Tapadh leibh airson tadhal air Nature.com.Chan eil mòran taic aig an tionndadh brobhsair a tha thu a’ cleachdadh airson CSS. Airson an eòlas as fheàrr, tha sinn a’ moladh gun cleachd thu brobhsair ùraichte (no cuir dheth modh co-chòrdalachd ann an Internet Explorer). San eadar-ama, gus dèanamh cinnteach taic leantainneach, seallaidh sinn an làrach gun stoidhlichean agus JavaScript.
Thathas air a bhith a’ cur luach mòr air cho cudromach sa tha e sùil a chumail air sampallan àrainneachd bho thòisich an galar lèir-sgaoilte COVID-19, agus thathas a’ dèanamh cuid de dh’ oidhirpean sgrùdaidh a’ cleachdadh an inbhe òir, ged a tha dòighean stèidhichte air qPCR daor. Anns an obair seo, bidh sinn a’ sealltainn lorg electrochemical de amplicons a fhuaireadh bho Phi6 phage air an dealachadh bho shampaill uisge locha spìceach (ionad-ionaid mòr-chòrdte airson SARS-CoV-2), a’ cleachdadh ENIG gus crìoch a chur air PCB electrodes gun atharrachadh uachdar.sex.Bha am freagairt mothachaidh electroceimiceach air a chomharrachadh gu mionaideach airson dà chriomag DNA de dhiofar fhaid (\({117}\,\hbox {bp}\) agus \({503}\,\hbox {bp}\)), agus an Tha na toraidhean againn a’ sealltainn gu bheil fad mìrean DNA gu mòr a’ dearbhadh cugallachd electroceimiceach agus a’ sealltainn san obair seo gu bheil an comas lorg amplicons fada às aonais glanadh gel de thoraidhean PCR cudromach airson sampallan uisge a thomhas in situ.Tha fuasgladh làn fèin-ghluasadach airson luchdan viral a ’dol gu math.
Tha sgaoileadh bhìoras uisge-ghiùlain air a bhith aithnichte mar chunnart slàinte poblach bho na 1940n, leis a’ chiad fhianais air sgaoileadh polio agus hepatitis E1 le uisge. Tha dòighean lorgaidh an urra ri dòighean-obrach stèidhichte air qPCR aig ìre òir, a tha gu math mothachail agus sònraichte, ach a dh’ fheumas luchd-obrach sgileil deuchainn a dhèanamh san obair-lann a’ cleachdadh ionnstramaidean daor. Mar sin, tha feum air dòighean cosgais ìosal eile airson sgrùdadh seasmhach, fìor-ùine air sampallan uisge is uisge caithte ann an dùthchannan le teachd-a-steach ìosal agus meadhanach mar rabhaidhean tràth mu bhriseadh a-mach galair, mar sin gan dìon bho dhroch bhuaidhean sòisio-eaconamach galar lèir-sgaoilte a’ bhìoras.Dh’ fhaodadh biosensors electroceimiceach cosgais-ìosal airson searbhagan niuclasach fuasgladh gealltanach a thoirt don fheum nach deach a choileanadh. Faodar an uair sin a thionndadh gu bhith na chomharradh le diofar dhòighean electroceimiceach a’ cleachdadh eadar-mheadhanairean redox leithid iarann potaisium / ferrocyanide.Methylene blue (MB) aon mholacile redox-active mar sin, aig a bheil air aithris gu bheil iad eadar-fhighte a-steach do DNA dà-shreath (dsDNA) a bharrachd air a cheangal nas neo-shònraichte ri DNA5,6 aon-shreath. rèiteachaidhean mothachaidh5,6,7,8,9.Ged a tha eadar-cheangal MB gu DNA neo-shònraichte, agus gu bheil sònrachas an sensor electrochemical seo gu mòr an urra ri purrachd nan primers a thathar a’ cleachdadh airson PCR no leudachadh isothermal, tha e gu math freagarrach airson a bhith a’ buileachadh fìor -time stèidhichte air electrochemical qPCR no fluorescence isothermal leudachadh mar dhòigh eile air DNA dùmhlachd tomhais 9 .In aon leithid buileachadh, Won et al.The uachdar electrodes òir atharrachadh le 6-mercapto-1-hexanol (MCH) airson fìor-ùine tomhas amplicons PCR le MB a’ cleachdadh voltammetry cuisle eadar-dhealaichte (DPV)9. air a chleachdadh mar electrodes in situ ann an àrd-ùrlar PCR microfluidic a chaidh a dhealbhadh gus amplicons a lorg gu electrochemically rè ath-bheachdan 8 . Feumaidh na sgrùdaidhean sin uile atharrachadh uachdar air na dealanan, a’ ciallachadh barrachd cinneasachadh agus cosgaisean obrachaidh mar thoradh air riatanasan stòraidh sònraichte airson seasmhachd nan electrodan gnìomh sin.
