Salamat sa pagbisita sa Nature.com.Ang bersyon sa browser nga imong gigamit adunay limitado nga suporta alang sa CSS.Alang sa labing kaayo nga kasinatian, among girekomenda nga mogamit ka usa ka updated nga browser (o i-off ang compatibility mode sa Internet Explorer).Sa kasamtangan, aron masiguro padayon nga suporta, ipakita namo ang site nga walay mga estilo ug JavaScript.
Ang kahinungdanon sa pag-monitor sa mga sample sa kalikopan gipabilhan pag-ayo sukad sa pagsugod sa pandemya sa COVID-19, ug ang pipila nga mga paningkamot sa pag-monitor gihimo gamit ang standard nga bulawan, bisan kung ang mga teknik nga nakabase sa qPCR mahal. solusyon alang sa pag-monitor sa mga sample sa tubig sa kalikopan sa mga nasud nga ubos ug tunga ang kita. Sa kini nga trabaho, gipakita namon ang electrochemical detection sa mga amplicon nga nakuha gikan sa Phi6 phage nga nahimulag gikan sa mga spiked nga sample sa tubig sa linaw (usa ka sikat nga surrogate alang sa SARS-CoV-2), gamit ang ENIG aron makompleto ang mga electrodes sa PCB nga walay pagbag-o sa nawong.sex.Ang tubag sa electrochemical sensor hingpit nga gihulagway alang sa duha ka mga tipik sa DNA nga lainlain ang gitas-on (\({117}\,\hbox {bp}\) ug \({503}\,\hbox {bp}\)), ug ang epekto sa mga salts sa PCR master mixes sa methylene blue (MB) -DNA interactions.Ang among mga resulta nagpakita nga ang gitas-on sa mga tipik sa DNA mahinungdanon nga nagtino sa electrochemical sensitivity ug nagpakita niini nga trabaho nga ang abilidad sa pag-ila sa taas nga mga amplicon nga walay gel pagputli sa mga produkto sa PCR mao ang importante alang sa in situ nga pagsukod sa mga sample sa tubig.Ang usa ka bug-os nga awtomatiko nga solusyon alang sa viral load maayo.
Ang pagpasa sa waterborne virus nailhan nga usa ka peligro sa panglawas sa publiko sukad sa 1940s, uban ang unang ebidensya sa waterborne transmission sa polio ug hepatitis E1.Giklasipikar sa World Health Organization (WHO) ang pipila ka mga viral pathogen nga dala sa tubig nga kasarangan ngadto sa taas nga kahulogan sa panglawas2. Tradisyonal nga virus Ang mga pamaagi sa pag-detect nagsalig sa gold-standard nga qPCR-based nga mga teknik, nga sensitibo kaayo ug espesipiko, apan nagkinahanglan ug hanas nga mga personahe sa pagsulay sa laboratoryo gamit ang mahal nga mga instrumento.Apan, sa ubos ug tunga-tunga nga kita nga mga nasud (LMICs) nga adunay limitado nga mga kapanguhaan, ang tawo ang sample testing lagmit nga mag-una kay sa environmental water sample monitoring.Busa, ang alternatibong ubos nga gasto nga mga pamaagi gikinahanglan alang sa malungtaron, real-time nga pag-monitor sa tubig ug wastewater sample sa ubos ug tunga-tunga nga kita nga mga nasud isip sayo nga mga pasidaan sa mga emerging disease outbreaks, sa ingon mapanalipdan sila gikan sa grabe nga socioeconomic nga epekto sa pandemya sa virus. Ang mubu nga mga electrochemical biosensors alang sa mga nucleic acid makahatag usa ka maayong potensyal nga solusyon sa kini nga wala matubag nga panginahanglan. Daghan niini nga mga biosensor sa DNA nagtrabaho pinaagi sa kamatuoran nga ang mga komplementaryong strand sa DNA dili molihok sa electrode ibabaw ug pag-hybridize kon ang usa ka matching sequence anaa sa sample.Kini mahimo unya nga makabig ngadto sa usa ka signal pinaagi sa lain-laing mga electrochemical teknik gamit ang redox mediators sama sa potassium iron/ferrocyanide.Methylene blue (MB) mao ang usa ka redox-aktibong molekula, nga adunay Gikataho nga nag-intercalate ngadto sa double-stranded DNA (dsDNA) dugang pa sa iyang mas nonspecific binding sa single-stranded DNA5,6. sensor configurations5,6,7,8,9.Bisan tuod ang intercalation sa MB ngadto sa DNA mao ang nonspecific, ug ang specificity niini nga electrochemical sensor nagdepende sa kadaghanan sa kaputli sa mga primers nga gigamit alang sa PCR o isothermal amplification, kini maayo nga haum alang sa pagpatuman sa tinuod. -oras nga electrochemical-based qPCR o fluorescence isothermal amplification isip alternatibo sa pagsukod sa konsentrasyon sa DNA 9 .Sa usa sa maong pagpatuman, Won et al.Ang nawong sa bulawan nga mga electrodes giusab sa 6-mercapto-1-hexanol (MCH) alang sa tinuod nga panahon pagsukod sa PCR amplicons nga adunay MB gamit ang differential pulse voltammetry (DPV)9.Sa ubang mga kaso, Ramirez et al.Detection sa SARS-CoV-2 sa wastewater pinaagi sa RT-LAMP reaction gamit ang MB nga adunay screen-printed electrodes.Platinum electrodes usab gigamit ingon nga in situ electrodes sa usa ka microfluidic PCR plataporma gidisenyo sa electrochemically detect amplicons sa panahon sa mga reaksyon 8 .Ang tanan niini nga mga pagtuon nagkinahanglan nawong kausaban sa mga electrodes, nagpasabot sa dugang nga produksyon ug operating gasto tungod sa espesyal nga storage kinahanglanon alang sa kalig-on niini nga mga functionalized electrodes.
