Děkujeme, že jste navštívili Nature.com. Verze prohlížeče, kterou používáte, má omezenou podporu pro CSS. Pro co nejlepší zážitek vám doporučujeme používat aktualizovaný prohlížeč (nebo vypnout režim kompatibility v Internet Exploreru). Mezitím, abyste zajistili pokračující podpora, budeme web zobrazovat bez stylů a JavaScriptu.
Od začátku pandemie COVID-19 se velmi oceňuje důležitost monitorování vzorků životního prostředí a některé snahy o monitorování se provádějí pomocí zlatého standardu, ačkoli techniky založené na qPCR jsou drahé. Elektrochemické biosenzory DNA by mohly poskytnout potenciálně nákladově efektivní řešení pro monitorování environmentálních vzorků vody v zemích s nízkými a středními příjmy. V této práci demonstrujeme elektrochemickou detekci amplikonů získaných z fága Phi6 izolovaného z obohacených vzorků vody z jezera (oblíbená náhrada za SARS-CoV-2), pomocí ENIG dokončit elektrody DPS bez povrchové úpravy.pohlaví. Odezva elektrochemického senzoru byla důkladně charakterizována pro dva fragmenty DNA různých délek (\({117}\,\hbox {bp}\) a \({503}\,\hbox {bp}\)) a vliv solí v PCR master mixech na interakce methylenové modři (MB)-DNA.Naše výsledky ukazují, že délka fragmentů DNA významně určuje elektrochemickou citlivost a v této práci demonstrují, že schopnost detekovat dlouhé amplikony bez gelové purifikace produktů PCR je důležité pro in situ měření vzorků vody.Plně automatizované řešení virové zátěže je dobrým znamením.
Přenos viru přenášeného vodou je znám jako riziko pro veřejné zdraví již od 40. let 20. století, přičemž první důkazy o přenosu viru přenášeného vodou a hepatitidy E1 byly zaznamenány ve vodě. Světová zdravotnická organizace (WHO) klasifikovala několik virových patogenů přenášených vodou se středním až vysokým zdravotním významem2. Tradiční virus detekční metody se opírají o techniky založené na zlatém standardu qPCR, které jsou vysoce citlivé a specifické, ale vyžadují kvalifikovaný personál pro testování v laboratoři pomocí drahých přístrojů. V zemích s nízkými a středními příjmy (LMIC) s omezenými zdroji však testování vzorků bude mít pravděpodobně přednost před monitorováním vzorků vody v životním prostředí. Proto jsou potřebné alternativní levné metody pro udržitelné monitorování vzorků vody a odpadních vod v zemích s nízkými a středními příjmy v reálném čase jako včasné varování před propuknutím nových chorob, a tím je chrání před vážnými socioekonomickými dopady virové pandemie. Nízkonákladové elektrochemické biosenzory pro nukleové kyseliny by mohly poskytnout slibné potenciální řešení této nenaplněné potřeby. Mnohé z těchto biosenzorů DNA fungují díky skutečnosti, že komplementární vlákna DNA jsou imobilizována na elektrodě povrch a hybridizují, když je ve vzorku přítomna odpovídající sekvence. Ten pak může být přeměněn na signál různými elektrochemickými technikami za použití redoxních mediátorů, jako je železo/ferokyanid draselný. Jednou z takových redoxně aktivních molekul je metylenová modř (MB). bylo hlášeno, že se interkaluje do dvouřetězcové DNA (dsDNA) kromě své více nespecifické vazby na jednořetězcovou DNA5,6. Interkalační povaha MB za vzniku komplexů MB-DNA z nich dělá populární volbu jako redoxní mediátory v několika elektrochemických DNA konfigurace senzoru5,6,7,8,9. Přestože interkalace MB do DNA je nespecifická a specifičnost tohoto elektrochemického senzoru závisí do značné míry na čistotě primerů použitých pro PCR nebo izotermickou amplifikaci, je velmi vhodný pro implementaci skutečné -časová elektrochemická qPCR nebo fluorescenční izotermická amplifikace jako alternativa k měření koncentrace DNA 9 . V jedné takové implementaci Won et al. Povrch zlatých elektrod byl modifikován 6-merkapto-1-hexanolem (MCH) v reálném čase měření PCR amplikonů s MB pomocí diferenciální pulzní voltametrie (DPV)9. V jiných případech Ramirez et al. Detekce SARS-CoV-2 v odpadních vodách reakcí RT-LAMP pomocí MB se sítotiskovými elektrodami. Platinové elektrody byly také používané jako elektrody in situ v mikrofluidní platformě PCR určené k elektrochemické detekci amplikonů během reakcí 8 . Všechny tyto studie vyžadují povrchovou úpravu elektrod, což znamená zvýšené výrobní a provozní náklady v důsledku speciálních požadavků na skladování na stabilitu těchto funkcionalizovaných elektrod.