Sgeama an t-sruth-obrach airson lorg electrochemical de amplicons a gheibhear bho ghràinean viral dùmhail ann an sampallan uisge locha.
O chionn ghoirid sheall sinn mothachadh electroceimiceach de amplicons SARS-CoV-2 le dealanan bòrd cuairteachaidh clò-bhuailte (PCB) aig prìs ìosal stèidhichte air DPV agus voltammetry cearcallach (CV) air adhbhrachadh le bhith a’ sùghadh toinntean MB-DNA air uachdar electrodes gun atharrachadh) atharrachaidhean ann an stùc. gnàthach11.Tha sinn ag aithris gun do nochd mìrean DNA nas fhaide (N1-N2, \({943}\, \hbox) a chaidh a chruthachadh a’ cleachdadh na primers N1 air adhart a chaidh a mholadh le CDC agus N2 air ais an coimeas ri mìrean nas giorra {bp}\)) sreathachd nas fheàrr ann am freagairt an sensor (N1, \(72\,\hbox {bp}\)) air a chruthachadh le bhith a' cleachdadh N1 air adhart agus N1 seataichean primer cùil. -2 amplicons ann an sampallan uisge caithte (air fhaighinn le bhith a’ spùtadh sampallan RNA iomlan le SARS-CoV-2 RNA). Leis gu bheil RNA buailteach a bhith air a rùsgadh aig àm aonaranachd agus giollachd sìos an abhainn,12,13 tha e duilich criomagan nas fhaide a mheudachadh leis an sampall ioma-ghnèitheach seo. Mar sin, tha an taisbeanadh de mhothachadh electrochemical de SARS-CoV-2 amplicon ann an uisge sgudail cuingealaichte ris a’ chriomag N1 as giorra \ (72 \, \ hbox {bp} \).
Anns an obair seo, rinn sinn sgrùdadh air comasachd mothachadh electrochemical stèidhichte air ENIG PCB de phage Phi6 dlùth agus iomallach bho shamhlaichean uisge lochan (Fig. 1). tha membran lipid agus pròtain spìc aca cuideachd. PCR gus dà chriomag DNA fhaighinn de phaidhrichean bonn 117 agus 503 de dh'fhaid. Leis an dùbhlan a bhith ag àrdachadh \(943\,\hbox {bp}\) Mìrean N1-N2 san obair a rinn sinn roimhe, bidh sinn ag amas air pìosan de dh'fhaid eadar-mheadhanach (\(117). \, \hbox {bp}\) agus \(503 \,\hbox {bp}\)), stèidhichte air na primers a tha rim faighinn. \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) gu \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu\hbox {l}}}\)) Airson an dà chriomag ann an làthaireachd MB, tha buaidh salainn air freagairt an sensor air a chomharrachadh agus air a thar-dhearbhadh le tomhasan speactrophotometric. Tha prìomh thabhartasan na h-obrach seo mar a leanas:
Tha fad pìos DNA agus làthaireachd salainn san sampall a’ toirt buaidh làidir air cugallachd.Tha na co-dhùnaidhean againn a’ sealltainn gu bheil gnìomhachd electroceimiceach an urra ri diofar dhòighean air eadar-obrachadh MB, DNA, agus an sensor anns an fhreagairt voltammetric, a rèir dùmhlachd DNA agus fad, le pìosan nas fhaide a’ nochdadh cugallachd nas àirde, ged a tha droch bhuaidh aig salann air eadar-obrachadh electrostatach eadar MB agus DNA.
Bidh dùmhlachd DNA a’ dearbhadh uidheamachd eadar-obrachaidh MB-DNA ann an electrodan gun atharrachadh Bidh sinn a’ sealltainn gu bheil diofar dhòighean eadar-obrachaidh MB-DNA an urra ri dùmhlachd DNA. {l}}}\), chunnaic sinn gun robh am freagairt gnàthach electrochemical air a dhearbhadh sa mhòr-chuid le bhith a’ sùghadh MB-DNA air an electrod, agus aig co-chruinneachaidhean nas ìsle Aig co-chruinneachaidhean DNA àrd, chaidh am freagairt gnàthach electrochemical a dhearbhadh le casg steric redox gnìomhachd mar thoradh air cuir a-steach MB eadar paidhrichean bonn DNA.
Mothachadh electroceimiceach ENIG PCB-stèidhichte air searbhagan niuclasach bhìorasach ann an sampallan uisge locha Chaidh na beachdan a dhearbhadh le lorg electroceimiceach de mhìrean DNA a chaidh a chur ris Phi6 \(503\,\hbox {bp}\) a fhuaireadh bho shamhlaichean uisge bho Powai Lake, Campas Mumbai IIT Toradh phage.