Schematic sa workflow alang sa electrochemical detection sa mga amplicons nga nakuha gikan sa concentrated viral particles sa lake water samples.
Bag-ohay lang nga gipakita namon ang electrochemical sensing sa mga SARS-CoV-2 amplicons nga adunay mubu nga giimprinta nga circuit board (PCB) nga mga electrodes nga gibase sa DPV ug cyclic voltammetry (CV) nga naaghat sa adsorption sa MB-DNA complexes sa nawong sa wala gibag-o nga mga electrodes) mga pagbag-o sa peak. kasamtangan11.Gi-report namo nga ang mas taas nga mga tipik sa DNA (N1-N2, \({943}\, \hbox) nga naporma gamit ang girekomendar sa CDC nga N1 forward ug N2 reverse primers kumpara sa mas mugbo nga mga tipik {bp}\)) nagpakita og mas maayo nga linearity sa sensor response (N1, \(72\,\hbox {bp}\)) naumol gamit ang N1 forward ug N1 reverse primer sets.Kini nga mga pagtuon gitaho gamit ang DNA dilutions nga giandam sa nuclease-free nga tubig.Ang plataporma gigamit usab sa pag-detect sa SARS-CoV -2 amplicons sa simulated wastewater samples (nakuha pinaagi sa spiking total RNA samples uban sa SARS-CoV-2 RNA) .Tungod kay ang RNA delikado sa paggunting sa panahon sa isolation ug downstream processing,12,13 lisud ang pagpadako sa mas taas nga mga tipik niining heterogeneous sample. Busa, ang pagpakita sa electrochemical sensing sa SARS-CoV-2 amplicon sa wastewater limitado sa mas mubo nga \(72\,\hbox {bp}\) N1 fragment.
Niini nga trabaho, among gisusi ang posibilidad sa ENIG PCB-based electrochemical sensing sa phage Phi6 concentrated ug isolate gikan sa lake water samples (Fig. 1). Ang Phi6 phages ikatandi sa gidak-on (80-100 nm) sa SARS-CoV-2 ug adunay usab usa ka lipid membrane ug usa ka spike protein.Tungod niini nga mga hinungdan, ang bacteriophage Phi6 usa ka sikat nga surrogate para sa SARS-CoV-2 ug uban pang mga enveloped pathogenic RNA virus14,15.Ang RNA nga nahimulag gikan sa mga partikulo sa phage gigamit ingon usa ka template alang sa cDNA synthesis nga gisundan sa PCR aron makakuha og duha ka mga tipik sa DNA nga 117 ug 503 nga base nga mga parisan ang gitas-on. Tungod sa hagit sa pagpadako sa \(943\,\hbox {bp}\) N1-N2 nga mga tipik sa among miaging trabaho, among gitarget ang mga intermediate nga gitas-on nga mga tipik (\(117 \,\hbox {bp}\) ug \(503 \,\hbox {bp}\)), base sa magamit nga mga primer. \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) ngadto sa \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) Para sa duha ka tipik sa ang presensya sa MB, ang epekto sa asin sa tubag sa sensor gihulagway ug gi-cross-validated pinaagi sa spectrophotometric measurements.Ang mga nag-unang kontribusyon niini nga trabaho mao ang mosunod:
Ang gitas-on sa tipik sa DNA ug ang presensya sa asin sa sample kusog nga makaapekto sa pagkasensitibo.Gipakita sa among mga resulta nga ang kalihokan sa electrochemical nagdepende sa lainlaing mga mekanismo sa interaksyon sa MB, DNA, ug sensor sa tubag sa voltammetric, depende sa konsentrasyon ug gitas-on sa DNA, nga adunay mas taas nga mga Fragment nga nagpakita sa mas taas nga pagkasensitibo, bisan kung ang asin adunay negatibo nga epekto sa mga interaksyon sa electrostatic tali sa. MB ug DNA.
Ang konsentrasyon sa DNA nagtino sa mekanismo sa interaksyon sa MB-DNA sa wala mausab nga mga electrodes Gipakita namo nga ang lain-laing mga mekanismo sa interaksyon sa MB-DNA nagdepende sa konsentrasyon sa DNA. Sa mga konsentrasyon sa DNA ubos sa gamay nga kantidad sa \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), among naobserbahan nga ang electrochemical kasamtangan nga tubag nag-una nga gitino pinaagi sa adsorption sa MB-DNA sa electrode, samtang sa ubos nga konsentrasyon Sa taas nga DNA konsentrasyon, ang electrochemical kasamtangan nga tubag gitino pinaagi sa steric pagdili sa redox kalihokan tungod sa pagsal-ot sa MB tali sa mga pares sa base sa DNA.