Schéma pracovního postupu pro elektrochemickou detekci amplikonů získaných z koncentrovaných virových částic ve vzorcích jezerní vody.
Nedávno jsme prokázali elektrochemické snímání amplikonů SARS-CoV-2 s nízkonákladovými elektrodami desek plošných spojů (PCB) na bázi DPV a cyklické voltametrie (CV) indukované adsorpcí komplexů MB-DNA na povrchu nemodifikovaných elektrod ) změny píku proud 11.Uvádíme, že delší fragmenty DNA (N1-N2, \({943}\, \hbox) vytvořené pomocí CDC-doporučovaných N1 forwardových a N2 reverzních primerů ve srovnání s kratšími fragmenty {bp}\)) vykazovaly lepší linearitu v odezvě senzoru ( N1, \(72\,\hbox {bp}\)) vytvořené pomocí sad N1 forward a N1 reverzních primerů. Tyto studie jsou uvedeny s použitím ředění DNA připravené ve vodě bez nukleázy. Platforma byla také použita k detekci SARS-CoV -2 amplikony v simulovaných vzorcích odpadních vod (získaných přidáním vzorků celkové RNA RNA SARS-CoV-2). Vzhledem k tomu, že RNA je citlivá na střih během izolace a následného zpracování,12,13 je obtížné amplifikovat delší fragmenty tímto heterogenním vzorkem. Proto je demonstrace elektrochemického snímání amplikonu SARS-CoV-2 v odpadní vodě omezena na kratší fragment \(72\,\hbox {bp}\) N1.
V této práci jsme zkoumali proveditelnost elektrochemického snímání fága Phi6 koncentrovaného a izolovaného ze vzorků jezerní vody na bázi ENIG PCB (obr. 1). Fágy Phi6 jsou velikostí srovnatelné (80-100 nm) se SARS-CoV-2 a mají také lipidovou membránu a spike protein. Z těchto důvodů je bakteriofág Phi6 oblíbeným zástupcem SARS-CoV-2 a dalších obalených patogenních RNA virů14,15. RNA izolovaná z fágových částic byla použita jako templát pro syntézu cDNA a následně PCR k získání dvou fragmentů DNA o délce 117 a 503 párů bází. Vzhledem k výzvě spočívající v amplifikaci fragmentů \(943\,\hbox {bp}\) N1-N2 v naší předchozí práci se zaměřujeme na fragmenty střední délky (\(117 \,\hbox {bp}\) a \(503 \,\hbox {bp}\)), na základě dostupných primerů. Odezva elektrochemického senzoru byla systematicky studována v širokém koncentračním rozsahu (\({10}\,{ \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) až \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) Pro oba fragmenty v přítomnost MB, vliv soli na odezvu senzoru byl charakterizován a křížově ověřen spektrofotometrickými měřeními. Hlavní přínosy této práce jsou následující:
Citlivost silně ovlivňuje délka fragmentu DNA a přítomnost soli ve vzorku.Naše výsledky ukazují, že elektrochemická aktivita závisí na různých mechanismech interakce MB, DNA a senzoru ve voltametrické odezvě v závislosti na koncentraci a délce DNA, přičemž delší Fragmenty vykazují vyšší citlivost, ačkoli sůl má negativní vliv na elektrostatické interakce mezi MB a DNA.
Koncentrace DNA určuje mechanismus interakce MB-DNA v nemodifikovaných elektrodách Ukazujeme, že různé mechanismy interakce MB-DNA závisí na koncentraci DNA. Při koncentracích DNA nižších než malé množství \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), pozorovali jsme, že elektrochemická proudová odezva byla určena hlavně adsorpcí MB-DNA na elektrodě, zatímco při nižších koncentracích Při vysokých koncentracích DNA byla elektrochemická proudová odezva určena stérickou inhibicí redox aktivita v důsledku MB inzerce mezi páry bází DNA.
Elektrochemické snímání virových nukleových kyselin ve vzorcích jezerní vody na bázi ENIG PCB Pozorování byla ověřena elektrochemickou detekcí fragmentů DNA \(503\,\hbox {bp}\) s přidaným Phi6 získaných ze vzorků vody z jezera Powai, IIT Mumbai Campus Výsledný fág.
Nízké náklady na implementaci a potenciál pro integraci do plně automatizovaných monitorovacích systémů, oligonukleotidů nebo aptamerů na elektrodách s delší skladovatelností.