Cosgais buileachaidh ìosal agus comas airson amalachadh a-steach do shiostaman sgrùdaidh làn fèin-ghluasadach, oligonucleotides no aptamers air dealanan le beatha sgeilp nas fhaide.
Tha Phage Phi6 na bhìoras dsRNA còmhdaichte den teaghlach Cytoviridae a tha a’ toirt buaidh air Pseudomonas syringae. \, \hbox {Kb} \)) agus L (\ (6.37 \ , \ hbox{Kb} \)) 16,17. Leis gu bheil am phage Phi6 a’ toirt buaidh air strain neo-pathogenic BSL-1 Pseudomonas, tha e sàbhailte a chleachdadh agus faodar fàs gu furasta anns an obair-lann.Phage Phi6 agus an aoigh Pseudomonas syringae a cheannach bho Ionad Iomraidh Felix d’Herelle airson Bhìorasan Bacterial, Oilthigh Laval, Canada (tha àireamhan catalog an ionaid iomraidh HER-102 agus HER-1102, fa leth) Chaidh .Phi6 phage agus an òstair aige ath-bheothachadh mar a chaidh a stiùireadh leis an ionad iomraidh.Phage Phi6 air a ghlanadh le lysis truinnsear agus elution gus titers deireannach fhaighinn le \(\ mu 10 ^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { ml}}\) (aonadan cruth-clàr / milliliters). Chaidh RNA a sgaradh bho ghràinean phage fìor-ghlan a’ cleachdadh an Kit Purification RNA Iomlan Uile-choitcheann GenElute (Sigma-Aldrich) a rèir stiùireadh an neach-dèanamh. Chaidh 100}\,{{\upmu\hbox {l}}}\) a shìneadh agus chaidh an lysate a luchdachadh air colbh snìomh gus leigeil le RNA ceangal a dhèanamh ris a' cholbh roisinn. 50}\,{{\upmu\hbox {l}}}\) a sholar leis a' phiseag.Thoir tuairmse air an ìre de RNA le sùghadh aig \(260\,\hbox {nm}\). Chaidh RNA a stòradh ann an aliquots ann an \(260\,\hbox {nm}\). ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) gus an tèid a chleachdadh a bharrachd.\({2}\,{\upmu\hbox {g}}\) An iScript cDNA Synthesis Kit (Bio -Rad Laboratories) air a chleachdadh mar theamplaid airson cDNA synthesis a’ leantainn stiùireadh an neach-dèanamh. ) \({5}\,{\hbox {min}}\) , ath-sgrìobhadh air ais de \({20}\,{\hbox {min}}\) aig \({46}\,{^{\circ }\hbox {C}}\), agus cùl Tha an clàr-chlàraidh ann an \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) airson \({1}\,{\hbox {min) }}\). Nuair a chaidh a ruith air gel agarose 1%, sheall an cDNA trì bannan a bha co-chosmhail ris na trì pìosan RNA ris an robh dùil (dàta nach deach a shealltainn). a’ cleachdadh cDNA mar theamplaid airson PCR ann an cearcall teirmeach miniPCR® mini8:
Tha na primers airson \(117\,\hbox {bp}\) agus \(503\,\hbox {bp}\) a’ freagairt ri 1476-1575 nucleotides den roinn M agus 458-943 nucleotides den roinn L, searbhagach fa leth. .Chaidh a h-uile toradh PCR meudaichte a electrophoresed air gels agarose 1%, agus chaidh DNA targaid meudaichte a ghlanadh le bhith a’ cleachdadh an GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Fisher Scientific).
Chaidh loch aig àrainn IIT Mumbai (Loch Powai, Powai, Mumbai) a chleachdadh gus gràineanan phage a chur ris. mìrean crochte, agus an uairsin chaidh Phi6 phage a chur ris.Cuir \({1}\,{\hbox {ml}}\) à \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} \) gu \({100}\ ,{\hbox {ml}}\) sìoladh uisge an locha, ann an \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\).Bha aliquot beag glèidhte airson tomhas luchdan viral le measadh plac.Rinn sinn deuchainn air dà dhòigh eadar-dhealaichte gus mìrean bhìoras Phi6 spìceach a chuimseachadh: (1) an dòigh sùghaidh alùmanum hydroxide-sileadh,19 a chaidh a dhearbhadh airson grunn bhìorasan RNA còmhdaichte bho shampall àrainneachd, agus (2) ) Chaidh an dòigh dùmhlachd bhìoras stèidhichte air polyethylene glycol (PEG) atharrachadh bho Flood et al.20 . Leis gun deach èifeachdas ath-bheothachaidh an dòigh stèidhichte air PEG a lorg nas fheàrr na an dòigh alùmanum hydroxide, chaidh an dòigh stèidhichte air PEG a chleachdadh gus mìrean Phi6 a chruinneachadh bho shamhlaichean uisge locha.