ENIG PCB-Based Electrochemical Sensing sa Viral Nucleic Acids sa Lake Water Samples Ang mga obserbasyon gi-validate pinaagi sa electrochemical detection sa Phi6-added \(503\,\hbox {bp}\) DNA fragments nga nakuha gikan sa mga sample sa tubig gikan sa Powai Lake, IIT Mumbai Campus Resulta phage.
Ubos nga gasto sa pagpatuman ug potensyal alang sa pag-integrate sa hingpit nga awtomatiko nga mga sistema sa pag-monitor, oligonucleotides o aptamer sa mga electrodes nga adunay mas taas nga kinabuhi sa estante.
Ang Phage Phi6 kay usa ka enveloped dsRNA virus sa pamilyang Cytoviridae nga nag-infect sa Pseudomonas syringae.Ang genome sa Phi6 phage anaa sa porma sa 3 ka tipik: S (\(2.95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4.07) \,\hbox {Kb}\)) ug L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\)) 16,17. Tungod kay ang Phi6 phage maka-infect sa usa ka non-pathogenic nga BSL-1 Pseudomonas strain, kini luwas nga gamiton ug dali nga matubo sa laboratoryo.Ang Phage Phi6 ug ang host niini nga Pseudomonas syringae gipalit gikan sa Felix d'Herelle Reference Center for Bacterial Viruses, Laval University, Canada (ang reference center catalog numbers mao ang HER-102 ug HER-1102, matag usa) .Ang Phi6 phage ug ang host niini gibuhi pag-usab sumala sa gimando sa reference center.Phage Phi6 giputli pinaagi sa plate lysis ug elution aron makakuha og final titers nga adunay \(\mga 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { ml}}\) (plaque forming units/ milliliters).Nahimulag ang RNA gikan sa giputli nga mga partikulo sa phage gamit ang GenElute™ Universal Total RNA Purification Kit (Sigma-Aldrich) sumala sa instruksyon sa tiggama.Sa mubo, usa ka purified phage Phi6 suspension\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) gi-lysed ug ang lysate gikarga sa usa ka spin column aron tugotan ang RNA nga makagapos sa resin column .Ang RNA dayon i-eluted sa elution solution \({ 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) nga gihatag sa kit.Bantaya ang konsentrasyon sa RNA pinaagi sa pagsuyop sa \(260\,\hbox {nm}\).RNA gitipigan sa aliquots sa \ ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) hangtod sa dugang nga paggamit.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) Ang iScript cDNA Synthesis Kit (Bio -Rad Laboratories) gigamit isip usa ka template alang sa cDNA synthesis nga nagsunod sa mga instruksyon sa tiggama. Sa mubo, ang usa ka cDNA synthesis reaction naglangkob sa 3 ka lakang: priming sa \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min} }\) , reverse transcription sa \({20}\,{\hbox {min}}\) sa \({46}\,{^{\circ }\hbox {C}}\), ug balihon Ang recorder anaa sa \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) para sa \({1}\,{\hbox {min }}\).Sa diha nga nagdagan sa usa ka 1% agarose gel, ang cDNA nagpakita sa tulo ka mga banda nga katumbas sa gipaabot nga tulo ka RNA fragment (data wala gipakita). gamit ang cDNA isip template para sa PCR sa miniPCR® mini8 thermal cycler:
Ang mga primer para sa \(117\,\hbox {bp}\) ug \(503\,\hbox {bp}\) katumbas sa 1476-1575 nucleotides sa M segment ug 458-943 nucleotides sa L segment, matag acid .Ang tanan nga amplified PCR nga mga produkto kay electrophoresed sa 1% agarose gels, ug amplified target DNA giputli gamit ang GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Fisher Scientific).
Usa ka linaw sa kampus sa IIT Mumbai (Powai Lake, Powai, Mumbai) gigamit sa pagdugang sa mga partikulo sa phage. Ang tubig sa linaw gisala pinaagi sa usa ka \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) lamad aron makuha gisuspinde nga mga partikulo, ug dayon gidugang ang Phi6 phage. Idugang ang \({1}\,{\hbox {ml}}\) sa \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} \) ngadto sa \( {100}\ ,{\hbox {ml}}\) sinala nga tubig sa lanaw, sa \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\).Usa ka gamay nga aliquot kay gitagana alang sa pagsukod sa viral load pinaagi sa plaque assay.Among gisulayan ang duha ka lain-laing mga pamaagi sa pagkonsentrar sa mga spiked nga Phi6 nga mga partikulo sa virus: (1) ang aluminum hydroxide adsorption-precipitation method,19 nga gi-validate para sa konsentrasyon sa daghang mga enveloped RNA virus gikan sa environmental samples, ug (2) ) Ang polyethylene glycol (PEG)-based nga paagi sa konsentrasyon sa virus gipahaom gikan sa Flood et al.20 .Tungod kay ang pagkaayo sa pagkaayo sa pamaagi nga nakabase sa PEG nakit-an nga mas maayo kaysa sa pamaagi sa aluminyo hydroxide, ang pamaagi nga nakabase sa PEG gigamit aron makonsentrar ang mga partikulo sa Phi6 gikan sa mga sample sa tubig sa linaw.