Phage Phi6 je obalený dsRNA virus z čeledi Cytoviridae, který infikuje Pseudomonas syringae. Genom fága Phi6 existuje ve formě 3 fragmentů: S (\(2,95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4,07 \,\hbox {Kb}\)) a L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\))16,17. Vzhledem k tomu, že fág Phi6 infikuje nepatogenní kmen BSL-1 Pseudomonas, je použití bezpečné a lze je snadno pěstovat v laboratoři. Phage Phi6 a jeho hostitel Pseudomonas syringae byly zakoupeny od Felix d'Herelle Referenčního centra pro bakteriální viry, Laval University, Kanada (katalogová čísla referenčního centra jsou HER-102 a HER-1102, v tomto pořadí) Fág .Phi6 a jeho hostitel byli oživeni podle pokynů referenčního centra. Fág Phi6 byl purifikován lýzou destiček a elucí, aby se získaly konečné titry s \(\asi 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { ml}}\) (jednotky tvořící plak/mililitry). RNA byla izolována z purifikovaných fágových částic pomocí GenElute™ Universal Total RNA Purification Kit (Sigma-Aldrich) podle pokynů výrobce. Stručně, purifikovaná fágová suspenze Phi6\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) byl lyžován a lyzát byl nanesen na rotační kolonu, aby se RNA mohla navázat na kolonu pryskyřice. RNA je poté eluována v elučním roztoku \({ 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) poskytnutý soupravou. Odhadněte koncentraci RNA pomocí absorbance při \(260\,\hbox {nm}\). RNA byla uložena v alikvotech v \ ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) do dalšího použití.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) The iScript cDNA Synthesis Kit (Bio -Rad Laboratories) byl použit jako šablona pro syntézu cDNA podle pokynů výrobce. Stručně řečeno, reakce syntézy cDNA se skládá ze 3 kroků: aktivace v \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min} }\) , zpětný přepis \({20}\,{\hbox {min}}\) na \({46}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) a zpět Záznamník je v \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) pro \({1}\,{\hbox {min }}\). Když byla provedena na 1% agarózovém gelu, cDNA ukázala tři pásy odpovídající očekávaným třem fragmentům RNA (data nejsou uvedena). Následující primery byly použity k amplifikaci dvou fragmentů DNA o délce 117 a 503 bp, použití cDNA jako templátu pro PCR v termocykleru miniPCR® mini8:
Primery pro \(117\,\hbox {bp}\) a \(503\,\hbox {bp}\) odpovídají 1476-1575 nukleotidům segmentu M a 458-943 nukleotidům segmentu L, respektive kyselinám Všechny amplifikované produkty PCR byly podrobeny elektroforéze na 1% agarózových gelech a amplifikovaná cílová DNA byla purifikována pomocí soupravy GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Fisher Scientific).
Jezero v kampusu IIT Mumbai (Powai Lake, Powai, Mumbai) bylo použito k přidání fágových částic. Voda v jezeře byla filtrována přes membránu \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\), aby se odstranila suspendované částice a poté byl přidán fág Phi6. Přidejte \({1}\,{\hbox {ml}}\) z \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} \) do \( {100}\ ,{\hbox {ml}}\) filtrovaná jezerní voda, v \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\). Malý alikvot byl vyhrazeno pro měření virové zátěže pomocí plakového testu. Testovali jsme dvě různé metody pro koncentraci obohacených částic viru Phi6: (1) metodu adsorpce-precipitace hydroxidem hlinitým,19 která byla ověřena pro koncentraci několika obalených RNA virů ze vzorků životního prostředí, a (2) ) Metoda koncentrace viru na bázi polyethylenglykolu (PEG) byla upravena podle Flood et al.20. Protože bylo zjištěno, že účinnost regenerace metody založené na PEG je lepší než u metody s hydroxidem hlinitým, byla ke koncentraci částic Phi6 ze vzorků jezerní vody použita metoda založená na PEG.