B’ e an dòigh PEG a chaidh a chleachdadh mar a leanas: chaidh PEG 8000 agus \(\ hbox {NaCl} \) a chur ri sampallan uisge locha le spìc Phi6 gus 8 % PEG 8000 agus \(0.2 \, \ hbox {M} \) \( \hbox {NaCl}\).Chaidh sampaill a ghluasad air crathadh\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), an uairsin air a mheadhanachadh aig \(4700 \,\hbox {g}\) is \({45}\,{\hbox {min}}\).Tilg air falbh an supernatant agus ath-thòisich am pellet ann an \({1}\, {\hbox {ml}}\) anns an aon supernatant.Chaidh a h-uile deuchainn snìomh agus cruinneachaidh bhìoras a dhèanamh ann an trì-fhillte. Às deidh dùmhlachd, chaidh aliquot beag a ghleidheadh airson èifeachdas ath-bheothachaidh a thomhas le plac assay.RNA a sgaradh mar a chaidh a mhìneachadh roimhe agus chaidh a lughdachadh ann am bufair elution air a sholarachadh le kit\({40}\,{\upmu\hbox {l}}\). Leis gum bi an dùmhlachd RNA eadar-dhealaichte bho shampall gu sampall trì-fhillte, bidh an \({2}\,{\upmu\) hbox {l}}\) de RNA air a chleachdadh airson na trì ge bith dè an ìre de cDNA a th’ ann synthesis de shamhlaichean.Chaidh synthesis cDNA a dhèanamh mar a chaidh a mhìneachadh roimhe.\({1}\,{\upmu\hbox {l}}\) cDNA chaidh a chleachdadh mar theamplaid airson \({20}\,{\upmu\hbox {l}}\) PCR airson 35 cearcallan airson leudachadh air \(117\,\hbox {bp}\) agus \(503\,\hbox { bp}\) criomagan.Tha na sampallan seo air an riochdachadh mar “1: 1″, ie gun lagachadh. mar theamplaid airson smachd adhartach (PC). air a mhìneachadh.Chaidh stairsneach a’ chearcall (Ct) a chlàradh airson a h-uile sampall. A bharrachd air an sin, chaidh na sampallan caolaichte \({1}\,{\upmu\hbox {l}}\) a’ cleachdadh cDNA air a lagachadh 1:100 ann an uisge locha sìolaidh mar \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR airson 35 cearcallan. Tha na sampallan seo air an riochdachadh mar “1:100”.
Tha na dealanan PCB air an dèanamh le bhith a’ cleachdadh pròiseas Electroless Nickel Immersion Gold (ENIG) aig prìs ìosal gun fheum air plating òir a bharrachd. Chan eilear a’ moladh fuasgladh piranha no voltammetry cearcallach searbhag sulfuric oir dh’ fhaodadh iad a bhith ag adhbhrachadh feannadh an t-sreath òir tana (tiugh \ (\ approx \) \ (100 \, \ hbox {nm } \)) agus a’ nochdadh na sreathan copair bunaiteach a tha buailteach. gu corrachadh 21, 22, 23, 24, 25.Mar sin, glan na h-eleactrothan le clò gun lint air a ghluasad le IPA. }\) MB ann an \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({1}\,{\hbox {h}}\) airson a chuir a-steach gu furasta.Anns an obair a rinn sinn roimhe , thug sinn an aire gun deach cugallachd agus sreathachd an mothachaidh a leasachadh le bhith a’ meudachadh dùmhlachd MB 11 . Faodar lorg electroceimiceach de DNA dà-shreath (ds-DNA) a choileanadh le bhith a’ cleachdadh intercalators anionic no cationic. air an làimh eile, feumaidh eadar-cheanglaichean cationic leithid MB amannan brosnachaidh nas giorra, timcheall air \({1}\,{\hbox {h}}\) airson lorg electrochemical ds-DNA6. electrod\({5}\,{{\upmu\hbox {l}}}\), an uair sin a' glanadh le rag a tha bogte le IPA, mus lean thu air adhart le sampall eile.Chaidh gach sampall a dhearbhadh air 5 dealanan eadar-dhealaichte mura h-eilear ag ràdh.DPV agus chaidh tomhasan CV a dhèanamh a’ cleachdadh potentiostat PalmSens Sensit Smart, agus chaidh bathar-bog PTrace a chleachdadh airson rèiteachadh potentiostat agus togail dàta, a’ toirt a-steach àireamhachadh gnàthach as àirde. airson tomhasan DPV agus CV:
DPV: Ùine Co-ionannachd = \(8\,\hbox {s}\), Ceum Voltage = \(3\,\hbox {mV}\), Pulse Voltage = \(25\,\hbox {mV}\), fad cuisle = \(50\,\hbox {ms}\), scan rate = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: Ùine Co-ionannachd = \(8\,\hbox {s}\), Ceum Voltage = \(3\,\hbox {mV}\), Ìre Sguabaidh = \({300}\,\hbox {mV/ s }\)