Ang pamaagi sa PEG nga gigamit mao ang mosunod: Ang PEG 8000 ug \(\hbox {NaCl}\) gidugang sa Phi6-spike nga mga sampol sa tubig sa lake aron makakuha og 8 % PEG 8000 ug \(0.2\,\hbox {M} \) \( \ hbox {NaCl}\).Ang mga sample gipalumlom sa usa ka shaker\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), unya i-centrifuge sa \(4700 \,\hbox {g}\) kay \({45}\,{\hbox {min}}\).Isalikway ang supernatant ug i-resuspend ang pellet sa \({1}\, {\hbox {ml}}\) sa parehas nga supernatant.Ang tanan nga spiking ug mga eksperimento sa konsentrasyon sa virus gihimo sa triplicate.Pagkahuman sa konsentrasyon, usa ka gamay nga aliquot ang gitagana alang sa pagsukod sa pagkaayo sa pagkaayo pinaagi sa pag-assay sa plake.Ang RNA gilain sama sa gihulagway kaniadto ug gi-eluted sa kit-supplied elution buffer\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\).Tungod kay ang RNA concentration managlahi gikan sa sample ngadto sa sample sa triplicate, ang \({2}\,{\upmu \ hbox {l}}\) sa RNA kay gigamit para sa tanang tulo walay sapayan sa iyang konsentrasyon cDNA synthesis sa mga sample.cDNA synthesis gihimo sama sa gihulagway kaniadto.\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNA gigamit isip template para sa \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR para sa 35 ka cycle aron mapadako ang \ (117\,\hbox {bp}\) ug \(503\,\hbox { bp}\) mga tipik.Kini nga mga sampol girepresentahan nga “1:1″, ie walay dilution. Usa ka no-template control (NTC) ang gipahimutang isip negatibo nga kontrol, samtang ang usa ka cDNA nga gi-synthesize gamit ang RNA nga nahimulag gikan sa purified phage gipahimutang. isip usa ka template alang sa usa ka positibo nga kontrol (PC). Ang quantitative PCR (qPCR) gihimo sa usa ka Stratagene Mx3000P RT-PCR instrument gamit ang Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies). Ang mga reaksyon gi-set up sa triplicate sama sa kaniadto. gihulagway.Ang cycle threshold (Ct) natala alang sa tanan nga mga sample.Dugang pa, ang lasaw nga mga sample mao ang \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) gamit ang cDNA nga lasaw 1:100 sa sinala nga tubig sa linaw ingon \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR para sa 35 ka cycle. Kini nga mga sample girepresentahan isip “1:100″.
Ang mga electrodes sa PCB gihimo gamit ang usa ka barato nga gasto nga Electroless Nickel Immersion Gold (ENIG) nga proseso nga wala kinahanglana ang dugang nga plating nga bulawan. Ang mga detalye sa ENIG PCB electrode detalyado sa among miaging trabaho11. Alang sa ENIG PCB electrodes, tradisyonal nga pamaagi sa paglimpyo sa electrode sama sa Ang piranha solution o sulfuric acid cyclic voltammetry dili girekomenda tungod kay kini mahimong hinungdan sa pagpanit sa nipis nga layer sa bulawan (gibag-on \(\approx\) \(100\,\hbox {nm }\)) ug ibutyag ang nagpahiping mga lut-od sa tumbaga nga dali ngadto sa corrosion 21, 22, 23, 24, 25.Busa, limpyohi ang mga electrodes gamit ang lint-free nga panapton nga gibasa sa IPA. }\) MB sa \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) para sa sayon nga pagsal-ot.Sa among miaging trabaho , among naobserbahan nga ang sensitivity ug linearity sa sensor gipauswag pinaagi sa pagdugang sa MB nga konsentrasyon 11 .Base sa mga optimization nga gitaho sa among naunang trabaho, among gigamit ang \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB konsentrasyon sa pag-embed sa DNA niini nga pagtuon.Ang electrochemical detection sa double-stranded DNA (ds-DNA) mahimong makab-ot gamit ang anionic o cationic intercalators.Bisan tuod ang anionic intercalators nakamatikod sa DNA nga adunay mas maayong selectivity, nagkinahanglan sila og overnight incubation, nga moresulta sa mas taas nga oras sa detection.On sa laing bahin, ang cationic intercalators sama sa MB nagkinahanglan og mas mubo nga mga panahon sa paglumlum, gibana-bana nga \({1}\,{\ hbox {h}}\) alang sa electrochemical detection sa ds-DNA6.Ang matag pagsukod naglakip sa paghatag sa sample nga sulayan sa electrode\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), dayon limpyo gamit ang IPA-moistened nga trapo, sa dili pa mopadayon sa laing sample.usa ka sukod.Ang matag sample gisulayan sa 5 ka lain-laing mga electrodes gawas kon ipahayag.DPV ug CV pagsukod gihimo gamit ang usa ka PalmSens Sensit Smart potentiostat, ug PSTrace software gigamit alang sa potentiostat configuration ug data acquisition, lakip na ang peak kasamtangan nga kalkulasyon.Ang mosunod nga mga setting gigamit para sa mga pagsukod sa DPV ug CV:
DPV: Equilibrium Time = \(8\,\hbox {s}\), Boltahe Lakang = \(3\,\hbox {mV}\), Pulse Boltahe = \(25\,\hbox {mV}\), gidugayon sa pulso = \(50\,\hbox {ms}\), scan rate = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: Equilibrium Time = \(8\,\hbox {s}\), Boltahe nga Lakang = \(3\,\hbox {mV}\), Sweep Rate = \({300}\,\hbox {mV/s }\)