Použitá metoda PEG byla následující: PEG 8000 a \(\hbox {NaCl}\) byly přidány do vzorků vody z jezera obohaceného Phi6, aby se získalo 8 % PEG 8000 a \(0,2\,\hbox {M} \) \( \ hbox {NaCl}\).Vzorky byly inkubovány na třepačce\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), poté odstředěný při \(4700 \,\hbox {g}\) je \({45}\,{\hbox {min}}\). Zlikvidujte supernatant a resuspendujte peletu v \({1}\, {\hbox {ml}}\) ve stejném supernatantu. Všechny experimenty s přídavkem a koncentrací viru byly provedeny trojmo. Po koncentraci byl malý alikvot rezervován pro měření účinnosti výtěžnosti pomocí plakového testu. RNA byla izolována, jak bylo popsáno dříve, a eluována v elučním pufru dodaném soupravou\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\). Protože se koncentrace RNA bude lišit vzorek od vzorku v triplikátech, \({2}\,{\upmu \ hbox {l}}\) RNA se používá pro všechny tři bez ohledu na jeho koncentraci syntéza cDNA vzorků. Syntéza cDNA byla provedena tak, jak bylo popsáno dříve.\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNA byl použit jako šablona pro \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR pro 35 cyklů k amplifikaci \ (117\,\hbox {bp}\) a \(503\,\hbox { bp}\) fragmenty. Tyto vzorky jsou reprezentovány jako „1:1“, tj. bez ředění. Jako negativní kontrola byla nastavena kontrola bez předlohy (NTC), zatímco cDNA syntetizovaná pomocí RNA izolované z purifikovaného fága byla vytvořena jako templát pro pozitivní kontrolu (PC). Kvantitativní PCR (qPCR) byla provedena v přístroji Stratagene Mx3000P RT-PCR s použitím Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies). Reakce byly nastaveny v triplikátech jako dříve Prahová hodnota cyklu (Ct) byla zaznamenána u všech vzorků. Kromě toho byly zředěné vzorky \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) pomocí cDNA zředěné 1:100 ve filtrované jezerní vodě jako \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR pro 35 cyklů. Tyto vzorky jsou reprezentovány jako „1:100″.
Elektrody PCB jsou vyrobeny pomocí komerčně dostupného levného procesu Electroless Nickel Immersion Gold (ENIG) bez nutnosti dodatečného pokovování. Specifikace elektrod ENIG PCB jsou podrobně popsány v naší předchozí práci11. Pro elektrody ENIG PCB se používají tradiční metody čištění elektrod, jako je např. roztok piraně nebo cyklická voltametrie kyseliny sírové se nedoporučují, protože mohou způsobit odlupování tenké zlaté vrstvy (tloušťka \(\approx\) \(100\,\hbox {nm }\)) a odhalit podložní vrstvy mědi, které jsou náchylné na korozi 21, 22, 23, 24, 25. Proto očistěte elektrody hadříkem nepouštějícím vlákna navlhčeným v IPA. Vzorek, který má být testován, byl inkubován s \({50}\,{\upmu \hbox {M} }\) MB v \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) pro snadné vkládání.V naší předchozí práci , pozorovali jsme, že citlivost a linearita senzoru se zlepšila zvýšením koncentrace MB 11 .Na základě optimalizací uvedených v naší dřívější práci jsme použili \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB koncentrace pro zakotvení DNA v této studii.Elektrochemické detekce dvouvláknové DNA (ds-DNA) lze dosáhnout pomocí aniontových nebo kationtových interkalátorů. Přestože aniontové interkalátory detekují DNA s lepší selektivitou, vyžadují inkubaci přes noc, což má za následek delší dobu detekce. na druhou stranu, kationtové interkalátory jako MB vyžadují kratší inkubační doby, přibližně \({1}\,{\hbox {h}}\) pro elektrochemickou detekci ds-DNA6. Každé měření zahrnuje dávkování vzorku, který má být testován na elektroda\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), poté očistěte hadříkem navlhčeným IPA, než budete pokračovat s dalším vzorkem.jedno měření. Každý vzorek byl testován na 5 různých elektrodách, pokud není uvedeno jinak. Měření DPV a CV byla provedena pomocí potenciostatu PalmSens Sensit Smart a pro konfiguraci potenciostatu a sběr dat, včetně výpočtů špičkového proudu, byl použit software PSTrace. pro měření DPV a CV:
DPV: Rovnovážný čas = \(8\,\hbox {s}\), Napěťový krok = \(3\,\hbox {mV}\), Pulzní napětí = \(25\,\hbox {mV}\) , trvání pulzu = \(50\,\hbox {ms}\), rychlost skenování = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: Rovnovážný čas = \(8\,\hbox {s}\), Napěťový krok = \(3\,\hbox {mV}\), Rychlost rozmítání = \({300}\,\hbox {mV/s }\)
Špičkové proudy získané z voltamogramů DNA v komplexu s \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