Sruthan as àirde a gheibhear bho bholtamograman DNA air an iom-fhillte le \({50}\,{\upmu\hbox {M}}\) MB: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
Chaidh voltamograman DPV agus CV fhaighinn air dealanan ENIG PCB \({50}\,{\upmu\hbox {M}}\) MB iom-fhillte le DNA (aig dùmhlachdan de 10–\({20}\,{\hbox {ng) }/{\upmu \hbox {l}}}\) ie 0.13–\({0.26}\,{\upmu\hbox {M}}\) airson \(117\,\hbox {bp}\ ) agus 0.03 –\({0.06}\,{\upmu\hbox {M}}\) airson \(503\,\hbox {bp}\)).Tha voltamograman riochdachail air an sealltainn ann am Figear S1 ann am Fiosrachadh Leasachail. de thomhasan DPV agus CV (sruth as àirde) a’ cleachdadh bathar PCR air a ghlanadh le gel.An coimeas ri tomhais CV, tha tomhasan DPV a’ nochdadh cugallachd nas àirde (gnàthach mar ghnìomh dùmhlachd DNA) leis gu bheil sruthan capacitive cùl-raon ann an tomhasan CV a’ falach sruthan Faradaic 26 .An dàta airson gach bogsa anns a’ bhocsa tha tomhasan bho 5 electrodes. Bidh gach tomhas a’ cleachdadh an aon sheata de eleactrothan gus mearachdan tomhais a sheachnadh mar thoradh air eadar-dhealachadh dealan-gu-dealanach. , nas fhaide (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ an coimeas ri \(117) ) criomag. Tha adsorptadh an iom-fhillte MB-DNA a 'comasachadh gluasad cosgais air an dealan, a tha a' cur ri àrdachadh an t-sruth as àirde. -cytosine (GC) susbaint an dà amplicons (\(117\,\hbox {bp}\) agus \(503\,\hbox {bp}\)) mu 50%, a' nochdadh gu bheil an amharc Tha an diofar ri thighinn gu fad leudachaidh. \) agus \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu\hbox {l}}}\) airson \(117\,\hbox {bp}\)), chì sinn dà leudachadh The Tha seo air sgàth 's gu bheil MB a' sàthadh agus a' ceangal eadar paidhrichean bunaiteach de DNA, a' ciallachadh gu bheil bacadh làidir air gnìomhachd redox a' bhuidhinn a ghabhas lùghdachadh ann am MB31,32.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \, \hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
Bidh salainn a tha an làthair ann am measgachadh maighstir PCR a’ cur bacadh air eadar-obrachadh electrostatach eadar MB agus DNA, mar sin le bhith a’ cur \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) le \({50} \,{\) upmu \hbox {M}}\) MB bathar air a ghlanadh le gel gus buaidh salainn air eadar-obrachadh MB-DNA a sgrùdadh. hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) agus \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu\hbox { l}}}\) airson \(117\,\hbox {bp} \)), ann an DPV agus CV Cha tug cur-ris salainn buaidh mhòr air na tomhais (faic Figear S2 ann am Fiosrachadh Leasachail airson voltamograman riochdachail). Ach, aig co-chruinneachaidhean DNA nas ìsle, tha cur-ris salainn gu mòr a’ lughdachadh cugallachd, a’ ciallachadh nach bi atharrachadh mòr sam bith ann an sruth le dùmhlachd DNA. Bidh cations Mg}^{2+}\) a’ ceangal ri cnàimh-droma fosfáit àicheil DNA, agus mar sin a’ cur bacadh air an eadar-obrachadh electrostatach eadar MB agus DNA. Is e am prìomh phuing gu bheil am biosensor seo nas freagarraiche airson co-chruinneachaidhean DNA nas àirde a lorg (gu math tric \({\hbox {ng}/{\upmu\hbox {l}}}\) no nas àirde), airson giollachd làn-fèin-ghluasadach de shamhlaichean uisge àrainneachd, far nach biodh e comasach glanadh gel de thoraidhean PCR.
Raon fo lùb an in-ghabhail airson an raon tonn-tonn 600–700 \(\ hbox {nm}\) airson diofar cho-chruinneachaidhean DNA air an iom-fhillte le \({50}\,{\upmu\hbox {M}}\) MB: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) le agus às aonais salainn (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) le agus às aonais salainn (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) Co-chruinneachaidhean DNA a' freagairt ri \({50}\,{\upmu\hbox {M}}\) sampaill MB Gun DNA.