Peak nga mga sulog nga nakuha gikan sa mga voltammograms sa DNA nga gikomplikado sa \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
DPV ug CV voltammograms nakuha sa ENIG PCB electrodes \({50}\,{\ upmu \hbox {M}}\) MB complexed uban sa DNA (sa konsentrasyon sa 10-\({20}\,{\ hbox {ng }/{\upmu \hbox {l}}}\) ie 0.13–\({0.26}\,{\upmu \hbox {M}}\) para sa \(117\,\hbox {bp}\ ) ug 0.03 –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) para sa \(503\,\hbox {bp}\)).Representative voltammograms gipakita sa Figure S1 sa Supplementary Information.Figure 2 nagpakita sa mga resulta sa DPV ug CV measurements (peak current) gamit ang gel-purified PCR nga mga produkto.Kon itandi sa CV measurements, ang DPV measurements nagpakita sa mas taas nga sensitivity (karon isip function sa DNA concentration) tungod kay ang background capacitive currents sa CV measurements nagtago sa Faradaic nga mga sulog 26 .Ang datos alang sa matag kahon sa boxplot adunay mga sukod gikan sa 5 nga mga electrodes. Ang tanan nga mga pagsukod naggamit sa parehas nga set sa mga electrodes aron malikayan ang mga sayup sa pagsukod tungod sa pagkalainlain sa electrode-to-electrode. Naobserbahan namon ang pagtaas sa us aka us aka us aka us aka us aka us aka us aka us aka us aka us aka us aka us aka us aka us aka us aka us aka us aka us aka us aka us aka usbaw sa DPV ug CV , mas taas (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ kumpara sa \(117) ) fragment.Kini nahiuyon sa gipaabot nga uso sa electrode adsorption nga gitaho sa among miaging trabaho.Ang adsorption sa MB-DNA complex nagpadali sa pagbalhin sa singil sa electrode, nga nakatampo sa pagsaka sa peak current.Ang ubang mga pagtuon nagpakita sa epekto sa oligonucleotide size ug sequence sa MB-DNA intercalation27,28,29,30.Ang guanine -cytosine (GC) sulod sa duha ka amplicons (\(117\,\hbox {bp}\) ug \(503\,\hbox {bp}\)) gibana-bana nga 50%, nga nagpakita nga ang obserbasyon Ang kalainan kay tungod ngadto sa gitas-on sa amplicon.Apan, alang sa mas taas nga konsentrasyon sa DNA (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), para sa \(503\,\hbox {bp} \) ug \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) para sa \(117\,\hbox {bp}\)), among nakita ang duha ka amplification Ang Ang peak nga mga sulog sa mga subs gipakunhod sa duha nga mga pagsukod sa DPV ug CV. Kini tungod kay ang MB saturates ug intercalates tali sa base nga mga parisan sa DNA, nga miresulta sa steric nga pagdili sa redox nga kalihokan sa reducible nga grupo sa MB31,32.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
Ang mga asin nga anaa sa PCR master mixes makabalda sa electrostatic interaction tali sa MB ug DNA, busa pinaagi sa pagdugang sa \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) uban sa \({50} \,{\ upmu \hbox {M}}\) MB gel-purified nga produkto aron tun-an ang epekto sa asin sa MB-DNA interaction.Sama sa gipakita sa Figure 3, among naobserbahan nga para sa mas taas nga DNA concentrations (\(>{2}\,{\ hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) ug \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) para sa \(117\,\hbox {bp} \)), sa DPV ug CV Ang pagdugang sa asin wala kaayo makaapekto sa mga sukod (tan-awa ang Figure S2 sa Supplementary Information para sa representatibo nga voltammograms). ubos nga mga konsentrasyon sa DNA, ang pagdugang sa asin makapakunhod pag-ayo sa pagkasensitibo, nga miresulta sa walay mahinungdanon nga pagbag-o sa kasamtangan nga adunay konsentrasyon sa DNA. Susama nga negatibo nga mga epekto sa asin sa mga interaksyon sa MB-DNA ug intercalation kaniadto gitaho sa ubang mga tigdukiduki33,34.\(\hbox { Ang Mg}^{2+}\) nga mga cation naggapos sa negatibong phosphate backbone sa DNA, sa ingon nakababag sa electrostatic interaction tali sa MB ug DNA. dili kaayo makaapekto sa tubag sa sensor. Ang importante nga punto mao nga kini nga biosensor mas haum sa pag-ila sa mas taas nga konsentrasyon sa DNA (panagsa ra \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) o mas taas pa), para sa bug-os- Awtomatiko nga pagproseso sa mga sample sa tubig sa palibot, diin ang pagputli sa gel sa mga produkto sa PCR mahimong dili mahimo.
Lugar ubos sa absorption curve para sa wavelength range 600–700 \(\hbox {nm}\) para sa lain-laing konsentrasyon sa DNA nga gikomplikado sa \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) nga adunay asin ug walay asin (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) nga adunay asin ug walay asin (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) Mga konsentrasyon sa DNA nga katumbas sa \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB nga mga sample Walay DNA.