DPV a CV voltamogramy byly získány na ENIG PCB elektrodách \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB v komplexu s DNA (v koncentracích 10–\({20}\,{\ hbox {ng }/{\upmu \hbox {l}}}\) tj. 0,13–\({0,26}\,{\upmu \hbox {M}}\) pro \(117\,\hbox {bp}\ ) a 0,03 –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) pro \(503\,\hbox {bp}\)). Reprezentativní voltamogramy jsou zobrazeny na obrázku S1 v doplňkových informacích. Obrázek 2 ukazuje výsledky měření DPV a CV (špičkový proud) pomocí produktů PCR purifikovaných na gelu. Ve srovnání s měřením CV vykazují měření DPV vyšší citlivost (proud jako funkce koncentrace DNA), protože kapacitní proudy na pozadí v měřeních CV skrývají Faradaovy proudy 26 . pro každý box v boxplotu obsahuje měření z 5 elektrod. Všechna měření používají stejnou sadu elektrod, aby se předešlo chybám měření v důsledku kolísání mezi elektrodou. Pozorovali jsme rostoucí trend v DPV a CV měřených špičkových proudech pro nižší koncentrace DNA , delší (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ ve srovnání s \(117) ) fragment.To je v souladu s očekávaným trendem adsorpce elektrod uvedeným v naší předchozí práci. adsorpce komplexu MB-DNA usnadňuje přenos náboje na elektrodě, což přispívá ke zvýšení špičkového proudu. Jiné studie prokázaly vliv velikosti a sekvence oligonukleotidů na interkalaci MB-DNA27,28,29,30.guanin -obsah cytosinu (GC) ve dvou amplikonech (\(117\,\hbox {bp}\) a \(503\,\hbox {bp}\)) byl přibližně 50 %, což naznačuje, že pozorování Rozdíl je způsoben na délku amplikonu.Nicméně pro vyšší koncentrace DNA (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), pro \(503\,\hbox {bp} \) a \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) pro \(117\,\hbox {bp}\)), pozorujeme dvě zesílení vrcholové proudy subs jsou sníženy jak při měření DPV, tak CV. Je to proto, že MB saturuje a interkaluje mezi páry bází DNA, což vede ke sterické inhibici redoxní aktivity redukovatelné skupiny v MB31,32.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV。
Soli přítomné v PCR master mixech interferují s elektrostatickými interakcemi mezi MB a DNA, takže přidáním \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) s \({50} \,{\ upmu \hbox {M}}\) produkt purifikovaný MB gelem ke studiu účinku soli na interakci MB-DNA. Jak ukazuje obrázek 3, pozorovali jsme, že pro vyšší koncentrace DNA (\(>{2}\,{\ hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) a \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) pro \(117\,\hbox {bp} \)), v DPV a CV Přidání soli významně neovlivnilo měření (viz obrázek S2 v Doplňkových informacích pro reprezentativní voltamogramy). nižší koncentrace DNA, přidání soli výrazně snižuje citlivost, takže nedochází k žádné významné změně proudu s koncentrací DNA. Podobné negativní účinky soli na interakce a interkalaci MB-DNA byly již dříve hlášeny jinými výzkumníky33,34.\(\hbox { Kationty Mg}^{2+}\) se vážou na negativní fosfátovou kostru DNA, čímž brání elektrostatické interakci mezi MB a DNA. Při vyšších koncentracích DNA vede sterická inhibice redoxně aktivních MB k nižším špičkovým proudům, takže elektrostatické interakce neovlivňují významně odezvu senzoru. Klíčovým bodem je, že tento biosenzor je vhodnější pro detekci vyšších koncentrací DNA (zřídka \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) nebo vyšší), pro plně automatizované zpracování vzorků vody z prostředí, kde gelová purifikace produktů PCR nemusí být proveditelná.
Oblast pod absorpční křivkou pro rozsah vlnových délek 600–700 \(\hbox {nm}\) pro různé koncentrace DNA v komplexu s \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) se solí a bez soli (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) se solí a bez soli (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) Koncentrace DNA odpovídající \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB vzorků Žádná DNA.
Pro další ověření výše uvedených výsledků jsme provedli optická měření pomocí UV/Vis spektrofotometru (Thermo Scientific Multiskan GO), pro každý byly použity vzorky \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\). Měření. Absorpční signatura klesá se zvyšující se koncentrací DNA, jak lze vidět z trendu plochy pod absorpční křivkou pro rozsah vlnových délek \(600\,\hbox {nm}\) až \(700\,\hbox { nm}\), jak je znázorněno na obr. 4 (absorpční spektrum znázorněno na obr. S3 v doplňkových informacích). Pro vzorky s koncentracemi DNA nižšími než \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), nebyl žádný významný rozdíl v příjmu mezi vzorky obsahujícími DNA a vzorky obsahujícími pouze MB (pro \(503\,\hbox {bp}\) a \(117\,\hbox {bp}\ ) fragmenty délky), což ukazuje na absenci sterické inhibice redox-aktivní MB. Při vyšších koncentracích DNA jsme pozorovali postupný pokles absorbančního signálu a zaznamenali menší pokles absorbance v přítomnosti soli. Tyto výsledky byly připsány molekulárním interakce a sterická inhibice s vrstvením bází u hybridů DNA. Naše výsledky jsou v souladu se zprávami v literatuře o spektroskopických studiích interkalace MB-DNA, které spojují hypochromatičnost se sníženými hladinami energie v \(\pi\)–\(\pi ^*\ ) elektronické přechody v důsledku interkalace Vrstvy 36, 37, 38.