Gus na toraidhean gu h-àrd a dhearbhadh tuilleadh, rinn sinn tomhais optigeach a’ cleachdadh spectrphotometer UV/Vis (Thermo Scientific Multiskan GO), chaidh na sampallan \({50}\,{{\upmu\hbox {l}}}\) a chleachdadh airson gach fear. Measurement.Tha an t-ainm-sgrìobhte in-ghabhail a’ lùghdachadh le dùmhlachd DNA a’ sìor fhàs, mar a chithear bho ghluasad na sgìre fon lùb sùghaidh airson an raon tonn-tonn \(600\,\hbox {nm}\) gu \(700\,\hbox { nm}\), mar a chithear ann am Fig. 4 (speactram ion-ghabhail ri fhaicinn ann am Fig. S3 ann am Fiosrachadh Leasachail). Airson sampallan le dùmhlachd DNA nas lugha na \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu\hbox). {l}}}\), cha robh eadar-dhealachadh mòr sam bith anns an gabhail eadar sampallan anns an robh DNA agus MB a-mhàin (airson \(503\,\hbox {bp}\) agus \(117\,\hbox {bp}\). ) criomagan faid), a’ nochdadh nach robh bacadh steric ann air redox-active MB.Ag dùmhlachdan DNA nas àirde, chunnaic sinn lùghdachadh mean air mhean anns a’ chomharra sùghaidh agus thug sinn fa-near lùghdachadh nas lugha ann an sùghadh an làthair salainn. Tha na toraidhean againn co-chòrdail ri aithisgean anns an litreachas air sgrùdaidhean speactroscopach air eadar-mheasadh MB-DNA a tha a’ ceangal hypochromaticity le ìrean lùtha nas ìsle ann an \(\ pi\)–\(\pi^*\ ) eadar-ghluasadan dealanach mar thoradh air eadar-ghearradh Sreathan 36, 37, 38.
Electrophoresis gel agarose de phage Phi6: toraidhean PCR de dh'fhaid \ (117 \, \ hbox {bp} \) agus \ (503 \, \ hbox {bp} \) bho shamhlaichean uisge locha.M-DNA comharra;Smachd NTC-no-template, primers anns a bheil amplicons co-fhreagarrach;PC smachd adhartach;1, 2, 3-neo-shoilleir (1: 1) sampallan uisge locha spìcte ann an còmhlan trì-fhillte. hbox {bp}\) lain.
Rinn sinn measadh air goireasachd an sensor a’ cleachdadh sampallan uisge Powai Lake a chaidh a spìonadh le Phi6 phage. ml}}\), fhad 'sa bha an fheadhainn a tha air an dealachadh bho chrochaidhean phage glan Bhathar a' meas gur e \({1945}\,{\upmu\hbox {g}/\hbox {ml}}\) an RNA le èifeachdas ath-bheothachaidh de mu 1 Chaidh %RNA ath-sgrìobhadh air ais gu cDNA agus a chleachdadh mar theamplaid airson PCR agus qPCR.Chaidh meud toraidh a dhearbhadh le electrophoresis gel agarose (Figear 5) mus deach deuchainn a dhèanamh leis an sensor. Chaidh na luachan Ct a chaidh a chlàradh rè qPCR (Clàr 1) a shealltainn gu bhith co-cheangailte ri dùmhlachd RNA air a sgaradh bho na sampallan uisge spìceach co-fhreagarrach. nas àirde na an stairsnich no an cùl-chomharran. tha an smachd adhartach agus an sampall deuchainn a’ nochdadh tuilleadh gu bheil teamplaid timcheall air 1% aig gach sampall deuchainn an taca ris an smachd adhartach. Tha sinn air bruidhinn roimhe gu bheil amplicons nas fhaide a’ leantainn gu cugallachd nas fheàrr. Ach, le ar saidhbhreas bhìorasach agus protocol leudachaidh PCR, bha e comasach dhuinn a’ chriomag \(503\,\hbox {bp}\) a mheudachadh gu soirbheachail airson mothachadh electrochemical.