Aron mas mapamatud-an pa ang mga resulta sa ibabaw, gihimo namo ang optical measurements gamit ang UV/Vis spectrophotometer (Thermo Scientific Multiskan GO), ang mga sample \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) gigamit para sa matag Pagsukod.Ang pagsuyup pirma mikunhod uban sa pagdugang sa DNA konsentrasyon, ingon sa makita gikan sa trend sa dapit ubos sa pagsuyup curve alang sa wavelength range \(600\,\hbox {nm}\) ngadto sa \(700\,\hbox { nm}\) , sama sa gipakita sa Fig. 4 (absorption spectrum nga gipakita sa Fig. S3 sa Supplementary Information). {l}}}\), walay mahinungdanong kalainan sa uptake tali sa DNA-containing ug MB-only samples (para sa \(503\,\hbox {bp}\) ug \(117\,\hbox {bp}\ ) mga tipik sa gitas-on), nga nagpaila sa pagkawala sa steric nga pagsumpo sa redox-aktibo nga MB. Sa mas taas nga mga konsentrasyon sa DNA, among naobserbahan ang anam-anam nga pagkunhod sa absorbance signal ug namatikdan ang usa ka gamay nga pagkunhod sa absorbance sa presensya sa asin. Kini nga mga resulta gipahinungod sa molekular interaksyon ug steric inhibition uban sa base stacking sa DNA hybrids.Ang among mga resulta nahiuyon sa mga taho sa literatura sa spectroscopic nga mga pagtuon sa MB-DNA intercalation nga nag-asoy sa hypochromaticity sa pagkunhod sa lebel sa enerhiya sa \(\pi\)-\(\pi ^*\ ) elektronikong transisyon tungod sa intercalation Layers 36, 37, 38.
Agarose gel electrophoresis sa phage Phi6: Mga produkto sa PCR sa gitas-on \(117\,\hbox {bp}\) ug \(503\,\hbox {bp}\) gikan sa mga sample sa tubig sa linaw.M-DNA marker;NTC-no-template control, primers nga adunay katugbang nga mga amplicon;Positibo nga pagkontrol sa PC;1, 2, 3-undiluted (1:1) spiked lake water samples sa triplicate.Usa ka banda ang makita sa \(\mga 50\,\hbox {bp}\) tungod sa wala magamit nga oligonucleotides sa \(503\,\ hbox {bp}\) lane.
Among gi-evaluate ang gamit sa sensor gamit ang Powai Lake water samples nga may spiked Phi6 phage. ml}}\), samtang kadtong nahimulag gikan sa purified phage suspensions Ang RNA gibanabana nga \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) nga adunay recovery efficiency nga gibana-bana nga 1 Ang %.RNA gibalikbalik nga gi-transcribe ngadto sa cDNA ug gigamit isip template alang sa PCR ug qPCR. Ang gidak-on sa produkto gipamatud-an pinaagi sa agarose gel electrophoresis (Figure 5) sa wala pa ang pagsulay sa sensor. Kini nga mga sample dili giputli sa gel ug busa adunay tanan nga mga sangkap sa PCR isip ingon man usab ang mga amplicon sa interes.Ang mga kantidad sa Ct nga natala sa panahon sa qPCR (Table 1) gipakita nga adunay kalabotan sa konsentrasyon sa RNA nga nahimulag gikan sa katugbang nga mga spiked nga sample sa tubig. Ang kantidad sa Ct nagpadayag sa gidaghanon sa mga siklo nga gikinahanglan alang sa fluorescent signal sa molapas sa threshold o background signal. Ang mas taas nga Ct values nagpaila sa ubos nga template concentrations ug vice versa. Ang Ct values sa NTC samples kay taas sa gipaabot. ang positibo nga kontrol ug ang sample sa pagsulay dugang nga nagpakita nga ang matag sample sa pagsulay adunay gibana-bana nga 1% nga template kumpara sa positibo nga kontrol.Atong gihisgutan kaniadto nga ang mas taas nga mga amplicons mosangpot sa mas maayo nga pagkasensitibo. sa ubos nga viral concentration ug RNA degradation.Apan, uban sa among virus enrichment ug PCR amplification protocol, kami nakahimo sa malampuson nga pagpadako sa \(503\,\hbox {bp}\) fragment para sa electrochemical sensing.
Ang Figure 6 nagpakita sa mga resulta sa electrochemical sensor sa \(503\,\hbox {bp}\) fragment amplicon, pareho nga naggamit sa undiluted cDNA isip template (1:1) ug 100-fold diluted cDNA isip template (1:100 ) nga gihimo PCR , kon itandi sa NTC ug PC (tan-awa ang Figure S4 sa Supplementary Information para sa representatibo nga voltammograms). Ang matag kahon sa boxplot sa Figure 6 adunay mga sukod gikan sa tulo ka sample sa 5 electrodes. -sa-electrode variation.Kon itandi sa CV measurements, DPV measurements nagpakita sa mas maayo nga resolusyon sa pag-ila sa pagsulay ug PC samples gikan sa NTCs tungod kay, sama sa nahisgotan na, ang Faradaic nga mga sulog gitago tungod sa background capacitive nga mga sulog sa naulahi. Alang sa mas taas nga mga amplicon, among naobserbahan ang negatibo nga kontrol (NTC) miresulta sa mas taas nga CV ug DPV peak currents kalabot sa positibo nga kontrol, samtang ang positibo ug undiluted test sample nagpakita sa susamang peak heights sa DPV peak currents. ) test sample ug PC mahimong tin-aw nga masulbad gikan sa sensor output alang sa NTC sample, samtang ang resolusyon alang sa 1:100 lasaw sample mao ang dili kaayo paglitok. (mga lane nga wala gipakita sa Figure 5), ug ang katugbang nga DPV ug CV peak nga mga sulog susama sa gipaabot sa NTC. Ang mga resulta alang sa \(117\,\hbox {bp}\) nga tipik gipakita sa Supplementary Information.Ang negatibo Ang kontrol nag-aghat sa usa ka electrochemical nga tubag gikan sa PCB sensor tungod sa adsorption sa libre nga MB sa electrode ug ang interaksyon sa MB sa single-stranded primer oligonucleotide. peak current sa test sample kumpara sa peak current nga nakuha sa negatibong kontrol para makab-ot ang differential (relative) measurement39,40 aron maklasipikar ang test sample isip positibo o negatibo.