Elektroforéza fága Phi6 na agarózovém gelu: PCR produkty délky \(117\,\hbox {bp}\) a \(503\,\hbox {bp}\) ze vzorků vody z jezera. M-DNA marker;NTC-no-template kontrola, primery obsahující odpovídající amplikony;PC pozitivní kontrola;1, 2, 3-neředěné (1:1) vzorky vody z jezera s přídavkem ve třech vyhotoveních. Pás je viditelný na \(\asi 50\,\hbox {bp}\) kvůli nepoužitým oligonukleotidům v \(503\,\ hbox {bp}\) pruh.
Vyhodnotili jsme užitečnost senzoru pomocí vzorků vody z jezera Powai obohacených fágem Phi6. Koncentrace RNA izolované ze vzorků vody obohacené fágy se pohybovaly v rozmezí 15,8–\({19,4}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox { ml}}\), zatímco ty izolované z purifikovaných fágových suspenzí. RNA byla odhadnuta na \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) s účinností regenerace přibližně 1 %.RNA byla reverzně transkribována do cDNA a použita jako templát pro PCR a qPCR. Velikost produktu byla potvrzena elektroforézou na agarózovém gelu (obrázek 5) před testováním pomocí senzoru. Tyto vzorky nejsou gelově purifikovány, a proto obsahují všechny složky PCR jako a také amplikony, které nás zajímají. Ukázalo se, že hodnoty Ct zaznamenané během qPCR (tabulka 1) korelují s koncentrací RNA izolované z odpovídajících vzorků obohacené vody. Hodnota Ct odhaluje počet cyklů potřebných k tomu, aby fluorescenční signál dosáhl překročit prahovou hodnotu nebo signál pozadí. Vyšší hodnoty Ct označují nižší koncentrace templátu a naopak. Hodnoty Ct vzorků NTC byly tak vysoké, jak se očekávalo. Rozdíl v hodnotách \(\přibližně 3\) Ct mezi pozitivní kontrola a testovaný vzorek dále ukazují, že každý testovaný vzorek má přibližně 1 % templátu ve srovnání s pozitivní kontrolou. Již dříve jsme diskutovali o tom, že delší amplikony vedou k lepší citlivosti. Amplifikace delších fragmentů izolovaných z heterogenních vzorků prostředí je náročná vzhledem k nevýhodám nízkou virovou koncentrací a degradací RNA. Nicméně s naším obohacováním viru a protokolem PCR amplifikace jsme byli schopni úspěšně amplifikovat fragment \(503\,\hbox {bp}\) pro elektrochemické snímání.
Obrázek 6 ukazuje výsledky elektrochemického senzoru amplikonu fragmentu \(503\,\hbox {bp}\), oba s použitím neředěné cDNA jako templátu (1:1) a 100krát zředěné cDNA jako templátu (1:100) provedené PCR ve srovnání s NTC a PC (viz obrázek S4 v doplňkových informacích pro reprezentativní voltamogramy). Každý rámeček v boxplotu na obrázku 6 obsahuje měření ze tří vzorků na 5 elektrodách. K měření všech vzorků byly použity stejné elektrody, aby se předešlo chybám způsobeným elektrodou -variace mezi elektrodou.Ve srovnání s měřením CV vykazují měření DPV lepší rozlišení pro rozlišení testovacích a PC vzorků od NTC, protože, jak již bylo zmíněno, Faradaické proudy jsou skryté kvůli kapacitním proudům na pozadí v NTC. U delších amplikonů jsme pozorovali, že negativní kontrola (NTC) vedla k vyšším hodnotám CV a DPV vrcholových proudů ve srovnání s pozitivní kontrolou, zatímco pozitivní a neředěné testovací vzorky vykazovaly podobné výšky vrcholů DPV vrcholových proudů. Naměřené průměrné a střední hodnoty pro každý neředěný (1:1) ) testovaný vzorek a PC lze jasně rozlišit z výstupu senzoru pro vzorek NTC, zatímco rozlišení pro vzorek naředěný v poměru 1:100 je méně výrazné. Při 100násobném zředění cDNA jsme během gelové elektroforézy nepozorovali žádné pruhy (pruhy nejsou znázorněny na obrázku 5) a odpovídající špičkové proudy DPV a CV byly podobné těm, které se očekávaly pro NTC. Výsledky pro fragment \(117\,\hbox {bp}\) jsou uvedeny v doplňkových informacích. Negativní kontrola vyvolala elektrochemickou odezvu ze senzoru PCB v důsledku adsorpce volného MB na elektrodě a interakce MB s jednořetězcovým primerovým oligonukleotidem. Proto při každém testování vzorku musí být provedena negativní kontrola a špičkový proud testovaného vzorku ve srovnání se špičkovým proudem získaným negativní kontrolou pro dosažení rozdílového (relativního) měření39,40 pro klasifikaci testovaného vzorku jako pozitivní nebo negativní.