Tha Figear 6 a’ sealltainn toraidhean mothachaidh electroceimiceach an amplicon criomag \(503\,\hbox {bp}\), an dà chuid a’ cleachdadh cDNA gun lasachadh mar theamplaid (1: 1) agus cDNA caolaichte 100-fhillte mar theamplaid (1:100 ) air a dhèanamh PCR , an coimeas ri NTC agus PC (faic Figear S4 ann am Fiosrachadh Leasachail airson voltamograman riochdaire). An coimeas ri tomhais CV, tha tomhasan DPV a’ nochdadh rùn nas fheàrr gus eadar-dhealachadh a dhèanamh air sampallan deuchainn agus PC bho NTCn oir, mar a chaidh ainmeachadh roimhe, tha sruthan Faradaic falaichte air sgàth sruthan capacitive cùl-fhiosrachaidh anns an fhear mu dheireadh. lean an smachd àicheil (NTC) gu sruthan stùc CV agus DPV nas àirde an coimeas ris an smachd adhartach, ach sheall sampaill deuchainn dearbhach agus neo-shoilleir àirdean stùc coltach ri sruthan stùc DPV. ) faodar sampall deuchainn agus PC a rèiteachadh gu soilleir bhon toradh mothachaidh airson sampall NTC, fhad ‘s nach eil an rùn airson an sampall caolaichte 1:100 cho follaiseach. (sreathan nach eil air an sealltainn ann am Figear 5), agus bha na sruthan stùc DPV agus CV co-chosmhail ris an fheadhainn a bha dùil airson NTC. thug smachd air freagairt electroceimiceach bhon sensor PCB mar thoradh air a bhith a’ toirt a-steach MB an-asgaidh air an electrod agus eadar-obrachadh an MB leis an primer aon-shreath oligonucleotide.Mar sin, gach uair a thèid sampall a dhearbhadh, feumar smachd àicheil a ruith agus an sruth as àirde den sampall deuchainn an coimeas ris an t-sruth as àirde a gheibhear leis an smachd àicheil gus tomhas eadar-dhealaichte (càirdeas)39,40 a choileanadh gus an sampall deuchainn a sheòrsachadh mar adhartach no àicheil.
(a) DPV, agus (b) sruth stùc CV airson lorg electrochemical de mhìrean \ (503 \, \ hbox {bp} \) ann an sampallan uisge locha. smachdan adhartach (PC).
Tha na co-dhùnaidhean againn a’ nochdadh diofar uidheamachdan a tha a’ toirt buaidh air coileanadh luchd-mothachaidh electroceimiceach airson amplicons de dhiofar fhaid airson diofar DNA, le dùmhlachdan air an dearbhadh le tomhasan optigeach a’ cleachdadh spectrophotometer UV/Vis. Faodar \(500\,\hbox {bp}\) a lorg le cugallachd nas àirde agus nach eil làthaireachd salainn san t-sampall a’ toirt a-steach dùmhlachd DNA cugallachd a bheir buaidh air cugallachd nas àirde (glè ainneamh \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) agus nas àirde).Chunnaic sinn gun tug DPV seachad fuasgladh nas fheàrr, leis gu bheil an sruth capacitive cùl-raon cuideachd a’ toirt buaidh air tomhas CV, ga dhèanamh nas mothachaile.
Tha leudachadh air pìosan nas fhaide an urra ri ionracas an RNA genomic bhìorasach. Mhothaich sinn gu robh an dòigh co-chruinneachaidh bhìoras stèidhichte air PEG nas èifeachdaiche ann a bhith a 'cuimseachadh phage Phi-6 a chaidh a spìonadh ann an sampallan uisge locha na an dòigh co-chruinneachaidh bhìoras alùmanum hydroxide stèidhichte air a' bhìoras. gus iomadach teamplaid de dh'fhaid nas giorra a mheudachadh agus lùghdachadh a dhèanamh air a' chomas air tar-shònrachadh.
Tha sampallan bith-eòlasach gann, agus mar sin feumar biosensor a dhealbhadh a dh’ fheumas glè bheag de shampaill airson deuchainn. ) sampaill airson deuchainn gus a bhith a’ còmhdach raon èifeachdach nan electrodes.Additionally, faodar an aon electrod ath-chleachdadh às deidh glanadh mus tèid an ath shampall a thoirt seachad. Leis gu bheil gach dealan a’ cosg timcheall air $0.55 (no INR 40) airson saothrachadh, faodaidh am biosensor seo a bhith na roghainn cosg-èifeachdach an àite nan teicneòlasan lorgaidh a th’ ann an-dràsta. Mìrean DNA ann an sampallan heterogeneous.
Leis gu bheil protocolaidhean lorg electrochemical stèidhichte air MB an urra ri sònrachas PCR, is e cuingealachadh mòr air an dòigh seo an comas leudachadh neo-shònraichte ann an sampallan ioma-ghnèitheach leithid uisge caithte agus uisge lochan no a bhith a’ cleachdadh primers purrachd ìosal. dòighean lorg electroceimiceach airson lorg DNA de thoraidhean PCR neo-ghlan a’ cleachdadh electrodes ENIG PCB neo-atharraichte, feumar tuigse nas fheàrr fhaighinn air mearachdan a thugadh a-steach le dNTPn agus primers nach deach an cleachdadh, agus gus suidheachadh ath-bhualadh agus protocolaidhean assay a bharrachadh. is dòcha gum feumar iarrtas ocsaidean (BOD) den sampall uisge a thomhas cuideachd gus cruinneas an tomhais a leasachadh.