(a) DPV, ug (b) CV peak nga kasamtangan alang sa electrochemical detection sa \(503\,\hbox {bp}\) mga tipik sa mga sampol sa tubig sa linaw. Ang mga sample sa pagsulay gisukod sa triplicate ug itandi sa walay template controls (NTC) ug positibo nga kontrol (PC).
Ang among mga nahibal-an nag-ilustrar sa lain-laing mga mekanismo nga naka-apekto sa performance sa electrochemical sensors alang sa mga amplicons sa lain-laing mga gitas-on alang sa lain-laing mga DNAs, uban sa mga konsentrasyon nga gipamatud-an pinaagi sa optical measurements gamit ang UV/Vis spectrophotometer. Ang among mga obserbasyon nagpasiugda sa panabut nga mas taas nga mga tipik sa DNA hangtod sa \(\approx\) Ang \(500\,\hbox {bp}\) mahimong makit-an nga adunay mas taas nga pagkasensitibo ug nga ang presensya sa asin sa sample dili Sensitivity DNA nga konsentrasyon nga makaapekto sa mas taas nga pagkasensitibo (panagsa ra \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) ug sa ibabaw).Dugang pa, among gisusi ang epekto sa lain-laing mga matang sa mga sample, lakip na ang gel-purified amplicons nga adunay ug walay dugang nga asin, ug pagdugang sa mga sample sa tubig sa linaw sa DPV ug CV measurements.Among naobserbahan nga ang DPV naghatag ug mas maayong resolusyon, tungod kay ang background capacitive current makaapekto usab sa pagsukod sa CV, nga naghimo niini nga dili kaayo sensitibo.
Ang pagpadako sa mas taas nga mga tipik nagdepende sa integridad sa viral genomic RNA. Gipakita sa daghang mga pagtuon nga ang pagpadako sa mas taas nga mga tipik dili kanunay nga episyente tungod sa pagkadaot sa RNA sa palibot ug ang potensyal alang sa splicing sa panahon sa pagkalain11,41,42,43,44 .Among naobserbahan nga ang PEG-based virus concentration method mas epektibo sa pag-concentrate sa phage Phi-6 spiked sa lake water samples kay sa aluminum hydroxide-based virus concentration method. aron mapadako ang daghang mas mugbo nga gitas-on nga mga templates ug makunhuran ang posibilidad sa cross-specificity.
Nihit ang biyolohikal nga mga sampol, mao nga gikinahanglan ang pagdesinyo ug biosensor nga nagkinahanglan ug dyutay nga mga sampol alang sa pagsulay. Ang ENIG PCB electrodes nga gigamit niini nga pagtuon nagkinahanglan lamang og \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ ) mga sample alang sa pagsulay aron matabonan ang epektibo nga lugar sa mga electrodes.Dugang pa, ang parehas nga electrode mahimong magamit pag-usab pagkahuman sa paglimpyo sa wala pa ihatag ang sunod nga sample.Ang mga amplified sample wala magkinahanglan dugang nga bisan unsang mga kemikal gawas sa methylene blue, nga usa ka barato ug kasagarang gigamit nga kemikal.Tungod kay ang matag electrode nagkantidad ug mga $0.55 (o INR 40) sa paghimo, kini nga biosensor mahimong usa ka cost-effective nga alternatibo sa kasamtangan nga mga teknolohiya sa detection.Table 2 nagpakita sa pagtandi niini nga trabaho sa ubang mga sensor nga gitaho sa literatura sa dugay nga panahon. Mga tipik sa DNA sa heterogeneous nga mga sample.
Tungod kay ang MB-based electrochemical detection protocols nagsalig sa espesipiko sa PCR, ang usa ka mayor nga limitasyon niini nga pamaagi mao ang potensyal alang sa non-specific amplification sa heterogeneous samples sama sa wastewater ug tubig sa linaw o paggamit sa low-purity primers. electrochemical detection method for DNA detection of unpurified PCR products using unmodified ENIG PCB electrodes, gikinahanglan nga mas masabtan ang mga sayop nga gipaila sa wala magamit nga dNTPs ug primers, ug aron ma-optimize ang reaction condition ug assay protocols.Dugang physicochemical parameters sama sa pH, temperature, ug biological Ang panginahanglan sa oxygen (BOD) sa sample sa tubig mahimo usab nga kinahanglan nga sukdon aron mapauswag ang katukma sa pagsukod.