(a) DPV a (b) CV špičkový proud pro elektrochemickou detekci fragmentů \(503\,\hbox {bp}\) ve vzorcích jezerní vody. Testované vzorky byly měřeny v triplikátech a porovnány s kontrolami bez templátu (NTC) a pozitivní kontroly (PC).
Naše zjištění ilustrují různé mechanismy ovlivňující výkon elektrochemických senzorů pro amplikony různých délek pro různé DNA, s koncentracemi ověřenými optickými měřeními pomocí UV/Vis spektrofotometru. Naše pozorování podtrhují poznatek, že delší fragmenty DNA až \(\cca\) \(500\,\hbox {bp}\) lze detekovat s vyšší citlivostí a že přítomnost soli ve vzorku neovlivňuje citlivost Koncentrace DNA, která ovlivňuje vyšší citlivost (zřídka \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) a výše). Kromě toho jsme zkoumali účinek různých typů vzorků, včetně gelově purifikovaných amplikonů s a bez přidané soli a přidání vzorků jezerní vody při měřeních DPV a CV.Zjistili jsme, že DPV poskytuje lepší rozlišení, protože kapacitní proud pozadí také ovlivňuje měření CV, takže je méně citlivé.
Amplifikace delších fragmentů závisí na integritě virové genomové RNA. Několik studií ukázalo, že amplifikace delších fragmentů není vždy účinná kvůli degradaci RNA v prostředí a možnosti sestřihu během izolace11,41,42,43,44 Zjistili jsme, že metoda koncentrace viru založená na PEG byla účinnější při koncentraci fága Phi-6 obohaceného ve vzorcích jezerní vody než metoda koncentrace viru na bázi hydroxidu hlinitého. Schopnost detekovat dlouhé fragmenty DNA dokázala překonat požadavek na multiplexní PCR k amplifikaci více šablon kratších délek a snížení možnosti křížové specifity.
Biologické vzorky jsou vzácné, takže je potřeba navrhnout biosenzor, který vyžaduje minimální vzorky pro testování. Elektrody ENIG PCB použité v této studii vyžadovaly pouze \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ ) vzorky pro testování tak, aby pokryly účinnou plochu elektrod. Kromě toho lze stejnou elektrodu znovu použít po vyčištění před dávkováním dalšího vzorku. Amplifikované vzorky nevyžadují přidání žádných chemikálií jiných než methylenová modř, která je levná a běžně používané chemikálie. Vzhledem k tomu, že výroba každé elektrody stojí asi 0,55 $ (nebo 40 INR), může být tento biosenzor nákladově efektivní alternativou ke stávajícím detekčním technologiím. Tabulka 2 ukazuje srovnání této práce s jinými senzory uváděnými v literatuře již dlouho Fragmenty DNA v heterogenních vzorcích.
Vzhledem k tomu, že protokoly elektrochemické detekce založené na MB se spoléhají na specifičnost PCR, hlavním omezením této metody je možnost nespecifické amplifikace v heterogenních vzorcích, jako je odpadní voda a jezerní voda, nebo použití primerů s nízkou čistotou. elektrochemické detekční metody pro detekci DNA nepurifikovaných PCR produktů pomocí nemodifikovaných ENIG PCB elektrod, je nutné lépe porozumět chybám způsobeným nepoužitými dNTP a primery a optimalizovat reakční podmínky a protokoly stanovení. Další fyzikálně-chemické parametry, jako je pH, teplota a biologické Může být také nutné měřit spotřebu kyslíku (BSK) vzorku vody, aby se zlepšila přesnost měření.