Ann an co-dhùnadh, tha sinn a 'moladh sensor electrochemical ENIG PCB cosgais ìseal airson lorg bhìoras ann an àrainneachd (uisge locha) samples.Unlike electrodes oligonucleotide neo-ghluasadach no substrates àbhaisteach airson mothachadh DNA a dh' fheumas stòradh cryogenic gus cugallachd a chumail suas,53,54 bidh an dòigh-obrach againn a 'cleachdadh PCB gun atharrachadh. electrodes le beatha sgeilp nas fhaide agus gun riatanasan stòraidh sònraichte agus mar sin freagarrach airson leasachadh fuasglaidhean tomhais le giollachd sampall fèin-ghluasadach air a chleachdadh ann an LMICs. a tha cumanta ann an sampallan àrainneachd a’ lughdachadh cho sònraichte sa tha an dòigh mothachaidh seo mar thoradh air ceangal neo-shònraichte MBn ri oligonucleotides aon-shreath is dùbailte. agus bu chòir sruthan stùc DPV a gheibhear bho na sampallan deuchainn a bhith air am mìneachadh an coimeas ris na freagairtean a gheibhear bhon smachd àicheil (NTC) airson gach deuchainn. - fuasgladh cosgais as urrainn sampallan a chruinneachadh agus a sgrùdadh agus toraidhean a chuir air ais chun obair-lann gun uèir.
Cashdollar, J. & Wymer, L. Modhan airson a’ chiad chruinneachadh de bhìorasan bho shamhlaichean uisge: ath-sgrùdadh agus meat-anailis air sgrùdaidhean o chionn ghoirid.J.Iarrtas.microorganism.115, pp. 1-11 (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL Bìorasan air an giùlan le uisge: Bacaidhean air uisge òil sàbhailte.PLoS Pathogens.11, E1004867 (2015).
Shrestha, S. et al.
Palecek, E. & Bartosik, M. Nucleic acid electrochemistry.Chemical.Rev.112, 3427–3481 (2012).
Tani, A., Thomson, AJ & Butt, JN Methylene gorm mar leth-bhreith electroceimiceach de oligonucleotides aon-shreath agus dà-fhillte air an gluasad air fo-stratan òir.Analyst 126, 1756–1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ Coimeas eadar Cation agus Anion Intercalators airson Eadar-ghluasad Electrochemical de DNA Hybridization le Long-Range Electron Transfer.Electrochemistry.comminicate.6, 648–654 (2004).
Wong, EL & Gooding, JJ Gluasad cosgais tro DNA: biosensor DNA electrochemical roghnach.anus.Chemical.78, 2138–2144 (2006).
Fang, TH et al. Inneal microfluidic PCR fìor-ùine le lorg electrochemical co-aontach.biological sensor.Bioelectronics.24, 2131–2136 (2009).
Win, BY et al. Sgrùdadh uidheamachd comharrachaidh agus dearbhadh dèanadais air siostam PCR fìor-ùine electrochemical stèidhichte air eadar-obrachadh methylene gorm le DNA.Analyst 136, 1573-1579 (2011).
Ramirez-Chavarria, RG et al.Loop-meadhanaichte sensor electrochemical stèidhichte air leudachadh isothermal airson sars-cov-2 a lorg ann an sampallan uisge sgudail.J.Àrainneachd.Chemical.Britain.10, 107488 (2022).
Kumar, M. et al. Mothachadh dealanach de amplicons SARS-CoV-2 le electrodes PCB.Tha an sensor air a ghnìomhachadh.B Chemistry.343, 130169 (2021).
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. & Yoshida, H. Lorgadh èifeachdach de SARS-CoV-2 RNA anns a’ bloigh chruaidh de wastewater.science.general environment.763, 144587 (2021).
Alygizakis, N. et al. Dòighean Analytical airson lorg SARS-CoV-2 ann an uisge sgudail: Pròtacal agus Seallaidhean san àm ri teachd.TraC a’ gluasad anal.Chemical.134, 116125 (2020).
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. & Kashtan, N. Mairidh am bacteriophage còmhdaichte Phi6 (ionad-ionaid airson SARS-CoV-2) ann am boinneagan seile falmhaichte air an tasgadh air uachdar glainne.science.Rep.10, 1–10 (2020).
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ Seasmhachd àrainneachdail neach-ionaid SARS-CoV-2 (Phi6) ann an amoeba.J.Slàinte Uisge 20, 83 (2021).
Mindich, L. Pasgan mionaideach de thrì mìrean genomic de bacteriophage RNA le sreathan dùbailte \ (\ varphi \) 6.microorganism.Moore.biology.Rev.63, 149–160 (1999).
Pirttimaa, MJ & Bamford, Structar àrd-sgoile sgìre pacaidh DH RNA phage \ (\ varphi \)6.RNA 6, 880–889 (2000).
Bonilla, N. et al.Phages on the Tap - Pròtacal luath is èifeachdach airson ullachadh stoc obair-lann de bacteriophages.PeerJ 4, e2261 (2016).
Ùine puist: Cèitean-27-2022