Sa konklusyon, among gisugyot ang usa ka ubos nga gasto nga electrochemical ENIG PCB sensor alang sa pag-detect sa virus sa mga sample sa kalikopan (tubig sa linaw). mga electrodes nga adunay mas taas nga kinabuhi sa estante ug walay piho nga mga kinahanglanon sa pagtipig ug busa angay alang sa pagpalambo sa mga solusyon sa pagsukod nga adunay automated sample nga pagproseso nga gipakatap sa LMICs.Ang biosensor naggamit sa barato nga DNA-intercalating redox dyes (MB) alang sa paspas nga pag-ila sa target nga mga amplicon.Ang nonspecific amplification komon sa mga sample sa kalikopan nagpamenos sa espesipiko niini nga pamaagi sa sensing tungod sa nonspecific nga pagbugkos sa MBs ngadto sa single- ug double-stranded oligonucleotides.Busa, ang espesipiko niini nga pagsulay nagdepende sa pag-optimize sa mga primer ug PCR nga mga kondisyon sa reaksyon. Dugang pa, ang CV ug DPV peak nga mga sulog nga nakuha gikan sa gisulayan nga mga sampol kinahanglan nga hubaron nga may kalabotan sa mga tubag nga nakuha gikan sa negatibo nga kontrol (NTC) alang sa matag pagsulay. -solusyon sa gasto nga makakolekta ug maka-analisar sa mga sampol ug wireless nga magpadala sa mga resulta balik sa laboratoryo.
Cashdollar, J. & Wymer, L. Mga pamaagi alang sa inisyal nga konsentrasyon sa mga virus gikan sa mga sample sa tubig: usa ka pagrepaso ug meta-analysis sa bag-ong mga pagtuon.J.Application.microorganism.115, pp. 1-11 (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL Mga virus nga dala sa tubig: Mga babag sa luwas nga tubig nga mainom.PLoS Pathogens.11, E1004867 (2015).
Shrestha, S. et al.Wastewater epidemiology para sa cost-effective nga dako nga surveillance sa COVID-19 sa ubos ug tunga-tunga nga kita nga mga nasud: mga hagit ug oportunidad.Water 13, 2897 (2021).
Palecek, E. & Bartosik, M. Nucleic acid electrochemistry.Chemical.Rev.112, 3427–3481 (2012).
Tani, A., Thomson, AJ & Butt, JN Methylene blue isip usa ka electrochemical discriminator sa single- ug double-stranded oligonucleotides nga wala mapalihok sa bulawan nga substrates.Analyst 126, 1756-1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ Pagtandi sa Cation ug Anion Intercalators alang sa Electrochemical Transduction sa DNA Hybridization pinaagi sa Long-Range Electron Transfer.Electrochemistry.comminicate.6, 648-654 (2004).
Wong, EL & Gooding, JJ Pagbalhin sa bayad pinaagi sa DNA: usa ka pinili nga electrochemical DNA biosensor.anus.Chemical.78, 2138–2144 (2006).
Fang, TH et al.Real-time nga PCR microfluidic device nga adunay dungan nga electrochemical detection.biological sensor.Bioelectronics.24, 2131–2136 (2009).
Win, BY et al.Pagtuon sa mekanismo sa pagsenyas ug pag-verify sa performance sa usa ka electrochemical real-time nga PCR system base sa interaksyon sa methylene blue sa DNA.Analyst 136, 1573-1579 (2011).
Ramirez-Chavarria, RG et al.Loop-mediated isothermal amplification-based electrochemical sensor para sa detection sa sars-cov-2 sa wastewater samples.J.Environment.Chemical.Britain.10, 107488 (2022).
Kumar, M. et al.Electrochemical sensing sa SARS-CoV-2 amplicons nga adunay PCB electrodes.Gi-activate ang sensor.B Chemistry.343, 130169 (2021).
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. & Yoshida, H. Episyente nga pagkakita sa SARS-CoV-2 RNA sa solidong tipik sa wastewater.science.general environment.763, 144587 (2021).
Alygizakis, N. et al.Analytical Methods for SARS-CoV-2 Detection in Wastewater: Protocol and Future Perspectives.TraC trending anal.Chemical.134, 116125 (2020).
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. & Kashtan, N. Survival sa enveloped bacteriophage Phi6 (usa ka surrogate alang sa SARS-CoV-2) sa evaporated laway droplets nga gideposito sa glass surfaces.science.Rep.10, 1–10 (2020).
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ Ang pagpadayon sa kinaiyahan sa usa ka surrogate sa SARS-CoV-2 (Phi6) sa libre nga buhi nga amoeba.J.Panglawas sa Tubig 20, 83 (2021).
Mindich, L. Tukma nga pagputos sa tulo ka genomic fragment sa double-stranded RNA bacteriophage\(\varphi\)6.microorganism.Moore.biology.Rev.63, 149–160 (1999).
Pirttimaa, MJ & Bamford, Secondary structure sa DH RNA phage\(\varphi\)6 packaging region.RNA 6, 880–889 (2000).
Bonilla, N. et al.Phages on the Tap - Usa ka paspas ug episyente nga protocol alang sa pag-andam sa laboratoryo nga mga stock sa bacteriophages.PeerJ 4, e2261 (2016).
Panahon sa pag-post: Mayo-27-2022