Na závěr navrhujeme levný elektrochemický ENIG PCB senzor pro detekci virů ve vzorcích životního prostředí (jezerní voda). elektrody s delší skladovatelností a bez specifických požadavků na skladování, a proto jsou vhodné pro vývoj měřicích řešení s automatizovaným zpracováním vzorků nasazených v LMIC. Biosenzor využívá levná DNA-interkalační redoxní barviva (MB) pro rychlou detekci cílových amplikonů. Nespecifická amplifikace běžný ve vzorcích z prostředí snižuje specificitu této snímací metody v důsledku nespecifické vazby MB na jednovláknové a dvouvláknové oligonukleotidy. Specifičnost tohoto testu proto závisí na optimalizaci primerů a reakčních podmínkách PCR. Kromě toho CV a DPV vrcholové proudy získané z testovaných vzorků by měly být interpretovány ve vztahu k odpovědím získaným z negativní kontroly (NTC) pro každý test. Návrhy elektrochemických senzorů a metody uvedené v této práci lze integrovat s autosamplery za účelem vyvinutí plně automatizovaného a nízkého -nákladové řešení, které dokáže sbírat a analyzovat vzorky a bezdrátově přenášet výsledky zpět do laboratoře.
Cashdollar, J. & Wymer, L. Metody pro počáteční koncentraci virů ze vzorků vody: přehled a metaanalýza nedávných studií.J.Aplikace.mikroorganismus.115, str. 1-11 (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL Vodou přenášené viry: Bariéry bezpečné pitné vody.PLoS Pathogens.11, E1004867 (2015).
Shrestha, S. et al. Epidemiologie odpadních vod pro nákladově efektivní rozsáhlý dohled nad COVID-19 v zemích s nízkými a středními příjmy: výzvy a příležitosti. Voda 13, 2897 (2021).
Paleček, E. & Bartošík, M. Nucleic acid electrochemistry.Chemical.Rev.112, 3427–3481 (2012).
Tani, A., Thomson, AJ & Butt, JN Methylenová modř jako elektrochemický diskriminátor jedno- a dvouvláknových oligonukleotidů imobilizovaných na zlatých substrátech. Analyst 126, 1756–1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ Porovnání kationtových a aniontových interkalátorů pro elektrochemickou transdukci DNA hybridizace přenosem elektronů s dlouhým dosahem.Electrochemistry.commicate.6, 648–654 (2004).
Wong, EL & Gooding, JJ Přenos náboje přes DNA: selektivní elektrochemický DNA biosensor.anus.Chemical.78, 2138–2144 (2006).
Fang, TH et al. Mikrofluidní zařízení pro PCR v reálném čase se souběžnou elektrochemickou detekcí.biologický senzor.Bioelektronika.24, 2131–2136 (2009).
Win, BY et al. Studium signalizačního mechanismu a ověření výkonu elektrochemického systému PCR v reálném čase založeného na interakci methylenové modři s DNA. Analyst 136, 1573–1579 (2011).
Ramirez-Chavarria, RG a kol. Elektrochemický senzor na bázi izotermické amplifikace zprostředkovaný smyčkou pro detekci sars-cov-2 ve vzorcích odpadních vod.J.Environment.Chemical.Britain.10, 107488 (2022).
Kumar, M. et al. Elektrochemické snímání amplikonů SARS-CoV-2 pomocí elektrod PCB. Senzor je aktivován. B Chemistry.343, 130169 (2021).
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. & Yoshida, H. Efektivní detekce SARS-CoV-2 RNA v pevné frakci odpadní vody.science.general environment.763, 144587 (2021).
Alygizakis, N. a kol. Analytické metody pro detekci SARS-CoV-2 v odpadních vodách: Protokol a budoucí perspektivy. Anal. trendů TraC. Chemical. 134, 116125 (2020).
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. & Kashtan, N. Přežití obaleného bakteriofága Phi6 (náhrada za SARS-CoV-2) v kapkách odpařených slin uložených na skleněných površích.science.Rep.10, 1–10 (2020).
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ Environmentální persistence náhradní látky SARS-CoV-2 (Phi6) ve volně žijících amébách.J.Zdraví vody 20, 83 (2021).
Mindich, L. Přesné balení tří genomových fragmentů dvouvláknové RNA bakteriofága\(\varphi\)6.mikroorganismus.Moore.biology.Rev.63, 149-160 (1999).
Pirttimaa, MJ & Bamford, Sekundární struktura DH RNA fága\(\varphi\)6 oblasti balení. RNA 6, 880–889 (2000).
Bonilla, N. et al. Phages on the Tap – Rychlý a účinný protokol pro přípravu laboratorních zásob bakteriofágů. PeerJ 4, e2261 (2016).
Čas odeslání: 27. května 2022