്ടൻ.10, 107488 (2022).
കുമാർ, എം. തുടങ്ങിയവർ. പിസിബി ഇലക്‌ട്രോഡുകളുള്ള SARS-CoV-2 ആംപ്ലിക്കോണുകളുടെ ഇലക്‌ട്രോകെമിക്കൽ സെൻസിംഗ്. സെൻസർ സജീവമാക്കി.B Chemistry.343, 130169 (2021).
കിതമുറ, കെ., സദാമസു, കെ., മുറമത്സു, എം. & യോഷിദ, എച്ച്. മലിനജലത്തിന്റെ സോളിഡ് ഫ്രാക്ഷനിൽ SARS-CoV-2 RNA.
Alygizakis, N. et al. മലിനജലത്തിൽ SARS-CoV-2 കണ്ടെത്തലിനുള്ള അനലിറ്റിക്കൽ രീതികൾ: പ്രോട്ടോക്കോളും ഭാവി കാഴ്ചപ്പാടുകളും.TraC ട്രെൻഡിംഗ് അനൽ.കെമിക്കൽ.134, 116125 (2020).
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. & Kashtan, N. സ്ഫടിക പ്രതലങ്ങളിൽ നിക്ഷേപിച്ച ബാഷ്പീകരിക്കപ്പെട്ട ഉമിനീർ തുള്ളികളിൽ പൊതിഞ്ഞ ബാക്ടീരിയോഫേജിന്റെ Phi6 (SARS-CoV-2 ന്റെ സറോഗേറ്റ്) അതിജീവനം.science.Rep.10, 1–10 (2020).
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ സ്വതന്ത്ര-ജീവിക്കുന്ന അമീബയിൽ SARS-CoV-2 സറോഗേറ്റിന്റെ (Phi6) പരിസ്ഥിതി പെർസിസ്റ്റൻസ്.J.വാട്ടർ ഹെൽത്ത് 20, 83 (2021).
മിൻഡിച്ച്, എൽ. ഇരട്ട സ്ട്രോണ്ടഡ് RNA ബാക്ടീരിയോഫേജിന്റെ മൂന്ന് ജനിതക ശകലങ്ങളുടെ കൃത്യമായ പാക്കേജിംഗ്\(\varphi\)6.microorganism.Moore.biology.Rev.63, 149-160 (1999).
Pirttimaa, MJ & Bamford, DH RNA phage\(\varphi\)6 പാക്കേജിംഗ് മേഖലയുടെ ദ്വിതീയ ഘടന.RNA 6, 880–889 (2000).
Bonilla, N. et al.Phages on the Tap - ബാക്ടീരിയോഫേജുകളുടെ ലബോറട്ടറി സ്റ്റോക്കുകൾ തയ്യാറാക്കുന്നതിനുള്ള വേഗതയേറിയതും കാര്യക്ഷമവുമായ പ്രോട്ടോക്കോൾ.PeerJ 4, e2261 (2016).